重组rhTSG6-hMTⅣ融合蛋白及其制备方法和应用及以其作为有效成分的护肤品与流程

重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白及其制备方法和应用及以其作为有效成分的护肤品
技术领域
1.本发明涉及一种重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白及其制备方法和应用及以其作为有效成分的护肤品。


背景技术：

2.随着社会经济的不断发展和物质生活的丰富，越来越多的人使用护肤品来提升外在形象并保持良好的精神状态，这其中，亚洲人尤其重视皮肤的白皙美，同时亚洲(东亚)青年更易受痤疮的困扰，而痤疮的出现严重影响了皮肤的光洁嫩滑度，这使得市场上对于功效特异、质量可靠、无毒无害无残留的美白祛痘类化妆品的需求量呈上升趋势。
3.痤疮发作的主要原因是皮肤局部炎症刺激使之温度升高，加快了局部的新陈代谢，令水分减少，油脂分泌增加，进而导致痤疮，所以消炎成为痤疮外用药物的主要靶点。而皮肤的白皙程度则与皮肤黑色素的含量有关，其中紫外线等辐射是皮肤老化、黑色素沉积的重要原因，故抗辐射是美白化妆品的重要特性。
4.虽然，肿瘤坏死因子α刺激基因6(tsg-6)与ⅳ型金属硫蛋白(mt
‑ⅳ
)均有作为护肤品原料的潜力，但如果将tsg-6和mt
‑ⅳ
单独作为护肤品的原料，即使两者同时添加，会存在技术上的一些不可避免的难题需要解决，如重组肿瘤坏死因子α刺激基因6(rhtsg-6)截短蛋白产量和纯度高，但活性较低；重组全长的该蛋白活性高但产量较低。重组人ⅳ型金属硫蛋白(rhmt
‑ⅳ
)为金属硫蛋白之一，分子结构中含有金属离子，纯化过程中易出现沉淀现象，需要采用有针对性的纯化流程；增加了这两种重组蛋白在形成组合物的配制和生产上的流程过于繁琐，影响产品的稳定性。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白及其制备方法和应用及以其作为有效成分的护肤品。本发明将编码人tsg-6的基因与编码人mt
‑ⅳ
的基因通过link连接形成一段新的外源性基因片段，并通过基因重组技术整合到大肠埃希工程菌基因组中；经基因工程技术发酵表达出一种新的独特的重组人肿瘤坏死因子α刺激基因6-人ⅳ型金属硫蛋白(rhtsg6-hmtⅳ)融合蛋白，该融合蛋白同时以tsg-6、rhmt
‑ⅳ
蛋白作为护肤品的有效活性成分，且蛋白分子量较大，具有抵抗体表酶促降解以及延长体表的可持续半衰期和保存期限的优点，且其作用于皮肤的机制是能够作用于皮肤表面和毛囊开口处的角质剥脱，且没有明显的刺激作用。该新型融合蛋白不仅具有美白祛痘、延缓衰老和抗紫外抗辐射的作用，而且对热稳定性高。可将其作为有效成分制备成多种新型耐热剂型的护肤品，经多种多次多部位皮肤测试，确认了受试者的受试部位可达到美白、祛痘、靓肤和润肤、治疗角质皲裂的效果。
6.本发明采取的技术方案为：
7.一种重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白，所述重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的氨基酸序列
表如sequence listing 400〈1〉所示。
8.本发明还提供了一种编码所述重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的基因，所述基因的序列如sequence listing 400〈2〉所示。
9.本发明还提供了一种包含编码所述重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的基因的重组载体。
10.本发明还提供了一种包含所述重组载体的宿主细胞。
11.进一步地，所述宿主细胞为大肠埃希工程菌。
12.本发明还提供了所述的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：用所述的重组质粒载体转化宿主细胞，并经诱导表达、纯化，得到重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白。
13.本发明还提供了所述的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白作为护肤品原料的应用。
14.本发明还提供了一种护肤品，其以所述的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白为主要有效成分，该护肤品不仅具有美白祛痘、延缓衰老和抗紫外抗辐射的功效，而且对热稳定性高。
15.进一步地，所述护肤品可以为化妆水、柔肤水、爽肤水、香水、洁肤水、润肤露、身体洁肤露、卸妆液、乳液、牛奶乳液、保湿乳液、营养乳液、精华乳、精华液、营养精华液、精华霜、妆前霜、润面霜、粉底霜、按摩霜、营养霜、眼霜、保湿霜、护手霜、清洁霜、遮瑕膏、润肤油、精华油、香粉、爽身粉、散粉、洁肤粉、蜜粉、洁面泡沫、面膜、香皂中的任意一种剂型。
