一种抗乳腺癌耐药的紫杉醇纳米材料及其制备方法与应用

1.本发明属于纳米药物技术领域，具体涉及到一种抗乳腺癌耐药的紫杉醇纳米材料及其制备方法与应用。


背景技术：

2.乳腺癌(breast cancer)是世界范围内最常见的女性恶性肿瘤，也是导致女性癌症患者死亡的主要原因之一。近年来，作为中国女性最常见的癌症，乳腺癌在我国的发病率及死亡率均呈逐年上升趋势，并且发病年龄趋于年轻化，严重危害着我国妇女健康。
3.紫杉醇(ptx)是应用最广泛的天然抗癌化疗药物之一，常被用作乳腺癌的一线治疗药物。由于紫杉醇本身不溶于水的物理性质，临床上主要将紫杉醇溶于聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇的复合溶媒中使用，并且因其生物利用度低，采用先进纳米技术制备紫杉醇脂质体和紫杉醇-白蛋白结合型复合物进行使用。目前，国内市场注射用紫杉醇脂质体的生产厂家仅有绿叶制药，紫杉醇-白蛋白的国内生产厂家有石药集团、恒瑞集团、齐鲁制药以及科伦药业等。然而，紫杉醇在临床应用上的治疗效果因其疏水性、高毒性以及缺少靶向性等特点而使用受限；另外，作为一线抗癌药物，紫杉醇在包括乳腺癌患者等多种癌症患者中发现耐药现象，也是与治疗失败相关的主要死亡原因之一。目前主要的解决方案包括p糖蛋白(p-gp)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、依鲁替尼或如黄芩素、姜黄素等中药与紫杉醇联用来逆转紫杉醇的耐药性。因此开发紫杉醇耐药的抗肿瘤药物是目前急需解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种抗乳腺癌耐药的紫杉醇纳米材料及其制备方法与应用，其一可以改善紫杉醇水溶性差的缺点，提高其肿瘤累积性和生物利用度，避免其毒性；其二可以得到结构稳定，粒径可控的紫杉醇纳米材料。另外该纳米药物外连接透明质酸具有主动靶向乳腺癌细胞cd44受体的特性，提高药物在肿瘤中的蓄积。另外纳米药物中的ifsp可以利用铁死亡机制克服肿瘤细胞的紫杉醇耐药，从而对紫杉醇耐药的肿瘤也有治疗作用。
5.为达上述目的，本发明提供了一种抗乳腺癌耐药的紫杉醇纳米材料，包括药物递送载体以及装载于所述载体上的紫杉醇(ptx)和fsp1抑制剂(ifsp1)；所述载体为功能化透明质酸修饰的铁基金属有机框架(mil-100(fe))。
6.进一步地，紫杉醇的装载量为13～15％，fsp1抑制剂的装载量为2～4％。
7.进一步地，铁基金属有机框架为棱状晶体，其粒径为200～300nm。
8.进一步地，本发明还提供了一种抗乳腺癌耐药的紫杉醇纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)合成peg化透明质酸
10.将透明质酸溶液与nhs和edc混合，搅拌条件下加入nh
2-peg-nh2，反应结束后经透析、冻干，制得功能化透明质酸；
11.(2)负载紫杉醇与fsp1抑制剂
12.将铁基金属有机框架与紫杉醇和fsp1抑制剂共溶于有机溶液中，经离心、功能化透明质酸重悬后，制得纳米材料ha-peg-mil-100@ptx/ifsp1(hpm@pi)；
13.铁基金属有机框架与功能化透明质酸的质量比为1:2。
14.进一步地，透明质酸溶液的浓度为0.005g/ml，ph值为9.0，所述步骤(1)混合后的溶液中，透明质酸、nhs、edc和nh
2-peg-nh2的质量比为10:25～30:30～45:20。
15.进一步地，步骤(1)反应时间为24h，透析的条件为：mwco为3500da，透析时间为24h。
