一种动物双歧杆菌乳亚种菌株GOLDGUT-BB69及用途的制作方法

一种动物双歧杆菌乳亚种菌株goldgut-bb69及用途
技术领域
1.本发明涉及微生物领域，具体涉及一种动物双歧杆菌乳亚种菌株goldgut-bb69及用途。


背景技术：

2.炎症性肠病(inflammatory bowel disease，ibd)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)和克罗恩病(crohn’s disease，cd)，是由多种功能失调的免疫反应介导的慢性胃肠道疾病，是环境、遗传和免疫调节等因素相互作用的结果。
3.肠道是一个复杂的微生态系统，也是人体最大的免疫器官之一。肠道微生态环境和宿主之间的相互作用决定了人类代谢的关键生理过程，包括炎症反应、代谢功能以及疾病易感性和发病机制。在过去的十几年中，大量临床研究表明炎症会改变肠道微生态环境及其代谢产物，而受影响的肠道微生态环境又会激发免疫反应和代谢活动，因此导致慢性炎症，最终形成慢性疾病。肠道微生态系统失调是ibd发病机理的潜在相关机制及主要特征，如不加以控制，炎症可能会朝着癌症的方向发展。
4.益生菌是一类通过定植在人体内，改变某一部位菌群组成的对宿主有益的活性微生物，其种类繁多，较常见的如双歧杆菌、乳酸杆菌等。益生菌主要通过以下三种方式缓解ibd炎症：(1)调节肠道菌群：益生菌通过与病原菌竞争营养物质或附着位点，抑制致病菌活性，或者产生抑菌物质直接抑制病原菌的生长；(2)增强肠道黏膜屏障功能：益生菌通过促进结肠组织粘蛋白的分泌和muc2基因的表达增强黏膜屏障功能，还通过减少肠道上皮细胞的凋亡以维持黏膜屏障的完整性；(3)调节黏膜免疫应答：益生菌如双歧杆菌和乳酸杆菌通过调节树突状细胞的功能，选择性抑制肠黏膜上皮细胞nf-kb活化等多种途径，调节炎症因子的表达，减少炎症细胞积聚，抑制炎症反应，增强黏膜免疫防御功能。综上，益生菌通过恢复肠道菌群多样性和介导免疫应答等多种方式缓解ibd症状，是ibd的潜在治疗方式之一。


技术实现要素：

5.因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种动物双歧杆菌乳亚种菌株goldgut-bb69及用途。
6.为此，本发明提供了如下的技术方案：
7.一种动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)菌株goldgut-bb69，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26204，保藏时间2022年12月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
8.所述的动物双歧杆菌乳亚种菌株goldgut-bb69具有如下生物学特性：革兰氏阳性菌，无鞭毛、不运动，不形成芽孢，专性厌氧；多形态杆菌，其菌落光滑且边缘完整，呈乳白色，闪光并有柔软质地。最适生长温度为37℃～41℃；最适ph值为6.5～7.0。
9.所述的动物双歧杆菌乳亚种菌株goldgut-bb69对胃肠消化液具有良好的耐受性，
在ph 2.5的人工胃液中消化3小时后继续在ph8.0的人工肠液中消化8小时，存活率91.31％，能够以活的状态进入人体肠道。
10.一种含所述的动物双歧杆菌乳亚种菌株goldgut-bb69的产品。
11.可选的，所述的产品包括生物制品、食品或药品。
12.可选的，所述生物制品包括动物双歧杆菌乳亚种菌株goldgut-bb69的微生物菌剂、传代培养后代、突变株或发酵剂。
13.可选的，所述食品包括固体饮料、乳饮料、压片糖果、豆制品、乳制品或果蔬制品；
14.可选的，所述食品包括保健食品。
15.可选的，所述药品还包括药用辅料，所述药用辅料包括溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和释放阻滞剂中的至少一种；
16.可选的，所述药用辅料包括微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和卵磷脂中的至少一种；
17.可选的，所述药品的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
18.可选的，所述的产品中动物双歧杆菌乳亚种菌株goldgut-bb69的活菌数不低于1
×
106cfu/ml或1
×
106cfu/g。
19.所述的动物双歧杆菌乳亚种菌株goldgut-bb69或所述的产品在制备减轻或治疗炎症性肠病的产品中的用途。
20.可选的，所述的用途包括降低疾病活动指数评分，降低结肠重量/长度比值，抑制il-17 t细胞的数量，升高cd4 cd25 foxp3 t细胞的数量，和/或调节th17/treg细胞平衡来减轻或治疗炎症性肠病。
21.可选的，所述炎症性肠病为结肠炎；
22.可选的，所述的产品包括生物制品、食品或药品。
23.本发明技术方案，具有如下优点：
24.1.本发明提供的一种动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)菌株goldgut-bb69，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26204，保藏时间2022年12月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，所述动物双歧杆菌乳亚种对胃肠消化液具有良好的耐受性，能够以活的状态进入人体肠道。所述动物双歧杆菌乳亚种可以降低结肠炎小鼠疾病活动指数评分，降低结肠重量/长度比值，抑制il-17 t细胞的数量，升高cd4 cd25 foxp3 t细胞的数量，和/或调节th17/treg细胞平衡，从而达到减轻或治疗炎症性肠病的目的。
