具有改变的特异性的工程化的N-糖基转移酶

技术特征：
1.一种修饰的n-糖基转移酶(ngt)，其选自下组或其同源物：(i)在氨基酸位置f39、r177、h214、d215、m218、h219、y222、h272、h277、s278、i279、r281、m349、g370、h371、t438、t439、m440、k441、a469(q469)、h495、p497、y498、f517、n521和d525处包含一个或多个取代的放线杆菌属物种(actinobacillus spp.)(任选地修饰的seq id no:1的胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae)的ngt)；(ii)在氨基酸位置f42、r181、h218、d219、m222、h219、y223、h276、h281、s282、i283、r285、m354、g375、h376、t443、t444、m445、k446、a474(q474)、h500、p502、y503、f522、n526和d530处包含一个或多个取代的金氏菌属物种(kingella spp.)(任选地修饰的seq id no:2的金氏金格杆菌(kingella kingae)的ngt)；(iii)在氨基酸位置f68、r204、h241、d242、m245、h246、y249、h298、h303、s304、i305、r307、m375、g396、h397、t464、t465、m466、k467、a495(q495)、h521、p523、y524、f543、n547和d551处包含一个或多个取代的嗜血杆菌属物种(haemophilus spp.)(任选地修饰的seq id no:3的肺炎嗜血杆菌(haemophilus pneumoniae)的ngt)；(iv)在氨基酸位置f39、r177、h214、d215、m218、h219、y222、h270、h275、s276、i277、r279、m348、g369、h370、t437、t438、m439、k440、a468(q468)、h494、p496、y497、f516、n520和d524处包含一个或多个取代的聚集杆菌属物种(aggregatibacter spp.)(任选地修饰的seq idno:4的嗜沫聚集杆菌(aggregatibacter aphrophilus)的ngt)；(v)在氨基酸位置f39、r177、h214、d215、m218、h219、y222、h272、h277、s278、i279、r281、m349、g370、h371、t438、t439、m440、k441、a469(q469)、h495、p497、y498、f517、n521和d525处包含一个或多个取代的曼氏杆菌属物种(mannheimia spp.)(任选地修饰的seq id no:5的溶血性曼氏杆菌(mannheimia haemolytica)的ngt)；(vi)在氨基酸位置f40、r180、h217、d218、m221、h222、y225、h274、h279、s280、i281、r283、m351、g372、h373、t440、t441、m442、k443、a471(q471)、h497、p499、y500、f519、n523和d527处包含一个或多个取代的百伯史坦菌属物种(bibersteinia spp.)(任选地修饰的seq idno:6的海藻百伯史坦菌(bibersteinia trehalosi)的ngt)；和(vii)在氨基酸位置f38、r176、h213、d214、m217、h218、y221、h271、h276、s277、i278、r280、m348、g369、h370、t437、t438、m439、k440、a468(q468)、h494、p496、y497、f516、n520和d524处包含一个或多个取代的嗜血杆菌属物种(任选地修饰的seq id no:7的杜克雷嗜血杆菌(haemophilus ducreyi)的ngt)。2.权利要求1所述的修饰的ngt，其中参考seq id no:1，氨基酸取代位于选自由h219、t438、a696和h495或其同源位置组成的组的一个或多个位置。3.权利要求1所述的修饰的ngt，其中参考seq id no:1，氨基酸取代位于选自由以下组成的组的一个或多个位置：h219f或h219w；t438s或t438e；a696g或a696i；和h495d或其同源位置。4.权利要求1所述的修饰的ngt，其中野生型ngt包含seq id no:1-7中的任何一个，并且参考seq id no:1，修饰的ngt在选自由以下组成的组的位置处包含至少一个取代突变：h219f、h219w、t438s、t439e、a469g、a469i、h495d、h219f-t438s、h219f-h495d、h219w-t438s、h219w-h495d、a469g-h495d和a469i-h495d或其同源位置；其中h219f-t438s、h219f-h495d、h219w-t438s、h219w-h495d、a469g-h495d和a469i-h495d是两个取代突变的组合。
