一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法与流程

1.本发明涉及毒素快检技术领域，尤其涉及一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法。


背景技术：

2.真菌毒素是一类由真菌产生的次级代谢产物，对脊椎动物和其他生物具有毒性作用，丝状真菌可产生上千种有毒成分，其中最重要的为曲霉属真菌、镰刀菌属和青霉菌属(moss，1996)，目前在已鉴定出的400余种真菌毒素中,最受毒理学和立法机构关注的有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、单端孢霉烯族毒素(伏马毒素、呕吐毒素、t-2毒素、ht-2毒素、二乙酰镳草镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮)，展青毒素、橘霉素和麦角碱，真菌毒素污染范围广，主要污染谷物、干果、红酒、牛奶、咖啡豆、可可粉、肉类等农产品，这些农产品大多数为发展中国家的基本经济作物。
3.真菌毒素标准检测方法通常是在经过认证的实验室采用精密仪器，如高效液相色谱-荧光或者高效液相色谱-质谱等，这些方法虽然能够提供准确的检测结果，但设备昂贵，时间成本高、且需专业技术人员，而目前真菌毒素污染态势逐渐加重，污染常常发生在种植、收获、储藏、运输、加工等各个环节，仅通过大型仪器实现对农产品中真菌毒素污染情况进行有效监控难度较大，为保证农产品从田间到餐桌的安全，阻止真菌毒素进入食物链，亟需低成本小型仪器和快速检测方法用于产前、产中、产后各环节的毒素筛查与监测,基于分子识别生物传感器及传感方法是目前在食品安全快速检测领域备受关注的研究方向之一。
4.所以，需要设计一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法来解决上述问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法，包括以下步骤：
8.s1、准备快检器材与试剂；
9.s2、伏马毒素完全抗原的合成；
10.s3、伏马毒素的动物免疫与杂交瘤细胞的制备；
11.s4、伏马毒素阳性杂交瘤筛选方法；
12.s5、伏马毒素抗体的生产；
13.s6、伏马毒素的酶联免疫吸附方法的建立；
14.s7、纳米金探针的制备；
15.s8、灰度成像纳米金试纸条的检测。
16.作为本发明的一种优选技术方案，所述快检器材包括眼科用剪刀、镊子、200目尼龙细胞过滤筛网、玻璃吸管、针头、吸水纸、无菌一次性六孔细胞培养板、无菌培养皿、血球
计数板；所述试剂包括醋酸盐缓冲溶液、pbs缓冲溶液、四氯金酸缓冲溶液、柠檬酸三钠溶液、碳酸钾溶液与标记封闭液。
17.作为本发明的一种优选技术方案，所述伏马毒素完全抗原的合成采用戊二醛法合成fb-bsa及fb-ova，步骤如下:将摩尔浓度为15mmol/l的bsa蛋白溶液与0.738mmol/l的fb,溶液混合在pbs缓冲液(0.01moll)中，搅拌状态下逐滴加入浓度为2％(v/v)的戊二醛溶液，室温反应1h，向混合溶液中加入硼氢化纳还原剂，还原未反应完的醛基，最后得到透明溶液，用pbs溶液透析三天，10000pm离心20min，收集上清，测定浓度，fb-ova的制备方法同fb-bsa。
18.作为本发明的一种优选技术方案，所述伏马毒素的动物免疫与杂交瘤细胞的制备的步骤如下：(1)将100ug的fb,-bsa溶于0.2ml灭菌的0.85％nac1溶液中，用等体积的弗氏佐剂乳化后多点注射于小鼠背部皮下；(2)两周后，用100ug的fb-bsa与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，注射于小鼠腹部，随后每隔两周对小鼠进行一次免疫，共免疫四次；(3)从第三次免疫开始，免疫一周后取小鼠尾部静脉血，采用elisa方法对小鼠血清效价和特异性进行检测；(4)在第四次免疫后，细胞融合前3天对小鼠血清滴度和灵敏度最高的小鼠进行冲刺免疫，(5)在无菌条件下，将滴度最高、特异性最好的小鼠脾脏取出，将脾细胞(1
×
108〉和新分离的sp2/0骨髓瘤细胞(1
×
107)在50％peg1450下进行融合；(6)将融合后的杂交瘤细胞在选择性半固体完全培养基中培养，两周后，将半固体培养基中的单个细胞克隆转移到96孔液体培养基中，采用竞争elisa方法对细胞上清液进行测定，将阳性克隆继续用96孔细胞培养板进行传代培养,继续采用竞争elisa方法进行淘选,逐轮降低fb,标准品浓度，筛选出可灵敏识别靶标物的阳性杂交瘤细胞株。
19.作为本发明的一种优选技术方案，所述伏马毒素阳性杂交瘤筛选方法的步骤如下：(1)采用包被液稀释fb-ova到适当浓度,在酶标孔中每孔加入100ul,37℃孵育2h,pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(2)采用4％的脱脂奶粉﹐每个酶标孔加入200ul进行封闭,37℃孵育1h,pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(3)将血清采用pbs稀释成系列浓度，50ul与pbs混合加入微孔，读取的吸光值记为boo另外50ul与一定浓度的fb混合加入另外一个微孔，读取的吸光值记为b，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(4)将hrp-羊抗鼠igg稀释为1:5000倍，加入酶标孔中，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(5)加入显色液和终止液，37℃孵育10min，加入终止液终止反应；(6)将酶标仪测定波长调成450nm，测定od值，选择1-b/b,》0.5作为阳性杂交瘤。