25.进一步的，所述动物双歧杆菌乳亚种可以应用于食品、药品或生物制品，食品如固体饮料、压片糖果、豆制品、乳制品或果蔬制品等。
26.动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)菌株goldgut-bb69，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26204，保藏时间2022年12月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学
院微生物研究所，邮编100101。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1是本发明实验例1中各组小鼠的dai分值结果；其中第7、14天或21天对应的柱形结果中，从左至右依次对应nc组、dss组、bb组、ms组和bm组；
29.图2是本发明实验例1中各组小鼠的结肠重量/长度比值结果；
30.图3是本发明实验例1中各组小鼠的％il-17 t细胞结果；
31.图4是本发明实验例1中各组小鼠的％cd4 cd25 foxp3 t细胞结果；
32.图5是本发明实验例1中各组小鼠的th17/treg比值结果。
具体实施方式
33.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
34.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
35.下述实施例中动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)菌株goldgut-bb69，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26204，保藏时间2022年12月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
36.实施例1动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69的筛选、鉴定、观察和保藏
37.采用稀释涂布法分离细菌。粪便样品振荡后，吸取0.5ml至4.5ml灭菌pbs中，十倍稀释法进行梯度稀释，吸取10-3、10-4稀释液各200μl，分别涂布于rcm固体培养基中。置于37℃条件下厌氧培养72h，形成菌落；用接种环挑取菌落，接种于rcm液体培养液中，置于37℃条件下厌氧培养72h；待菌株生长良好后，再次用接种环划线将菌株接种于rcm琼脂培养基中，置于37℃条件下培养72h，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行革兰氏阳性、过氧化氢酶试验，分离出在试验中呈阴性的菌株，具有如下生物学特性：革兰氏阳性菌，无鞭毛、不运动，不形成芽孢，专性厌氧；多形态杆菌，其菌落光滑且边缘完整，呈乳白色，闪光并有柔软质地。最适生长温度为37℃～41℃；最适ph值为6.5～7.0。将所述菌株进一步纯化培养，并进行低温保存。
38.采用天根dna提取试剂盒提取细菌dna，利用16s rrna基因的通用引物进行16s rrna扩增和测序。将pcr扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并将测序结果通过blast程序与gen bank数据库中已知细菌的核酸序列进行同源性比对分析。经初步鉴定为
动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)，将该菌株命名为动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)菌株goldgut-bb69，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26204，保藏时间2022年12月14日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
39.实施例2
40.一种用于改善炎症性肠病的食品，包括如下原料：动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)菌株goldgut-bb69和可食性材料；
41.所述食品中，动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)菌株goldgut-bb69的活菌数不低于1
×
106cfu/ml或1
×
106cfu/g；
42.所述可食性材料为流体乳品(牛乳、流体牛乳)、奶粉、冰淇淋、乳酪或干酪，在本实施例中选择牛乳。
43.上述的用于改善炎症性肠病的食品的制备方法，包括：将动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69的脱脂乳培养液与经过杀菌浓酸的牛乳成分混匀，再进行真空冷冻升华干燥，制备得到的动物双歧杆菌乳亚种乳粉对改善炎症性肠病具有优异的效果。
44.实施例3