16.进一步地，所述护肤品中进一步包含选自脂肪物质、有机溶剂、增溶剂、浓缩剂及胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、掩蔽剂及螯合剂、保存剂、维生素、阻断剂、湿润剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲油性活性剂、脂质小囊中的任意一种或多种作为助剂。
17.本发明创新性地利用合成生物学原理指导下的基因重组技术，通过一段link连接肽序列将编码人tsg-6的基因与编码人mt
‑ⅳ
的基因连接起来，并将含有连接后的基因表达载体导入到大肠埃希工程菌中，利用大肠埃希工程菌密码子优化编码rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的新目的基因，经诱导表达、纯化，制备得到高表达、高活性的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白；并将其作为护肤品的主要活性原料，得到了具有美白、祛痘、靓肤和润肤、治疗角质皲裂功能的护肤品。以微量的rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白作为有效成分制备的护肤品涂抹在皮肤表面，即可达到抑炎、消除自由基的功能，产生美白、祛痘、靓肤和润肤、治疗角质皲裂的功效。
18.近年的研究已经确认，tsg-6是一种多功能蛋白，具有下调炎症因子水平、减少炎症细胞浸润和减轻细胞外基质(extracellular matrix，ecm)病理反应等生物学功能，并且受到肿瘤坏死因子α等细胞因子的调节。tsg-6蛋白属透明质酸结合蛋白家族，主要通过与透明质酸、间α胰蛋白酶抑制物(inter-alpha-trypsin inhibitor,iαi)、cd44等氨基葡聚糖类物质结合。在急性炎症中，tsg-6由间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)分泌产生，能够抑制细胞因子风暴，减轻炎症对重要器官的损伤，降低死亡率和改善预后；在慢性炎症中，tsg-6能减少组织损伤，参与细胞外基质重塑，改善疾病预后。即tsg-6的作用机制主要是通过增强与细胞表面cd44黏附因子等的结合能力，抑制核转录因子nf-κb信号转导途经和改变金属蛋白酶活性等途经，高效参与机体免疫调控以减轻组织损伤。因此，该蛋白可用于消除炎症所引起的痤疮症状。
19.哺乳动物组织中的mt
‑ⅳ
是一种金属硫蛋白，已知含有4种类型；其主要分布于皮
肤、舌、消化道等器官的角质细胞和复层鳞状上皮细胞中，功能独特而专一，可通过结合或释放金属离子来调节自由基的水平，对由于金属离子调节机制稳态失衡导致的机体氧化损伤起到一定预防和修复作用，并避免了自由基对机体深层组织，如细胞膜和dna、胶原蛋白和弹性蛋白的伤害。且ⅳ型mt含有大量巯基，能有效清除多种自由基，可大为减少辐射对机体的的直接和间接损伤作用；同时，ⅳ型mt中的亲电巯基基团可以通过氢供体使受损的dna得以修复从而拮抗紫外辐射。
20.由上述两种蛋白组成的rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白应用于护肤品中时，同时含有rhtsg-6和rhmt
‑ⅳ
蛋白作为护肤品的有效活性成分，且蛋白分子量较大，具有抵抗体表酶促降解以及延长体表的可持续半衰期和保存期限的优点，且其作用于皮肤的机制不同于rhtsg-6或rhmt
‑ⅳ
单独作用于皮肤的机制，且其能够作用于皮肤表面和毛囊开口处的角质剥脱，且没有明显的刺激作用。
21.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
22.(1)本发明创新性地将人tsg-6和人mt
‑ⅳ
基因连接起来，并经诱导表达后制备得到重组人肿瘤坏死因子α刺激基因6-人ⅳ型金属硫蛋白(rhtsg-6-hmtⅳ)融合蛋白，其制备方法简单，适用于工业化大规模生产。
23.(2)rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白能够抑制皮肤表面的急慢性炎症反应的同时，还能刺激皮肤消除羟自由基抗氧化的相关作用并通过促进细胞黏附和细胞修复，以改善皮肤质量并达到护肤保湿、止痒、美白、恢复皮肤弹性、消除皱纹、祛痘及祛斑的功效；同时其对热稳定性高。因此，其在功能化妆品或护肤品及美容整形领域具有广阔市场前景。
24.(3)在护肤品的各种剂型中添加0.02ppm rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白，即可同时发挥出美白、祛痘、靓肤、润肤和治疗角质皲裂的作用。
附图说明
25.图1为制作包含编码重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的基因重组质粒(pet32a：：tmt)的流程及转化至大肠埃希菌中的模式图；