20.作为本发明的一种优选技术方案，所述伏马毒素抗体的生产步骤如下:(1)选用8周龄雌性balb/c小鼠，将弗氏不完全佐剂注射入小鼠腹腔，三天后，将浓度为10
°
的杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔；(2)7-10天后，采用注射器抽取的方式，将腹部胀满的小鼠腹水抽出，6000rpm，10min离心，收集上清，用辛酸硫酸铵法进行纯化；(3)将纯化好的抗体溶液采用pbs进行透析，冻干成粉末状进行分装低温保存。
21.作为本发明的一种优选技术方案，所述伏马毒素的酶联免疫吸附方法的建立的步骤如下：(1)采用棋盘法采用包被液将fb-ova稀释成系列浓度(1:10000,1:20000,1:40000,1:80000),100ul/孔，37℃孵育2h，pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(2)采用4％的脱脂奶粉，每个酶标孔加入200ul进行封闭，37℃孵育1h,pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(3)不同浓度的fb标准品，100ul/孔依次加入96孔酶标板，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(4)将
hrp-羊抗鼠igg稀释1:5000倍，酶标孔37℃孵育1h，pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(5)加入显色液和终止液，37℃孵育10min，加入终止液终止反应；(6)将酶标仪测定波长调成450nm，测定od值。
22.作为本发明的一种优选技术方案，所述纳米金探针的制备采用柠檬酸三钠还原法制备了纳米金溶液(aunps)，取1ml1％(vlv)氯金酸溶液加入到装有99ml超纯水的玻璃瓶中，混匀，置于微波炉高火加热4min至沸腾；取出玻璃瓶摇匀，混合状态下快速加入2.4ml1％(m/v)柠檬酸三钠溶液，中高火继续加热4min，取出置于室温定容至100ml。
23.作为本发明的一种优选技术方案，所述灰度成像纳米金试纸条的检测的步骤如下：(1)样品前处理:将谷物称取20g，加入50％甲醇水(v:v＝1:1)提取液100ml，采用研磨机粉碎和提取同时进行2min，收集上清，取上清用pbs缓冲液进行稀释备用；(2)将稀释后的样品液用试纸条进行检测，37℃孵育10min，此时待测样品中的fb与检测线上的fb,-ova竞争结合fb,-igg-aunps上的结合位点；(3)数据的判读，两种方式:第一种是肉眼定性，检测限与阴性样品比颜色变浅说明是阳性样品，否则为阴性；第二种是定量，将层析好的试纸条放入单光谱成像仪进行检测，记下检测线上的信号值。
24.本发明所提出的多真菌毒素同步快检方法表明伏马毒素为迄今报道灵敏度最高，为快速检测技术提供了高质量核心生物识别材料，通过研究，核酸适配体可作为缺乏高亲和力抗体小分子靶标物识别材料的有效选择，在方法建立中需关注适配体结构的选择与样品基质的影响，单克隆抗体仍是目前快速检测技术识别材料的主流选择，纳米抗体在农产品快速检测方法应用中既具备单克隆抗体的高亲和力与特异性，又表现出了适配体的稳定与易于修饰的特性，重要的是纳米抗体可作为替代抗原建立无毒快速检测技术，也是其他识别材料无法替代的独有特性，在未来发展方向中，纳米抗体可通过体外亲和力定向改造与结构功能化进一步提高亲和力，拓展新的检测方法与检测模式，在农产品小分子危害物的快速检测领域发挥重要作用。
附图说明
25.图1为本发明提出的一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法的结构示意图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
27.参照图1，一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法，包括以下步骤：
28.s1、准备快检器材与试剂；
29.s2、伏马毒素完全抗原的合成；
30.s3、伏马毒素的动物免疫与杂交瘤细胞的制备；
31.s4、伏马毒素阳性杂交瘤筛选方法；
32.s5、伏马毒素抗体的生产；
33.s6、伏马毒素的酶联免疫吸附方法的建立；
34.s7、纳米金探针的制备；
35.s8、灰度成像纳米金试纸条的检测。
36.参照图1，快检器材包括眼科用剪刀、镊子、200目尼龙细胞过滤筛网、玻璃吸管、针头、吸水纸、无菌一次性六孔细胞培养板、无菌培养皿、血球计数板；试剂包括醋酸盐缓冲溶液、pbs缓冲溶液、四氯金酸缓冲溶液、柠檬酸三钠溶液、碳酸钾溶液与标记封闭液。
37.参照图1，伏马毒素完全抗原的合成采用戊二醛法合成fb-bsa及fb-ova，步骤如下:将摩尔浓度为15mmol/l的bsa蛋白溶液与0.738mmol/l的fb,溶液混合在pbs缓冲液(0.01moll)中，搅拌状态下逐滴加入浓度为2％(v/v)的戊二醛溶液，室温反应1h，向混合溶液中加入硼氢化纳还原剂，还原未反应完的醛基，最后得到透明溶液，用pbs溶液透析三天，10000pm离心20min，收集上清，测定浓度，fb-ova的制备方法同fb-bsa。