45.一种动物双歧杆菌乳亚种冰淇淋的制备方法，用常规方法得到冰淇淋，在分装之前加入实施例2中制备的动物双歧杆菌乳亚种乳粉，搅拌均匀，即可得到动物双歧杆菌乳亚种冰淇淋。所述动物双歧杆菌乳亚种冰淇淋中，所述动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69的活菌数不低于1
×
106cfu/ml或1
×
106cfu/g，对改善炎症性肠病具有良好的作用。
46.实施例4
47.一种动物双歧杆菌乳亚种发酵乳制备方法，包括：
48.使用浓缩脱脂乳或脱脂乳粉强化的脱脂乳，将混合料在98℃温度下加热杀菌40分钟，冷却到35℃，然后在其中添加4％(w/v)的所述动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69发酵剂(活菌数为1
×
107cfu/g)，在35℃温度条件下培养，使酸度达到2％，培养时间为24小时，其中所述动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69的活菌数不低于1
×
106cfu/ml或1
×
106cfu/g。得到所述动物双歧杆菌乳亚种发酵乳，其对改善炎症性肠病具有良好的作用。
49.实施例5
50.一种动物双歧杆菌乳亚种胶囊的制备方法，将所述动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69用液体培养液培养，收集和洗涤菌体，添加药用辅料，干燥制备成活性菌粉，用明胶制成囊材，用pvp作底衣，再用蜂蜡进行外层包衣，用胶囊包装，得到动物双歧杆菌乳亚种胶囊。所述动物双歧杆菌乳亚种胶囊中，所述动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69的活菌数不低于1
×
106cfu/ml或1
×
106cfu/g。
51.实施例6
52.一种动物双歧杆菌乳亚种发酵果蔬汁的制备方法，包括：
53.首先取胡萝卜50公斤，经过分选、清洗、去皮、切分、漂烫、榨汁打浆、配料、匀质以及灭菌步骤得到无菌果蔬汁。
54.然后将动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69活化，扩大培养，接种到无菌果蔬汁、发酵、取样检测合格、冷却降温和无菌灌装，得到动物双歧杆菌乳亚种发酵果蔬汁，其中所述
动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69的活菌数不低于1
×
106cfu/ml或1
×
106cfu/g，对改善炎症性肠病具有良好的作用。
55.实验例
56.实验动物：购入40只6周龄雄性spf级c57bl/6j小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)，饲养于内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，室内12h光照和黑暗更替。适应性饲养一周后，小鼠预饲养1周后开展实验。
57.实验分组：随机分为正常组(nc组)、模型组(dss组)、益生菌干预组(bb组)、阳性药物组(ms组)，菌药联合组(bm组)，每组8只。
58.实验方法：除nc组外，其余各组均给予2.3％(w/v)葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，dss)水溶液7天，第8天时更换为0.8％(w/v)dss水溶液，给药至21天，小鼠以自由饮水的方式摄取。从第0天开始，bb组小鼠给予goldgut-bb69菌液0.2ml(4
×
109cfu/d)灌胃处理，ms组小鼠每天给予5-氨基水杨酸溶液0.2ml(给药剂量为5-氨基水杨酸100mg/kg(体重))灌胃处理，bm组同时给予益生菌goldgut-bb69(每天goldgut-bb69菌液0.2ml(4
×
109cfu/d))和5-氨基水杨酸(每天给予0.2ml，给药剂量为5-氨基水杨酸100mg/kg(体重))灌胃处理，nc组与dss组每天给予生理盐水0.2ml灌胃处理，干预周期为21天。整个实验过程中，每天记录小鼠体重和粪便状态，小鼠每天自由摄食和饮水，第21天处死小鼠并取样用于后续分析。
59.菌液的配制：将动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69于下表液体培养基(组分均为市售产品)中37℃培养24h，离心收集菌体，菌体中加入10％(w/v)灭菌脱脂乳，混合均匀后经真空冷冻干燥后制成冻干粉，冻干粉动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69活菌数＞2
×
10
11
cfu/g。然后按照给药剂量，称量冻干粉溶于生理盐水制备得到。
60.表1、液体培养基组成
[0061][0062]
[0063]
实验检测和结果：
[0064]
(1)疾病活动指数(disease activity index，dai)评分
[0065]
疾病活动指数(disease activity index，dai)综合评估了小鼠的体重变化率、粪便性状和粪便隐血情况，即dai得分＝体重变化率得分 粪便性状得分 粪便隐血得分。具体评分标准如下：体重变化率得分：0＝0％-体重增加；1＝0％《体重变化率≤-5％；2＝-5％《体重变化率≤-10％；3＝-10％《体重变化率≤-15％；4＝体重变化率》-15％。粪便性状得分；0＝正常粪便；1＝湿润粪便；2＝稀便；3＝不成形粪便。粪便便隐血得分：4＝0s《变紫色时间≤10s；3＝10s《变紫色时间≤30s；2＝30s《变紫色时间≤60s；1＝60s《变紫色时间≤120s；0＝变紫色时间》120s。
