一种化合物在预防或治疗心脏疾病的药物中的用途的制作方法

1.本发明涉及一种化合物在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途。本发明还涉及一种药物组合物及其在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途。


背景技术：

2.式(i)化合物是现有技术中已知的化合物，且已知其具有抗肿瘤活性。
[0003][0004]
然而，本发明的发明人出人意料地发现，式(i)化合物对于心脏疾病、特别是心律失常具有很好的效果，能够满足预防和治疗的需要，从而完成了本发明。


技术实现要素：

[0005]
本发明的一个方面提供式(i)化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途。
[0006]
在一个实施方案中，所述式(i)化合物为式(ia)或式(ib)化合物(或其药学上可接受的盐)，或两者的混合物：
[0007][0008]
在一个实施方案中，所述式(i)化合物为式(ia)和式(ib)化合物(或其药学上可接受的盐)的混合物。以游离碱的重量计，所述式(ia)化合物或其药学上可接受的盐占所述式(ia)化合物或其药学上可接受的盐与式(ib)化合物或其药学上可接受的盐的总量的5重量％～95重量％，例如约5重量％、约10重量％、约15重量％、约20重量％、约25重量％、约30重量％、约35重量％、约40重量％、约45重量％、约50重量％、约55重量％、约60重量％、约65重量％、约70重量％、约75重量％、约80重量％、约85重量％、约90重量％、约95重量％。
[0009]
在一个实施方案中，所述式(i)化合物为式(ia)和式(ib)化合物(或其药学上可接受的盐)的混合物。以游离碱的重量计，所述式(ia)化合物或其药学上可接受的盐占所述式
(ia)化合物或其药学上可接受的盐与式(ib)化合物或其药学上可接受的盐的总量的约30重量％～90重量％，优选约40重量％～80重量％(例如约40～60重量％或约60～80％重量)，更优选约50重量％～70重量％(例如约50重量％或约70％重量)。
[0010]
在一个实施方案中，所述心脏疾病为心律失常。在一个实施方案中，所述心律失常为室性心律失常。
[0011]
本发明的另一个方面提供一种药物组合物，其包含式(ia)化合物或其药学上可接受的盐、式(ib)化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
[0012]
在所述药物组合物的一个实施方案中，以游离碱的重量计，所述式(ia)化合物或其药学上可接受的盐占所述式(ia)化合物或其药学上可接受的盐与式(ib)化合物或其药学上可接受的盐的总量的5重量％～95重量％，例如约5重量％、约10重量％、约15重量％、约20重量％、约25重量％、约30重量％、约35重量％、约40重量％、约45重量％、约50重量％、约55重量％、约60重量％、约65重量％、约70重量％、约75重量％、约80重量％、约85重量％、约90重量％、约95重量％。
[0013]
在所述药物组合物的一个实施方案中，以游离碱的重量计，所述式(ia)化合物或其药学上可接受的盐占所述式(ia)化合物或其药学上可接受的盐与式(ib)化合物或其药学上可接受的盐的总量的约30重量％～90重量％，优选约40重量％～80重量％(例如约40～60重量％或约60～80％重量)，更优选约50重量％～70重量％(例如约50重量％或约70％重量)。
[0014]
本发明的另一个方面提供前述的药物组合物在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，所述心脏疾病为心律失常，优选室性心律失常。
具体实施方式
[0015]
下面通过具体的实施例进一步说明本发明。应认识到所述实施例并非意在限制本发明的范围。实施例中所用的原料、试剂等，均为本领域技术人员所公知并且可通过市售或文献方法获得的物质；所用的试验或表征方法也是本领域技术人员公知的方法。
[0016]
实施例1：式(i)化合物、式(ia)化合物和式(ib)化合物的制备与分离
[0017][0018]
步骤1：中间体m-1的合成
[0019]
在0℃搅拌条件下，氮气保护，向含有槐定碱(24.82g，0.10mol)和叔丁醇钾(39.27g，0.35mol)的thf溶液(200ml)中慢慢滴加亚硝酸叔丁酯(15.47g，0.15mol)，滴加毕
(0～10℃滴加)并继续反应0.5～1.0h至完全。tlc检测反应完成，加入3n盐酸溶液700ml(ph＝1～2)。室温搅拌0.5～1.0h。过滤，滤饼干燥，得m-1(30.00g，收率96％)。lcms[m h]