26.图2为确认在大肠埃希菌中重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白是否表达的结果；
27.图3为重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白纯化后sds-page电泳检测结果；其中m为蛋白marker，泳道2为纯化前的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白溶液，泳道3为纯化后的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白；
28.图4为分别用0(a)、0.02ppm(b)、0.2ppm(c)浓度的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白处理所培养的3t3细胞后，3t3细胞的细胞增殖情况；
29.图5为受试对象使用实施例2中的制备例1和比较例1一个周期(为总共4周)内受试部位皮肤平均黑色素指数变化曲线；
30.图6为受试对象使用实施例3中的制备例2和比较例2一个周期(为总共4周)内受试部位皮肤平均黑色素指数变化曲线。
31.图7为重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的热稳定性测试结果，其中(a)组为0.2ppm浓度未经任何处理的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白作用ehf细胞72小时的培养产物；(b)组为不含重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白作用ehf细胞72小时的培养产物；(c)组为0.2ppm浓度121℃保温15分钟处理的重组rhtsg-6-hmtⅳ融合蛋白作用ehf细胞72小时的培养产物；(d)组为
0.2ppm浓度56℃水浴96小时处理的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白作用ehf细胞72小时的培养产物。
具体实施方式
32.下面结合实施例对本发明进行详细说明。
33.实施例1
34.一种重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
35.(1)使用一段如sequence listing 400〈3〉所示的连接肽基因片段将如sequence listing 400〈4〉所示的重组人tsg-6基因和如sequence listing 400〈5〉所示的人mt
‑ⅳ
基因进行连接，获得的基因序列如sequence listing 400〈2〉所示，其可编码重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白，所述重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的氨基酸序列如sequence listing 400〈1〉所示。
36.(2)使用pet32a载体与编码重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的基因序列进行连接，该载体中含有trxa标签序列有助于蛋白的正确折叠避免形成包涵体，含有的his标签可便于蛋白的亲和纯化；将pet32a-rhtsg6-hmtⅳ重组质粒转化大肠埃希菌感受态细胞dh5α(大连宝生物工程有限公司)，在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂平板培养基培养并选择转化子。挑取单克隆菌落，接种于2ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，在恒温培养振荡器37℃培养过夜。用高纯度质粒小提试剂盒(大连宝生物工程有限公司)制备质粒，测序结果证明与理论预期一致，－20℃保存备用。
37.(3)将保存的重组质粒pet32a-rhtsg6-hmtⅳ转化至bl21(de3)感受态细胞(大连宝生物工程有限公司)，在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板培养基选择转化子。挑取单克隆菌落，接种于2ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中37℃培养过夜，转接至100ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃震荡培养，当od600达到0.8左右时加入终浓度1mm异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导6小时，之后将菌液在7000r/min离心20分钟，收集沉淀。沉淀用20ml结合缓冲液(50mm tris-hcl，100mm nacl，ph8.0)重悬后冰水浴600w超声30分钟破碎细胞，4℃12000r/min离心20分钟离心取上清。