16.进一步地，铁基金属有机框架与紫杉醇和fsp1抑制剂的质量比为5:1:0.1～0.3。
17.进一步地，步骤(2)具体包括以下过程：
18.将铁基金属有机框架与紫杉醇和fsp1抑制剂共溶于有机溶液中，超声30min后于室温条件下搅拌至原溶液体积的1/4，滴加去离子水继续挥发后得到水溶液环境，并持续搅拌24h；
19.回收溶液并离心收集沉淀，采用功能化透明质酸重悬沉淀，持续搅拌24h，透析、冷冻干燥后制得。
20.进一步地，铁基金属有机框架通过以下方法制备得到：
21.将六水合氯化铁、氟化钾与硝酸加入水中，再加入均苯三甲酸混合均匀后，于120℃条件下反应24h，制得。
22.进一步地，六水合氯化铁、氟化钾、硝酸与均苯三甲酸摩尔质量比为3:3:3:2。
23.本发明还公开了上述抗乳腺癌耐药的紫杉醇纳米材料在制备(治疗)乳腺癌药物中的应用。
24.进一步地，乳腺癌为耐药性乳腺癌。
25.综上所述，本发明具有以下优点：
26.1、金属-有机框架材料(mofs)是一种配位聚合物，其具有可调节的孔径、高稳定的结构和高比表面积，使其在药物载体方面具有明显优势。拉瓦希尔骨架(mil)系列材料mil-100(fe)是mof中的一类，与其它金属离子相比没有毒性并且原料廉价易得，其在药物载体方面也表现出良好的载药性能、分子的可控释放性能和成像性能。因此本发明采用表面透明质酸修饰的mil-100(fe)作为药物递送载体，然后在载体上共载ptx和ifsp1组合成新型纳米药物，具有高靶向性，低毒性和高效抗癌等优点。
27.2、本发明制备的抗乳腺癌耐药的紫杉醇纳米材料，以功能化ha修饰的mil-100(fe)作为药物递送系统，可主动靶向乳腺癌细胞表面，提高药物在肿瘤细胞中的累积，提高药物吸收及药效。
28.3、本发明制备的抗乳腺癌耐药的紫杉醇纳米材料，具有生物相容性良好、高载药量、安全性好、肿瘤微环境响应等优点。
29.4、本发明制备含紫杉醇纳米材料在用于制备治疗乳腺癌药物时，即后续用于治疗乳腺癌时，在耐药型肿瘤细胞中可以释放紫杉醇和ifsp1，释放出来的药物分别通过凋亡和铁死亡途径协同杀死肿瘤细胞，包括对紫杉醇耐药的肿瘤细胞。
附图说明
30.图1为透射电子显微镜(tem)图，
31.其中，图1a为制备的mil-100(fe)的透射电子显微镜(tem)图，图1b为制备的hpm@pi的透射电子显微镜(tem)图；
32.图2为mil-100(fe)与hpm@pi的动态光散射(dls)图；
33.图3为mil-100(fe)与hpm@pi的电势分布图；
34.图4为ha-peg-nh2的红外光谱图；
35.图5为hpm@pi的紫外光谱图；
36.图6为hpm@pi的红外光谱图；
37.图7为检测hpm@pi药物ptx的高效液相(hplc)图和标准曲线；
38.图8为检测hpm@pi药物ifsp1的高效液相(hplc)图和标准曲线；
39.图9为ptx和ifsp1在不同gsh值环境中相对释放量；
40.图10为以mil-100(fe)为计量的不同浓度的hpm@pi在血液中的溶血率；
41.图11为不同浓度的hpm@pi对紫杉醇耐药细胞mda-mb-231/ptx毒性；
42.图12为在同一浓度下不同材料对紫杉醇耐药细胞mda-mb-231/ptx毒性；
43.图13为被罗丹明b染色后的hpm@pi、pm@pi给药紫杉醇耐药细胞mda-mb-231/ptx后的细胞吞噬情况；
44.图14为被罗丹明b染色后的hpm@pi分别给药紫杉醇耐药细胞株mda-mb-231/ptx和内皮细胞huvec后的细胞吞噬情况。
具体实施方式