278.36(c
15h23
n3o2：277.36)。
[0020]
步骤2：式(i)化合物的合成
[0021]
在20～30℃搅拌条件下，向含有m-1(25.10g，0.08mol)和氯化铵(25.67g，0.48mol)的水溶液(125ml)中分批加入锌粉(18.31g，0.28mol)，并继续反应3～5h至完全。tlc检测反应完成，室温过滤，滤液加入草酸(14.41g，0.16mol)，搅拌0.5～1.0h，滴加30％氢氧化钠75ml(ph＝9～10)搅拌0.5～1.0h，过滤，滤液加入二氯甲烷(300ml
×
3)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤所得滤液减压蒸干，得到式(i)化合物(20.00g，收率95％)。lcms[m h]

264.38(c
15h25
n3o：263.38)。
[0022]
步骤3：式(ia)化合物和式(ib)化合物的分离
[0023]
所得式(i)化合物(20.00g，0.076mol)，经硅胶(300-400目)柱色谱纯化分离(v
二氯甲烷
：v
甲醇
＝30:1～5：1)，得到式(ia)化合物(8.00g，收率40％)和式(ib)化合物(8.00g，收率40％)。
[0024]
式(ia)化合物：lcms[m h]

264.38(c
15h25
n3o：263.38)。1h nmr(400mhz，d2o)δ3.92-3.79(m，2h)，3.58-3.45(m，1h)，3.30-3.12(m,1h)，2.96-2.89(m，2h)，2.89-2.80(m，1h)，2.63-2.05(m，4h)，2.01-1.65(m，4h)，1.62-1.48(m，6h)，1.35-1.04(m，2h)。
[0025]
式(ib)化合物：lcms[m h]