38.参照图1，伏马毒素的动物免疫与杂交瘤细胞的制备的步骤如下：(1)将100ug的fb,-bsa溶于0.2ml灭菌的0.85％nac1溶液中，用等体积的弗氏佐剂乳化后多点注射于小鼠背部皮下；(2)两周后，用100ug的fb-bsa与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，注射于小鼠腹部，随后每隔两周对小鼠进行一次免疫，共免疫四次；(3)从第三次免疫开始，免疫一周后取小鼠尾部静脉血，采用elisa方法对小鼠血清效价和特异性进行检测；(4)在第四次免疫后，细胞融合前3天对小鼠血清滴度和灵敏度最高的小鼠进行冲刺免疫，(5)在无菌条件下，将滴度最高、特异性最好的小鼠脾脏取出，将脾细胞(1
×
108〉和新分离的sp2/0骨髓瘤细胞(1
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107)在50％peg1450下进行融合；(6)将融合后的杂交瘤细胞在选择性半固体完全培养基中培养，两周后，将半固体培养基中的单个细胞克隆转移到96孔液体培养基中，采用竞争elisa方法对细胞上清液进行测定，将阳性克隆继续用96孔细胞培养板进行传代培养,继续采用竞争elisa方法进行淘选,逐轮降低fb,标准品浓度，筛选出可灵敏识别靶标物的阳性杂交瘤细胞株。
39.参照图1，伏马毒素阳性杂交瘤筛选方法的步骤如下：(1)采用包被液稀释fb-ova到适当浓度,在酶标孔中每孔加入100ul,37℃孵育2h,pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(2)采用4％的脱脂奶粉﹐每个酶标孔加入200ul进行封闭,37℃孵育1h,pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(3)将血清采用pbs稀释成系列浓度，50ul与pbs混合加入微孔，读取的吸光值记为boo另外50ul与一定浓度的fb混合加入另外一个微孔，读取的吸光值记为b，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(4)将hrp-羊抗鼠igg稀释为1:5000倍，加入酶标孔中，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(5)加入显色液和终止液，37℃孵育10min，加入终止液终止反应；(6)将酶标仪测定波长调成450nm，测定od值，选择1-b/b,》0.5作为阳性杂交瘤。
40.参照图1，伏马毒素抗体的生产步骤如下:(1)选用8周龄雌性balb/c小鼠，将弗氏不完全佐剂注射入小鼠腹腔，三天后，将浓度为10
°
的杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔；(2)7-10天后，采用注射器抽取的方式，将腹部胀满的小鼠腹水抽出，6000rpm，10min离心，收集上清，用辛酸硫酸铵法进行纯化；(3)将纯化好的抗体溶液采用pbs进行透析，冻干成粉末状进行分装低温保存。
41.参照图1，伏马毒素的酶联免疫吸附方法的建立的步骤如下：(1)采用棋盘法采用包被液将fb-ova稀释成系列浓度(1:10000,1:20000,1:40000,1:80000),100ul/孔，37℃孵育2h，pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(2)采用4％的脱脂奶粉，每个酶标孔加入200ul进行封闭，37℃孵育1h,pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(3)不同浓度的fb标准品，100ul/孔依次加入96孔酶标板，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(4)将hrp-羊抗鼠igg稀释1:5000倍，酶标孔37℃孵育1h，pbst洗涤3次，在滤纸上拍干；(5)加入显色液和终止液，37℃孵育
10min，加入终止液终止反应；(6)将酶标仪测定波长调成450nm，测定od值。
42.参照图1，纳米金探针的制备采用柠檬酸三钠还原法制备了纳米金溶液(aunps)，取1ml1％(vlv)氯金酸溶液加入到装有99ml超纯水的玻璃瓶中，混匀，置于微波炉高火加热4min至沸腾；取出玻璃瓶摇匀，混合状态下快速加入2.4ml1％(m/v)柠檬酸三钠溶液，中高火继续加热4min，取出置于室温定容至100ml。
43.参照图1，灰度成像纳米金试纸条的检测的步骤如下：(1)样品前处理:将谷物称取20g，加入50％甲醇水(v:v＝1:1)提取液100ml，采用研磨机粉碎和提取同时进行2min，收集上清，取上清用pbs缓冲液进行稀释备用；(2)将稀释后的样品液用试纸条进行检测，37℃孵育10min，此时待测样品中的fb与检测线上的fb,-ova竞争结合fb,-igg-aunps上的结合位点；(3)数据的判读，两种方式:第一种是肉眼定性，检测限与阴性样品比颜色变浅说明是阳性样品，否则为阴性；第二种是定量，将层析好的试纸条放入单光谱成像仪进行检测，记下检测线上的信号值。
44.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。