一种抑菌复合物及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一种抑菌复合物及其应用。


背景技术：

2.湿米粉、湿粉条等米面和淀粉制品，是广东居民日常喜爱的主食之一，而广东夏秋季节高温潮湿，米面和淀粉制品较易受到细菌的污染在不超过12小时就导致腐败变质，尤其是污染了唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的米面制品，若食用则可能引发中毒死亡。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌是污染酵米面制品的主要食源性致病菌之一，部分菌株能产生可致人中毒且具有极高致死率的毒素米酵菌酸。米酵菌酸是一种具有较强生物活性的毒素，随被污染的食物进入人体后可引起神经系统、消化系统及泌尿系统的损伤，临床症状表现为恶心、呕吐、腹胀、腹痛等，严重者出现黄疸、腹水、皮下出血、惊厥、血尿、血便等肝脑肾实质性器官损害症状。
3.脱氢乙酸及其钠盐，对霉菌、酵母菌和细菌均有很好的抑制作用，广泛应用于饮料、食品、饲料的加工业，其作用机理是有效渗透到细胞体内，抑制微生物的呼吸作用从而达到防腐防霉保鲜作用。然而，脱氢乙酸及其钠盐是属于低毒的食品防霉、防腐保鲜剂，超过规定限量对人体是有危害的，目前国外发达国家都不再使用或者在压缩其使用范围。米面和淀粉制品属于主食类食品，食用量大，脱氢乙酸的摄入容易造成毒素在人体内的累积。所以自2022年3月起，广东省开始实施食品安全地方标准《湿米粉生产和经营卫生规范》，湿米粉制品及湿粉条淀粉类制品中不得使用脱氢乙酸。
4.因此，如何有效控制唐菖蒲伯克霍尔德氏菌生长、防止米酵菌酸的产生、延长湿米粉等食品的保存时间，同时还符合法律法规对食品安全的要求，已成为本行业技术人员亟需解决的问题，对于保障我国食品安全和维护国家经济利益具有重要的社会意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种抑菌复合物及其应用，该复合物能有效控制唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生长，同时解决现有湿米粉在高温潮湿条件下不易保存的技术问题，还有效抑制湿米粉上常见的污染菌如蜡样芽胞杆菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌等。
6.本发明的目的是提供一种抑菌复合物。
7.本发明另一目的是提供抑菌复合物的应用。
8.本发明又一目的是提供一种湿米粉防腐保鲜的方法。
9.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
10.本发明提供一种抑菌复合物，包括乳清发酵粉和/或葡萄糖氧化酶，优选地还包括葡萄糖酸内酯。研究显示本发明的抑菌复合物能够显著抑制唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，同时对其他食源性致病细菌如蜡样芽孢杆菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌都有较好的抑制效果；将该复合物添加至湿米粉等食品中使用，满足食品行业标准对微生物污染的检测要求，能够延长湿米粉货架期，起到防腐保鲜的作用。
11.进一步地，抑菌复合物包含以下重量份的组分：20～100份乳清发酵粉、30～100份葡萄糖氧化酶、10～40份葡萄糖酸内酯。其制备方法为：将各组分按重量份数称量，过筛，混合即得。
12.优选地，过筛目数≥60目。
13.本发明提供抑菌复合物在湿米粉防腐保鲜、在制备食品防腐保鲜剂、在制备抑菌剂或食源性致病细菌抑菌剂中的应用。
14.优选地，所述菌为：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
15.本发明还提供一种湿米粉防腐保鲜的方法，添加上述抑菌复合物；具体地为在湿米粉的制浆过程中，按米浆重量添加抑菌复合物与其搅拌均匀后，蒸煮成品即可。
16.优选地，复合物添加量为0.1％～0.2％。
17.更优选地，上述米粉为纯米粉、含淀粉的米粉或杂粮米粉。
18.本发明具有以下有益效果：
19.本发明提供一种抑菌复合物及其应用，研究显示本发明提供的抑菌复合物能够显著抑制唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，同时对其他食源性致病细菌如蜡样芽孢杆菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌都有较好的抑制效果，添加至食品中使用能够满足食品行业标准对微生物污染的检测要求；将该复合物用于湿米粉等食品的制备中，不仅能够显著抑制病原菌，还能够起到很好防腐保鲜作用，延长湿米粉的保质时间，并随着复合物添加量的增加，时间延长得更久。本发明提供的抑菌复合物比常用的防腐保鲜剂nisin、脱氢乙酸钠以及山梨酸钾的抑菌效果更好，且能够替代脱氢乙酸钠使用，其性能稳定，耐高温，成分天然、安全，用于食品加工工艺不会影响其抑菌功能，与食物原味有良好的适配性。同时也为湿米粉的防腐保鲜，延长货架期提供了一种新型、天然、安全的方案。