38.(4)上清用his-tag亲和层析柱纯化，使用140mm咪唑进行洗涤去除，再使用500mm咪唑进行洗脱收集目的蛋白，7kda孔径透析袋透析换液2次，每次4℃透析6小时，12000r/min离心20分钟取上清即为重组rhtsg-6-hmtⅳ融合蛋白原液，其sds-page电泳检测结果如图3所示。
39.(5)重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白原液的鉴定
40.按照《中华人民共和国药典三部》“通则0731第二法”福林酚法(lowry法)，以中国食品药品生物制品检定院提供的bsa标准蛋白作标准品测定，蛋白含量为1.0mg/ml。
41.按照《中华人民共和国药典三部》“通则0541第五法”sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白原液纯度为85％～90％；重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白原液上样量10μg。
42.(6)重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白原液的活性测定
43.为了测定实施例1中重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白原液的活性，分别将含有0ppm、0.02ppm、0.2ppm浓度的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白溶液加入到已经长满单层(汇合度达
90％左右)的3t3细胞培养物上，置37℃、5％co2培养箱内培养72小时，在显微镜下观察并评价细胞生长繁殖的效果。
44.所得结果如图4所示。从图中可以看出，与对照组相比，随着重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的浓度升高，3t3细胞的生长繁殖的能力明显升高。
45.实施例2
46.重组融合蛋白作为护肤水原料的应用
47.以所述实施例1中的rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白原液作为有效成分，制备了表1中所示的制备例1与比较例1中的护肤水，并进行了感官试验和美白功效性试验。
48.表1护肤水组合物的成分
[0049][0050]
注：*为提取溶剂和防腐剂
[0051]
具体地，为了确认重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白美白功效，选择18岁以上且小于30岁的健康女性和男性，皮肤类型为fitzpatrick iii～iv型。共50名受试对象，无过敏性疾病，无化妆品及其它外用制剂过敏史，受试部位皮肤无胎记、炎症、瘢痕、多毛等现象，无吸烟、饮酒、熬夜等不良习惯和嗜好，女性不在妊娠或哺乳期内。按照随机分布原则平均分为两组，一组使用比较例1(对照组)，另一组使用制备例1(试验组)，均为洁面后取比较例1或制备例1护肤水组合物适量涂抹于面部，按摩至吸收，每日早晚各一次，连续使用四周。使用皮肤色素仪对试验对象每周测量一次使用部位皮肤的黑色素含量，结果如图5所示，从图中可以看出，添加了重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的护肤水在使用一个周期内可明显降低皮肤中的黑色素含量。
[0052]
为了确认重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白祛痘功效和对皮肤刺激性，选择18岁以上且小于30岁的健康女性和男性共32名受试对象，其中中度(ⅱ级)痤疮20人，面部表现为病损数达31～59个，有中等数量的丘疹和脓疱；中度(ⅲ级)痤疮12人，面部表现为病损数为60～100个。按照随机分布原则平均分为两组，每组中度(ⅱ级)痤疮各10人，中度(ⅲ级)痤疮各6人，共16人。一组使用比较例1(对照组)，另一组使用制备例1(试验组)，均为洁面后取比较例1或制备例1护肤水组合物适量涂抹于面部，按摩至吸收，每日早晚各一次，连续使用四周。
[0053]
祛痘结果通过对受试对象脸部痤疮的改善情况进行评价，评价的基准是根据5分制评分进行的，即痤疮痊愈(5分)、痤疮消除60％以上(4分)、痤疮消除20％至60％(3分)、痤疮消除小于20％(2分)、痤疮加重(1分)。同时皮肤刺激结果也通过对受试对象皮肤是否出现的瘙痒、红肿、刺激以及发红等现象进行评价。评价的基准是根据5分制评分进行的，即皮肤完全无刺激(5分)、皮肤基本无刺激(4分)、存在不舒适感觉(3分)、皮肤存在明显刺激(2分)、皮肤出现剧烈刺激反应(1分)。
[0054]
上述结果评价如表2所示。结果表明，在护肤水中添加0.0002％的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白原液，即可明显改善皮肤的痤疮情况，同时还具有明显的美白作用。