45.以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
46.实施例1
47.本实施例提供了一种抗乳腺癌耐药的紫杉醇纳米材料，其通过以下方法制备得到：
48.(1)合成铁基金属有机框架
49.称取420mg(2mmol)均苯三甲酸(1，3，5-btc)，811mg(3mmol)六水合氯化铁(fecl3·
6h2o)，174mg(3mmol)氟化钾(kf)。
50.将不溶于水的btc先加入聚四氟乙烯内衬中。再将称取的fecl3·
6h2o、kf溶于20ml的水并滴加3mmol硝酸。
51.将该溶液加入内衬中与btc充分搅拌30min。将内衬移入水热合成反应釜中，放入120℃的烘箱中反应24h，得到橙色产物。
52.将得到的产物分别用50ml的水和50ml的无水乙醇洗涤三次。最后在50℃真空条件下干燥后得到橙色固体产物。
53.(2)合成peg功能化ha
54.将ha(10mg)、nhs(28.75mg)和edc(38.8mg)与2ml磷酸盐缓冲溶液(ph＝9)混合，在室温下搅拌30min。
55.然后在上述混合物中加入20mg nh
2-peg-nh2，再继续搅拌24h。
56.粗ha-peg-nh2通过透析(mwco：3500da)纯化24h。回收透析后的溶液经过冷冻干燥
得到白色颗粒状固体，即为peg功能化ha。
57.(3)共载紫杉醇和ifsp纳米药物
58.将10mg mil-100(fe)、2mg ptx和0.4mg ifsp1共溶于5ml甲醇溶液中。
59.经超声30min之后，置于室温环境下搅拌至原溶液体积的1/4，滴加去离子水继续挥发使其替换成水溶液环境并搅拌24h，回收溶液通过离心收集沉淀(10min，10000rpm)。
60.用10ml ha-peg-nh2水溶液(2mg/ml)重悬该沉淀并搅拌24h时，透析过夜(mwco：10000da)后回收溶液经冷冻干燥得橙色固体，即为纳米材料(药物)ha-peg-mil-100@ptx/ifsp1，缩写为hpm@pi。
61.实施例1步骤(1)得到的橙色固体产物其tem图与dls图如图1a和2所示，可以看出其棱状晶体形态，并且粒径为203nm左右，而电势为-41mv左右(图3)。
62.实施例1步骤(2)得到的白色颗粒状固体的红外图谱如图4所示，由酰胺键形成可以说明成功制备了peg功能化ha。
63.实施例1制得的hpm@pi的得tem图和dls如图1b和图2所示，可以看出，纳米药物hpm@pi呈不规则棱状形态，粒径在312nm左右。同时通过紫外光谱可以看出(图5)，hpm@pi纳米材料在280nm左右显现出ifsp1的特征峰，表明ifsp1负载成功。图6的红外结果显示hpm@pi组含有每组药物的特征红外峰，表明ptx得成功装载以及ha-peg-nh2连接成功。利用高效液相仪(hplc)测定纳米中所载药物质量，如图7和图8所示，载药率的计算公式：载药率(％)＝(装载上的ptx or ifsp1重量)/(纳米药物总重量)
×
100。
64.通过计算得到ptx载药率为13.8％，ifsp1载药率为2.3％。
65.实施例2
66.本实施例提供了一种抗乳腺癌耐药的紫杉醇纳米材料，其通过以下方法制备得到：
67.(1)合成铁基金属有机框架
68.称取420mg(2mmol)均苯三甲酸(1，3，5-btc)，811mg(3mmol)六水合氯化铁(fecl3·
6h2o)，174mg(3mmol)氟化钾(kf)。
69.将不溶于水的btc先加入聚四氟乙烯内衬中。再将称取的fecl3·
6h2o、kf溶于20ml的水并滴加3mmol硝酸。