附图说明
20.图1为抑菌复合物对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的抑菌效果图；
21.图2为抑菌复合物对蜡样芽孢杆菌的抑菌效果图；
22.图3为抑菌复合物对大肠埃希氏菌的抑菌效果图；
23.图4为抑菌复合物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图；
24.图5为湿米粉接种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在24小时测定菌数的平板情况图；
25.图6为湿米粉接种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在48小时测定菌数的平板情况图；
26.图7为唐菖蒲伯克霍尔德式菌不同接菌量的湿米粉48小时的感官变化情况结果图；
27.图8为湿米粉在不同时间段的感官性状评价结果图；
28.图9为湿米粉在不同时间段的菌落总数测定平板结果图；
29.图10为复合物中单一组分对唐菖蒲伯克霍尔德菌的抑菌效果图；
30.图11为不同组分复合物对唐菖蒲伯克霍尔德菌的抑菌效果图；
31.图12为不同组分配比复合物对唐菖蒲伯克霍尔德菌的抑菌效果图。
具体实施方式
32.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
33.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
34.实施例1抑菌复合物
35.1、抑菌复合物，由如下成分组成：乳清发酵粉50重量份、葡萄糖酸内酯30重量份，葡萄糖酸内酯20重量份。
36.2、抑菌复合物的制备：
37.1)在净化车间内分别对乳清发酵粉、葡萄糖氧化酶和葡萄糖酸内酯进行称量，并精确到小数点后一位数；
38.2)将称量后的乳清发酵粉、葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸内酯过筛，且过筛目数≥60目；
39.3)将过筛后的乳清发酵粉、葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸内酯经过v型混合机在500转下混合20分钟；
40.4)将混合后的复合物经自动化传送带进行密封包装。
41.实施例2抑菌复合物
42.1、抑菌复合物，由如下成分组成：乳清发酵粉30重量份、葡萄糖酸内酯50重量份，葡萄糖酸内酯20重量份。
43.2、抑菌复合物的制备：
44.1)在净化车间内分别对乳清发酵粉、葡萄糖氧化酶和葡萄糖酸内酯进行称量，并精确到小数点后一位数；
45.2)将称量后的乳清发酵粉、葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸内酯过筛，且过筛目数≥60目；
46.3)将过筛后的乳清发酵粉、葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸内酯经过v型混合机在500转下混合20分钟；
47.4)将混合后的复合物经自动化传送带进行密封包装。
48.实施例3抑菌复合物
49.1、抑菌复合物，由如下成分组成：乳清发酵粉20重量份，葡萄糖氧化酶60重量份，葡萄糖酸内酯20重量份。
50.2、抑菌复合物的制备：
51.1)在净化车间内分别对乳清发酵粉、葡萄糖氧化酶和葡萄糖酸内酯进行称量，并精确到小数点后一位数；
52.2)将称量后的乳清发酵粉、葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸内酯过筛，且过筛目数≥60目；
53.3)将过筛后的乳清发酵粉、葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸内酯经过v型混合机在500转下混合20分钟；
54.4)将混合后的复合物经自动化传送带进行密封包装。
55.实施例4抑菌复合物的抑菌测试
56.1、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌抑菌测试
57.实验菌株：采用唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，购于中国工业微生物菌种保藏中心，编号cicc10574。