[0055]
表2使用一个周期后制备例1和比较例1的祛痘感官实验结果
[0056][0057][0058]
实施例3
[0059]
重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白作为精华液原料的应用
[0060]
以所述实施例1中的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白原液作为有效活性成分，制备了表3中所示的制备例2与比较例2中的精华液，并进行了感官试验和美白功效性试验。
[0061]
表3精华液组合物
[0062][0063]
注：*为提取溶剂和防腐剂
[0064]
为了确认重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白美白功效，选择18岁以上且小于30岁的健康女性和男性，皮肤类型为fitzpatrick iii～iv型。共50名受试对象，无过敏性疾病，无化妆品及其它外用制剂过敏史，受试部位皮肤无胎记、炎症、瘢痕、多毛等现象，无吸烟、饮酒、熬夜等不良习惯和嗜好，女性不在妊娠或哺乳期内。按照随机分布原则平均分为两组，一组使用比较例2(对照组)，另一组使用制备例2(试验组)，均为洁面后取比较例2或制备例2精华液组合物适量涂抹于面部，按摩至吸收，每日早晚各一次，连续使用4周。具体测试方法同实施例2。结果如图6所示，从图中可以看出，添加了重组rhtsg-6-hmtⅳ融合蛋白的精华液在受试者使用一个周期内可明显降低皮肤中的黑色素含量。
[0065]
为了确认重组rhtsg-6-hmtⅳ融合蛋白祛痘功效和对皮肤刺激性，选择18岁以上且小于30岁的健康女性和男性共32名受试对象，其中中度(ⅱ级)痤疮20人，面部表现为病损数达31～59个，有中等数量的丘疹和脓疱；中度(ⅲ级)痤疮12人，面部表现为病损数为60～100个。按照随机分布原则平均分为两组，每组中度(ⅱ级)痤疮各10人，中度(ⅲ级)痤疮各6人，共16人。一组使用比较例2(对照组)，另一组使用制备例2(试验组)，均为洁面后取比较例2或制备例2护肤水组合物适量涂抹于面部，按摩至吸收，每日早晚各一次，连续使用4周。
[0066]
测定方法及评分标准同“实施例2”。所述制备例2与比较例2在一个使用周期后(4周)的祛痘和感官实验结果评价如表4所示，结果表明，在精华液中添加0.02％的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白原液，即可明显改善皮肤的痤疮症状，并具有明显的美白作用。
[0067]
表4一个使用周期后制备例2和比较例2的祛痘感官实验结果
[0068]
[0069][0070]
通过对制备例和比较例的祛痘(痤疮改善)、感官试验、美白功效和对皮肤刺激性等试验结果分析，可以看出以本发明提供的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白作为有效成分的制备例中的护肤品，对美白祛痘效果，且无明显皮肤刺激性。
[0071]
实施例4
[0072]
重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白的热稳定性测试
[0073]
将0.2ppm的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白溶液分为两组，一组置于高压灭菌器中于121℃保温15分钟、另一组置于56℃水浴锅中保持96小时，并以未经任何处理同等浓度的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白溶液作为对照；然后分别加到人成纤维细胞(ehf)单层细胞上，并在37℃、5％co2温箱培养72小时。经结晶紫染色对基于各组融合蛋白处理后的细胞生长繁殖状态进行比对和分析。结果如图7所示，从图可以看出，121℃保温15分钟和56℃水浴锅处理96小时处理试验组与未经任何处理同等浓度的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白溶液对照组相比，从细胞染色性和数量上基本一致。
[0074]
结果表明，本发明制备的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白经过高压灭菌处理或56℃水浴锅处理96小时后，依然能够与对照组保持同样的促细胞生长繁殖能力。可见，本发明制备的重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白耐热，并具有促进皮肤细胞生长繁殖的作用。
[0075]
上述参照实施例对一种重组rhtsg6-hmtⅳ融合蛋白及其制备方法和应用及以其作为有效成分的护肤品进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。