70.将该溶液加入内衬中与btc充分搅拌30min。将内衬移入水热合成反应釜中，放入120℃的烘箱中反应24h，得到橙色产物。
71.将得到的产物分别用50ml的水和50ml的无水乙醇洗涤三次。最后在50℃真空条件下干燥后得到橙色固体产物。
72.(2)合成peg功能化ha
73.将ha(10mg)、nhs(30mg)和edc(40mg)与2ml磷酸盐缓冲溶液(ph＝9)混合，在室温下搅拌30min。
74.然后在上述混合物中加入20mg nh
2-peg-nh2，再继续搅拌24h。
75.粗ha-peg-nh2通过透析(mwco：3500da)纯化24h。回收透析后的溶液经过冷冻干燥得到白色颗粒状固体，即为peg功能化ha。
76.(3)负载
77.将10mg mil-100(fe)、2mg ptx和0.5mg ifsp1共溶于5ml甲醇溶液中。
78.经超声30min之后，置于室温环境下搅拌至原溶液体积的1/4，滴加去离子水继续挥发使其替换成水溶液环境并搅拌24h，回收溶液通过离心收集沉淀(10min，10000rpm)。
79.用10ml ha-peg-nh2水溶液(2mg/ml)重悬该沉淀并搅拌24h时，透析过夜(mwco：10000da)后回收溶液经冷冻干燥得橙色固体，即为纳米药物ha-peg-mil-100@ptx/ifsp1，缩写为hpm@pi。
80.本实施例中，ptx载药率为14.1％，ifsp1载药率为3.0％。
81.实施例3
82.本实施例提供了一种抗乳腺癌耐药的紫杉醇纳米材料，其通过以下方法制备得到：
83.(1)合成铁基金属有机框架
84.称取420mg(2mmol)均苯三甲酸(1，3，5-btc)，811mg(3mmol)六水合氯化铁(fecl3·
6h2o)，174mg(3mmol)氟化钾(kf)。
85.将不溶于水的btc先加入聚四氟乙烯内衬中。再将称取的fecl3·
6h2o、kf溶于20ml的水并滴加3mmol硝酸。
86.将该溶液加入内衬中与btc充分搅拌30min。将内衬移入水热合成反应釜中，放入120℃的烘箱中反应24h，得到橙色产物。
87.将得到的产物分别用50ml的水和50ml的无水乙醇洗涤三次。最后在50℃真空条件下干燥后得到橙色固体产物。
88.(2)合成peg功能化ha
89.将ha(10mg)、nhs(25.6mg)和edc(40.2mg)与2ml磷酸盐缓冲溶液(ph＝9)混合，在室温下搅拌30min。
90.然后在上述混合物中加入20mg nh
2-peg-nh2，再继续搅拌24h。
91.粗ha-peg-nh2通过透析(mwco：3500da)纯化24h。回收透析后的溶液经过冷冻干燥得到白色颗粒状固体，即为peg功能化ha。
92.(3)负载
93.将10mg mil-100(fe)、2mg ptx和0.6mg ifsp1共溶于5ml甲醇溶液中。
94.经超声30min之后，置于室温环境下搅拌至原溶液体积的1/4，滴加去离子水继续挥发使其替换成水溶液环境并搅拌24h，回收溶液通过离心收集沉淀(10min，10000rpm)。
95.用10ml ha-peg-nh2水溶液(2mg/ml)重悬该沉淀并搅拌24h时，透析过夜(mwco：10000da)后回收溶液经冷冻干燥得橙色固体，即为纳米药物ha-peg-mil-100@ptx/ifsp1，缩写为hpm@pi。
96.本实施例中，ptx载药率为13.2％，ifsp1载药率为2.4％。
97.试验例1
98.采用实施例1中得到的hpm@pi，将此纳米药物，为了评估纳米药物中ptx与ifsp1的gsh响应的释放特性。