58.实验方法：采用实施例3制备的复合物，选用琼脂稀释法制备含1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，5mg/ml复合物的营养琼脂，以不添加复合物的平板为空白对照组，在平板上接种103cfu/ml，105cfu/ml，107cfu/ml的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌液0.1ml，涂布均匀，30℃培养48小时，观察各平板上唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生长情况。
59.实验结果：使用抑菌复合物对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的抑菌效果如图1所示，具体统计结果如下表1所示，本发明的抑菌复合物对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌具有非常好的抑菌作用，抑制率达100％。
60.表1复合物对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的抑菌效果统计
[0061][0062]
2、蜡样芽孢杆菌抑菌测试
[0063]
实验菌株：采用蜡样芽孢杆菌，购于中国工业微生物菌种保藏中心，编号cicc21261。
[0064]
实验方法：采用实施例3制备的复合物，选用琼脂稀释法制备含0.8mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml复合物的营养琼脂，以不添加复合物的平板为空白对照组，同时分别设置对照：在平板添加常用的防腐保鲜剂0.3mg/ml nisin、1mg/ml脱氢乙酸钠、1mg/ml山梨酸钾；接着分别在板上接种103cfu/ml，104cfu/ml，105cfu/ml的蜡样芽孢杆菌液1ml，倾注培养基混合均匀，36℃培养48小时，观察各平板上蜡样芽孢杆菌的生长情况。
[0065]
实验结果：使用抑菌复合物对蜡样芽孢杆菌的抑菌效果如图2所示，具体统计结果如下表2所示，本发明的抑菌复合物对蜡样芽孢杆菌具有非常好的抑菌作用，当蜡样芽孢杆菌的接菌量在104cfu以下时，抑菌复合物添加量大于等于1mg/ml对该菌的生长抑制率达100％，当接菌量在105cfu以上时，抑菌复合物添加量1mg/ml对该菌的生长抑制率达99.96％。
[0066]
表2复合物对蜡样芽孢杆菌的抑菌效果统计
[0067]
[0068]
3、大肠埃希氏菌抑菌测试
[0069]
实验菌株：采用大肠埃希氏菌，购于广东省微生物菌种保藏中心，编号：gdmcc1.176。
[0070]
实验方法：采用实施例3制备的复合物，选用琼脂稀释法制备含0.8mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，5mg/ml复合物的营养琼脂，以不添加复合物的平板为空白对照组，同时分别设置对照：在平板添加常用的防腐保鲜剂0.3mg/ml nisin、1mg/ml脱氢乙酸钠、1mg/ml山梨酸钾；接着分别在平板上接种105cfu/ml，106cfu/ml的大肠埃希氏菌液1ml，倾注培养基混合均匀，36℃培养48小时，观察各平板上大肠埃希氏菌的生长情况。
[0071]
实验结果：使用抑菌复合物对大肠埃希氏菌的抑菌效果如图3所示，具体统计结果如下表3所示，本发明的抑菌复合物对大肠埃希氏菌具有非常好的抑菌作用，当大肠埃希氏菌的接菌量小于等于106cfu时，抑菌复合物添加量大于等于1mg/ml对该菌的生长抑制率达100％。
[0072]
表3复合物对大肠埃希氏菌的抑菌效果统计
[0073][0074]
4、金黄色葡萄球菌
[0075]
实验菌株：采用金黄色葡萄球菌金黄色亚种，购于广东省微生物菌种保藏中心，编号：gdmcc 11220。
[0076]
实验方法：采用实施例3制备的复合物，选用琼脂稀释法制备含0.8mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，5mg/ml复合物的营养琼脂，以不添加复合物的平板为空白对照组，同时分别设置对照：在平板添加常用的防腐保鲜剂在0.3mg/ml nisin、1mg/ml脱氢乙酸钠、1mg/ml山梨酸钾；接着分别在平板上接种104cfu/ml，105cfu/ml的金黄色葡萄球菌液1ml，倾注培养基混合均匀，36℃培养48小时，观察各平板上金黄色葡萄球菌的生长情况。
[0077]