[0066]
对各组小鼠进行疾病活动指数评分，数据处理方式为“平均值
±
标准差”(means
±
s.d.)，采用t检验(student’s t-test)分析进行差异显著性分析，结果如图1所示，第7天时，与nc组相比较，其余各组dai评分显著升高(p＜0.0001)，小鼠活动减少，体重下降明显，大便不成形，个别出现血便，表明成功诱导炎症性肠病动物模型；第14天和21天时，与dss组比较，bb组dai评分显著降低(p＜0.05)。第21天时，bb组与ms组比较，dai评分无显著差异，说明菌与药物效果上无明显差异。
[0067]
(2)结肠重量/长度比值
[0068]
第21天时，收取各组小鼠肛门至盲肠末端区间结肠组织，测量结肠长度，并称量其重量，数据处理方式为“平均值
±
标准差”(means
±
s.d.)，采用t检验(student’s t-test)分析进行差异显著性分析。结果如图2所示，相较于dss组，bb组可以显著降低结肠重量(克)/长度(cm)比值(p《0.05)，说明本发明的动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69可以有效缓解结肠炎症，消除水肿。
[0069]
(3)th17/treg比值
[0070]
第21天时，在预冷的pbs中剥离出小鼠脾脏，在细胞筛中轻轻研磨，用一定体积的pbs冲洗，收集脾脏研磨液。加入同体积的小鼠脾脏淋巴细胞分离液，混合离心后吸取白膜层，获得小鼠脾脏单个核细胞。继续离心并孵育进行细胞刺激培养。4h后转移至流式上样管，离心弃上清后，依次分别加入固定剂(购自becton dickinson and company)、破膜剂(购自becton dickinson and company)、荧光染料(购自becton dickinson and company)。孵育重悬后上机检测。
[0071]
结果如图3所示，与dss组比较，nc组的il-17 t细胞的数量显著降低(p《0.05)，bb组和ms组的il-17 t细胞的数量显著降低(p《0.01)，bm组的il-17 t细胞的数量显著降低(p《0.05)，说明本发明的动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69可以显著抑制前炎症细胞因子的释放。
[0072]
如图4所示，与dss组比较，nc组的cd4 cd25 foxp3 t细胞的数量升高，bb组的cd4 cd25 foxp3 t细胞的数量显著升高(p《0.05)，而ms组与bb组比较，ms组的cd4 cd25 foxp3 t细胞的数量显著降低(p《0.05)。说明本发明的动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69可以显著升高cd4 cd25 foxp3 t细胞的数量，以抑制炎症反应。
[0073]
如图5所示，与dss组比较，bb组treg细胞数量显著增加，而th17细胞数量显著减少，th17/treg比值显著下降(p《0.001)，ms组的th17/treg比值显著下降(p《0.05)，bm组的th17/treg比值显著下降(p《0.001)。
[0074]
综上，说明本发明的动物双歧杆菌乳亚种goldgut-bb69通过调节小鼠th17/treg细胞平衡，调节促炎细胞因子和抑炎细胞因子的释放水平，减轻炎症性肠病诱发的免疫异常，进而起到治疗ibd的作用。
[0075]
实验例2胃肠消化液的耐受性
[0076]
ph 2.5的人工胃液的配制：在灭菌pbs(含0.8％(w/v)nacl，0.02％(w/v)kh2po4，0.115％(w/v)na2hpo4，ph7.2)(100ml)中加入3.0g/l胃蛋白酶(pepsin，sigma)(0.3g)，用0.1mol/l的hcl调整ph值为2.5，配制成模拟人工胃液，0.22μm无菌滤膜过滤除菌备用；
[0077]
ph 8.0的人工肠液的配制：在灭菌pbs(含0.8％(w/v)nacl，0.02％(w/v)kh2po4，0.115％(w/v)na2hpo4，ph7.2)(100ml)中加入1.0g/l的胰蛋白酶(trypsin，sigma)(0.3g)和1.8％牛胆盐(bile salt，sigma)(1.8g)，用0.1mol/l的naoh调整ph值为8.0，配制成模拟人工肠液，0.22μm无菌滤膜过滤除菌备用；
[0078]
实验方法：将动物双歧杆菌乳亚种菌株goldgut-bb69菌液(将原始菌株于mrs培养基中连续传代培养2次，将传代培养第2次且为生长稳定期的菌体离心(3000g/7min/4℃)收集，用pbs洗涤2次后，将菌体悬浮于10ml pbs中制得)按照1:9(体积比例)加入到ph 2.5的人工胃液中，然后37℃消化3小时，然后取1ml上述的含菌人工胃液转入到9ml ph 8.0的人工肠液中，然后37℃消化8小时，分别于0h(为加入到ph 2.5的人工胃液开始计时)和8h(为转入到ph 8.0的人工肠液中消化8小时)采用平板计数法计数测定存活率，测定结果为91.31％。
[0079]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。