99.将此纳米药物配制成水溶液，分别将1ml样品装于mwco为1000da的透析袋中。然后，将透析袋在含或不含gsh条件(2，4，8mm)下浸入正常ph环境中(ph＝7.4)，并在37℃下摇动。用hplc法测量不同时间间隔内透析袋外1ml缓冲液中ptx和ifsp1含量。
100.如图9所示，在同一时间间隔内，随着gsh浓度增加，ptx和ifsp1的释放量增加。在
同一ph环境溶液下，gsh会增加纳米药物释放的ptx和ifsp1。
101.试验例2
102.采用实施例1中得到的hpm@pi，检测该纳米药物的溶血反应。采用眼球采血法从健康小鼠中取得全血，收集在含柠檬酸钠的抗凝管中，均匀摇晃后离心(3000rpm，15min)得到红细胞。将稀释至5％的红细胞溶液分别与1％的曲拉通x-100(trionx-100)、不同浓度(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml)的纳米药物共孵育12h，再离心(3000rpm，15min)。酶标仪检测在405nm的吸光度。检测该纳米药物在不同介质(h2o、pbs、dmem、rpmi-1640和plasma)中的稳定性。如图10所示，hpm@pi材料的溶血程度与纳米材料的浓度呈正相关，但在即使最高给药浓度中溶血率也较低，表明hpm@pi具有良好的生物相容性。
103.试验例3
104.本试验例以及以下试验例所用到的mda-mb-231/ptx细胞均为紫杉醇耐药细胞。
105.将mda-mb-231/ptx细胞接于96孔板使每孔约含4
×
103个细胞，培养12h，按0，2.5，5，10，20，40μg ml-1
的ptx浓度给药hpm@pi于mda-mb-231/ptx细胞，继续培养24h，用pbs洗涤，加入不含胎牛血清(fbs)的cck-8检测液(v/v:10％)，在37℃下再培养1-2h后检测，用酶标分析仪于450nm处测定细胞活力。如图11所示，hpm@pi对耐药细胞株mda-mb-231/ptx有杀伤作用，毒性呈浓度依赖性递增。
106.将mda-mb-231/ptx细胞接于96孔板使每孔约含4
×
103个细胞，培养12h，按20μg ml-1
的ptx和3.3μg ml-1
的ifsp1浓度给予不同药物(ptx，hpm@ptx，hpm@ifsp1，hpm@pi)，继续培养24h，用pbs洗涤，加入不含胎牛血清(fbs)的cck-8检测液(v/v:10％)，在37℃下再培养1-2h后检测，用酶标分析仪于450nm处测定细胞活力。结果如图12所示，在相同浓度下与ptx相比，hpm@pi对耐药细胞株mda-mb-231/ptx的杀伤作用更强。
107.试验例4
108.将mda-mb-231/ptx细胞接于共聚焦皿使每皿约含2
×
103个细胞，培养12h，用pbs洗涤后，被罗丹明b标记后的hpm@pi、pm@pi给药12h，用pbs洗涤，加入dapi对细胞染色，用pbs洗涤染液，使用共聚焦显微镜检测。
109.将mda-mb-231/ptx细胞与huvec细胞接于共聚焦皿使每皿约含2
×
103个细胞，培养12h，用pbs洗涤后，被罗丹明b标记后的hpm@pi给药12h，用pbs洗涤，加入dapi对细胞染色，用pbs洗涤染液，使用共聚焦显微镜检测。
110.如图13所示，hpm@pi与pm@pi分别给药肿瘤细胞后的有显著荧光差异，说明hpm@pi更容易被细胞内化；而hpm@pi给药不同细胞后，正常细胞相比癌细胞表现出更明显的荧光强度(图14)，以上可以成功证明ha对肿瘤细胞的靶向性。
111.虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。