实验结果：使用抑菌复合物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果如图4所示，具体统计结果如下表4所示，本发明的抑菌复合物对金黄色葡萄球菌具有非常好的抑菌作用，当金黄色葡萄球菌的接菌量小于或等于105cfu时，抑菌复合物添加量为1mg/ml对该菌的生长抑制率达到99.99％。
[0078]
表4复合物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果统计
[0079][0080]
综上抑菌检测结果可知，本发明提供的抑菌复合物在添加量1mg/ml时，对湿米粉
上常见的食源性致病菌的抑菌率达99.95％以上。
[0081]
实施例5抑菌复合物应用于湿米粉上对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的抑菌测试
[0082]
本实施例参考广东省食品安全地方标准dbs44/017-2021中规定湿米粉产品在非低温(大于10℃)条件下保质期为24小时，本实验中湿米粉的监测条件为36℃恒温48小时，采用实施例3制备的抑菌复合物。
[0083]
实验菌株：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，购于中国工业微生物菌种保藏中心，编号cicc10574。
[0084]
实验方法：模拟湿米粉企业的生产工艺蒸煮湿米粉，后续进行高压灭菌，在杀灭湿米粉自身杂菌的情况下，主动接种一定数量的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，测试添加了抑菌复合物的湿米粉是否对该菌有抑制作用。具体实验设计以及生产工艺详见下表：
[0085][0086]
湿米粉接种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在24小时测定菌数的平板情况图如图5所示，具体菌数统计结果如下表5所示，在36℃条件下培养24小时，空白未添加复合物的湿米粉菌数增长迅速，而添加抑菌复合物的湿米粉菌数测定值均小于10cfu/g。
[0087]
表5湿米粉接种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在36℃培养24小时后的菌数检测
[0088][0089]
湿米粉接种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在48小时测定菌数的平板情况图如图6所示，
因湿米粉样品10-1
，10-2
稀释梯度含有大量的粉粒状物，在培养基上影响对菌落的判断，因此菌落数测定时在培养基加入了ttc显色剂。具体菌数统计结果如下表6所示，在36℃条件下培养48小时，空白未添加复合物的湿米粉菌数在持续增长，而添加抑菌复合物的湿米粉菌数测定值仍保持小于10cfu/g。
[0090]
表6湿米粉接种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在36℃培养48小时后的菌数检测
[0091][0092]
湿米粉接菌后48小时的感官变化如图7所示，显示在被唐菖蒲伯克霍尔德氏菌污染的湿米粉中，空白添加的湿米粉因为菌的生长繁殖，在湿米粉表面形成密集的菌落并产生黄色的色素，湿米粉从亮白色变成了黄色。而添加复合物的湿米粉因为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生长受到抑制，湿米粉仍表现为初始的亮白色。
[0093]
以上结果表明，抑菌复合物在湿米粉中应用，在0.1％及以上的添加量能有效抑制唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生长，与在培养基上的抑菌测试结果一致。实例6抑菌复合物在湿米粉上的防腐保鲜效果测试
[0094]
本实施例参考广东省食品安全地方标准dbs44/017-2021中规定湿米粉产品在非低温(大于10℃)条件下保质期为24小时，本实验中湿米粉的监测条件为36℃恒温48小时，采用实施例3制备的抑菌复合物。具体试验方法和条件设置见下表：
[0095][0096]
湿米粉在不同时间段的感官性状评价结果如图8所示，显示抑菌复合物添加量在0.1％及以上的湿米粉在保存38小时后，颜色、气味、粉型等感官性状仍保持良好，比空白添加的湿米粉明显延长了24小时以上。对湿米粉菌落总数测定结果如图9所示，具体统计结果
见表7所示，在36℃条件下，空白添加的湿米粉保存14小时，其菌落总数已超过标准规定的微生物限量要求，而湿米粉防腐保鲜复合物添加量在0.1％及以上的湿米粉，24小时的菌落总数仍低于标准规定的微生物限量要求，且比添加脱氢乙酸钠0.1％的湿米粉菌落总数明显要低。
[0097]
表7不同时间段的湿米粉菌落总数测定值
[0098][0099]
注：菌落总数单位(cfu/g)；“/”表示样品感官明显变质，不做菌数测定。