5.权利要求1所述的修饰的ngt，其中与相同反应条件下的未修饰的ngt相比，修饰的ngt糖基化更广泛的受体肽序列。6.权利要求1所述的修饰的ngt，其中与相同反应条件下的未修饰的ngt相比，修饰的ngt对更广泛的受体肽序列具有亲和力。7.权利要求1所述的修饰的ngt，其中受体肽序列包含氨基酸序列[x-2-]-[x-1-]-[n]-[x
1
]-[x
1
]-[x
2
]-[x
3
]，其中x是任何典型氨基酸，并且任选地其中[x
1
]不是p。8.权利要求1所述的修饰的ngt，其中受体肽序列包含氨基酸序列[x-2
]-[x-1-]-[n]-[x
1
]-[x
1
]-[x
2
]-[x
3
]，其中x是任何典型氨基酸，并且任选地其中[x
1
]不是p，并且任选地其中[x
2
]不是s或t。9.一种多核苷酸序列，其编码权利要求1所述的修饰的ngt。10.一种表达载体，其包含权利要求9所述的多核苷酸序列。11.一种细菌细胞，其包含权利要求1所述的修饰的ngt。12.权利要求11所述的细菌细胞，其进一步包含靶多肽。13.一种真核细胞，其包含权利要求1所述的修饰的ngt。14.权利要求13所述的真核细胞，其进一步包含靶多肽。15.一种用于糖基化靶多肽的方法，其中靶多肽包含受体肽序列，所述方法包括：在合适的反应条件下使靶多肽与权利要求1所述的修饰的ngt和聚糖接触。16.权利要求15所述的方法，其中靶多肽包括治疗性多肽。17.权利要求15所述的方法，其中方法在体内进行。18.权利要求15所述的方法，其中方法在体外进行。19.权利要求15所述的方法，其中靶多肽是原核蛋白质。20.权利要求15所述的方法，其中靶多肽是真核蛋白质。21.权利要求15所述的方法，其中靶多肽包含受体肽序列，所述受体肽序列包含氨基酸序列[x-2
]-[x-1-]-[n]-[x
1
]-[x
1
]-[x
2
]-[x
3
]，其中x是任何典型氨基酸，并且任选地其中[x
1
]不是p，并且任选地其中[x
2
]不是s或t。22.权利要求15所述的方法，其中ngt用一种或多种聚糖来糖基化靶多肽。23.权利要求15所述的方法，其中聚糖包含一种或多种选自由葡萄糖、半乳糖和n-葡糖胺组成的组的单糖。24.一种修饰的n-糖基转移酶(ngt)，其包含在对应于seq id no:1的胸膜肺炎放线杆菌ngt的下述氨基酸位置处的一个或多个取代：f39、r177、h214、d215、m218、h219、y222、h272、h277、s278、i279、r281、m349、g370、h371、t438、t439、m440、k441、a469、h495、p497、y498、f517、n521和d525。25.权利要求24所述的修饰的ngt，其中ngt衍生自选自由以下组成的组的生物体：金氏金格杆菌；流感嗜血杆菌；嗜沫聚集杆菌；溶血性曼氏杆菌；海藻百伯史坦菌；杜克雷嗜血杆菌；伯克霍尔德氏菌属物种(burkholderia sp)；小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersinia enterocolitia)；鼠疫耶尔森氏菌(yersinia pestis)；肠道沙门氏菌(salmonella enterica)；和大肠杆菌(escherichia coli)。26.权利要求24所述的修饰的ngt，其中ngt衍生自选自由溶血性曼氏杆菌和杜克雷嗜血杆菌组成的组的生物体。
27.权利要求24所述的修饰的ngt，其中与相同反应条件下的未修饰的ngt相比，修饰的ngt糖基化更广泛的受体肽序列。28.权利要求24所述的修饰的ngt，其中与相同反应条件下的未修饰的ngt相比，修饰的ngt对更广泛的受体肽序列具有亲和力。29.一种治疗组合物，其包含权利要求16所述的治疗肽。30.权利要求29所述的治疗组合物，其中组合物包含疫苗。

技术总结
本发明公开了用于在体外和体内合成糖蛋白或重组糖蛋白的组合物、系统和方法。特别地，本发明涉及修饰的N-糖基转移酶(NGT)，用于产生修饰的NGT的方法，用于鉴定和/或产生用于通过NGT的糖基化的修饰的受体肽序列的方法，以及用于使用修饰的NGT和/或受体肽序列在体外和体内制备糖蛋白和重组糖蛋白的方法。和体内制备糖蛋白和重组糖蛋白的方法。和体内制备糖蛋白和重组糖蛋白的方法。


技术研发人员：M
受保护的技术使用者：西北大学
技术研发日：2021.07.14
技术公布日：2023/4/29