[0100]
综上表明，添加了抑菌复合物的湿米粉在感官性状和菌落总数的变化比空白未添加的湿米粉保质时间延长，并随着复合物添加量的增加，时间延长得更久。添加0.1％复合物的湿米粉比添加脱氢乙酸钠的湿米粉保质效果更佳。
[0101]
对比例1
[0102]
抑菌复合物的制备同实施例1，唯一区别在于，复合物的组分只含有乳清发酵粉100份。
[0103]
对比例2
[0104]
抑菌复合物的制备同实施例1，唯一区别在于，复合物的组分只含有葡萄糖氧化酶100份。
[0105]
对比例3
[0106]
抑菌复合物的制备同实施例1，唯一区别在于，复合物的组分只含有葡萄糖酸内酯100份。
[0107]
对比例4
[0108]
抑菌复合物的制备同实施例1，唯一区别在于，复合物的组分只含有乳清发酵粉70份和葡萄糖氧化酶30份。
[0109]
对比例5
[0110]
抑菌复合物的制备同实施例1，唯一区别在于，复合物的组分只含有乳清发酵粉30份和葡萄糖氧化酶70份。
[0111]
对比例6
[0112]
抑菌复合物的制备同实施例1，唯一区别在于，复合物的组分只含有乳清发酵粉100份和葡萄糖酸内酯20份或30份或40份。
[0113]
对比例7
[0114]
抑菌复合物的制备同实施例1，唯一区别在于，复合物的组分只含有葡萄糖氧化酶100份和葡萄糖酸内酯20份或30份或40份。
[0115]
对比例8
[0116]
抑菌复合物的制备同实施例1，唯一区别在于，复合物的组分只含有乳清发酵粉90份和葡萄糖酸内酯10份。
[0117]
对比例9
[0118]
抑菌复合物的制备同实施例1，唯一区别在于，复合物的组分只含有葡萄糖氧化酶90份和葡萄糖酸内酯10份。
[0119]
将上述对比例1～9制备的抑菌复合物对唐菖蒲伯克霍尔德菌进行抑菌测试，具体方法同实施4中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌抑菌测试。其中，对比例1～3单一组分的复合物的抑菌结果如图10所示，具体统计结果见表8所示，显示单一组分乳清发酵粉和葡萄糖氧化酶在添加量为0.1％时对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的抑菌率均小于50％，而葡萄糖酸内酯不同添加量均与空白对照无差异，未见抑菌效果。
[0120]
表8复合物中单一组分对唐菖蒲伯克霍尔德式菌的抑菌效果统计
[0121][0122][0123]
对比例4～9两两组分的复合物的抑菌结果如图11所示，具体统计结果见表9所示，显示在相同的添加量条件下，采用乳清发酵粉与葡萄糖氧化酶的复合物均比单一组分的复合物抑菌效果好；且在乳清发酵粉与葡萄糖氧化酶复合物中，高比例的葡萄糖氧化酶组合抑菌效果优于高比例的乳清发酵粉组合；单一组分葡萄糖酸内酯在0.02％-0.04％添加量时，均未见抑菌效果，但与乳清发酵粉或葡萄糖氧化酶组合后，随着葡萄糖酸内酯量的增加，其组合的抑菌能力也在增强，显示葡萄糖酸内酯对抑菌有增效作用。
[0124]
表9不同组分复合物对唐菖蒲伯克霍尔德菌的抑菌效果统计
[0125][0126]
而采用本发明实施例1～3制备得到的抑菌复合物对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的抑菌率结果如图12所示，具体统计结果见表10，显示本发明提供的复合物具有显著的抑菌效果，在添加0.1％的复合物对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的抑菌率能达到100％。
[0127]
表10不同组分配比复合物对唐菖蒲伯克霍尔德菌的抑菌效果统计
[0128][0129]
综上，本发明提供的抑菌复合物能够显著抑制唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，同时对其他食源性致病细菌如蜡样芽孢杆菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌都有较好的抑制效果，满足食品行业标准对微生物污染的检测要求；将该复合物用于湿米粉的制备中，不仅能够显著抑制病原菌，还能够起到很好防腐保鲜作用，延长湿米粉的保质时间，并随着复合物添加量的增加，时间延长得更久。本发明提供的抑菌复合物的抑菌保鲜防腐效果显著优于常用的防腐保鲜剂nisin、脱氢乙酸钠以及山梨酸钾，且能够替代脱氢乙酸钠使用，其性能稳定，耐高温，成分天然、安全，用于食品加工工艺不会影响其抑菌功能，与食物原味有良好的适配性。为湿米粉的防腐保鲜，延长货架期提供了一种新型、天然、安全的方案。
[0130]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。