264.38(c
15h25
n3o：263.38)。1h nmr(400mhz，d2o)δ3.92-3.79(m，2h)，3.58-3.45(m，1h)，3.30-3.12(m,1h)，2.96-2.89(m，2h)，2.89-2.80(m，1h)，2.63-2.05(m，4h)，2.01-1.65(m，4h)，1.62-1.48(m，6h)，1.35-1.04(m，2h)。
[0026]
在下文的中有时将式(ia)化合物表示为“h208a”，将式(ib)化合物表示为“h208b”。
[0027]
步骤4：式(ia)化合物和式(ib)化合物的单晶衍射试验
[0028]
为确定式(ia)化合物(h208a)和式(ib)化合物(h208b)的立体构型，对二者进行了单晶衍射试验。其中，h208a使用化合物游离碱制成单晶，而h208b性状为油状物，难以制成晶体，因此采用常规方法将h208b制成了二盐酸盐，然后利用二盐酸盐的单晶完成了试验。
[0029]
仪器
[0030]
检测仪：rigaku oxford diffraction xtalab synergy四循环衍射仪，配有hypix-6000he区域检测器。
[0031]
冷却系统：oxford cryostream 800
[0032]
其它参数：
[0033]
50w,具有多层镜的微焦点源(μ-cmf)
[0034]
晶体至ccd检测器的距离:d＝35mm
[0035]
管电压:50kv
[0036]
管电流:1ma
[0037]
晶体培养
[0038]
将20mg h208a样品在室温条件下溶解于0.6ml二氯甲烷/正己烷(1:5)中，将样品溶液置于4ml半密封样品瓶中，在45℃条件下缓慢挥发。第二天得到无色棱柱状晶体。
[0039]
将20mg h208b二盐酸盐样品在室温条件下溶解于1.1ml乙醇/正庚烷(5:6)中，将样品溶液置于4ml半密封样品瓶中，在室温条件下缓慢挥发。第二天得到无色块状晶体。
[0040]
数据收集
[0041]
对于h208a，衍射实验收集了62194个衍射点，其中独立衍射点11225个(rint＝0.0682)。衍射收集范围2θ＝4.416 to 133.18
°
，衍射指标范围-6≤h≤6,-37≤k≤31,-23≤l≤23。结构解析使用shelxt(sheldrick,g.m.2015.actacryst.a71,3-8)，结构精修使用shelxl(against f2)(sheldrick,g.m.2015.actacryst.c71,3-8)。11225个独立衍射点中，参加结构精修的参数为896。精修后s＝1.065,r1＝0.0361,wr2＝0.0914。残余电子密度值为0.12和
[0042]
对于h208b二盐酸盐，衍射实验收集了40390个衍射点，其中独立衍射点3331个(rint＝0.1071)。衍射收集范围2θ＝8.102 to 133.17
°
，衍射指标范围-11≤h≤11,-11≤k≤8,-51≤l≤51。结构解析使用shelxt(sheldrick,g.m.2015.actacryst.a71,3-8)，结构精修使用shelxl(against f2)(sheldrick,g.m.2015.actacryst.c71,3-8)。3331个独立衍射点中，参加结构精修的参数为215。精修后s＝1.128,r1＝0.0727,wr2＝0.1722。残余电子密度值为0.69和
[0043]
试验结果
[0044]
对于h208a，结果见于表i至表v；对于h208b二盐酸盐，结果见于表vi至表xi。结果验证了h208a和h208b分别具有本技术说明书式(ia)和式(ib)所示的构型。表i：h208a单晶的x射线结晶数据汇总
[0045][0046]
表ii：h208a单晶的原子坐标(x104)及等效各向同性位移参数(a2x103)
[0047]
[0048]
[0049][0050]
表iii：h208a单晶的键长
[0051]
[0052]
[0053][0054]
表iv：h208a单晶的键角(
°
)
[0055]
[0056]
[0057][0058]
表v：h208a单晶的扭角(
°
)
[0059]
[0060]
[0061]
[0062][0063]
表vi：h208b二盐酸盐单晶的x射线结晶数据汇总
[0064][0065]
表vii：h208b二盐酸盐单晶的原子坐标(x104)及等效各向同性位移参数(a2x103)
[0066][0067]
表viii：h208b二盐酸盐单晶的键长
[0068]
[0069][0070]
表ix：h208b二盐酸盐单晶的键角(
°
)
[0071][0072]
表x：h208b二盐酸盐单晶的氢键
[0073][0074]
[0075]11 x， y， z：
2-1/2-x，-1/2 y，3/4-z；31/2-x，-1/2 y，3/4-z，43/2-y，1/2 x，-1/4 z
[0076]
表xi：h208b二盐酸盐单晶的扭角(
°
)
[0077][0078]
实施例2：对离体心脏心电图(ecg)和传导系统的作用
[0079]
1材料
[0080]
1.1动物dunkin hartley(dh)豚鼠，12只，雄性，购于北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司，许可证号：scxk(京)2020-0002。
[0081]
1.2药品h208b(纯度：98％以上)。
[0082]
2方法
[0083]
2.1实验动物的分组与给药：
[0084]
动物随机分为2组，对照组和h208b组，6只/组。h208b设置给药浓度为0、200、400μm组和洗脱组(“洗脱”指用400μm的h208b加药评价后，用不含药物的k-h液洗脱药物)，对照组
平行给予k-h液。
[0085]
2.2实验步骤：
[0086]
试验开始前，按下表精确称量配方中的化合物，配制试验所用k-h液。
[0087]
表1:实施例2所用k-h液的配方
[0088][0089]
置于超纯水中定容至1l，磁力搅拌器助溶，充氧30min，调节ph至7.4
±
0.05。打开离体心脏灌流装置恒温循环泵，保持系统温度至37℃，将配好的k-h液倒入恒温浴槽中平衡至生理温度，其中持续充氧；用k-h液充满管路(其间必须保证管路中无气泡)，开启主机、放大器电源，打开软件，设置好相应参数，备用。豚鼠麻醉后注射肝素，迅速打开胸腔，摘除心脏迅速置于预冷的k-h液中，在最短的时间内将主动脉与灌流系统连接，丝线固定，打开灌流系统，开始进行离体心脏灌流，心脏在数分钟内恢复正常跳动，待其节律稳定后，将2个ecg探头分别放在心尖与右心房处，用于监测ecg；mapping的两个电极分别贴附于心脏的左心房和左心室，待信号稳定后记录给药前数据，开始加药，分别记录不同浓度药物干预后的数据变化。
[0090]
2.3统计学分析结果以表示，采用spss软件进行anova分析处理和dunnett检验，不符合正态分布的数据选用非参数检验。
[0091]
3结果
[0092]
3.1心率：与对照组比较，h208b可减慢心率，且可被不含药的k-h液洗脱，p《0.05(见表2)。
[0093]
3.2pr间期延长：与对照组比较，h208b可减慢心率，且可被不含药的k-h液洗脱，p《0.05(见表2)。
[0094]
3.3qt间期：与对照组比较，h208b给药干预后未见明显药物相关性变化(见表2)。
[0095]
3.4左心室传导：与对照组比较，h208b可减慢心室的传导速度，且可被不含药的k-h液洗脱，p《0.05，p《0.01(见表3)。
[0096]
3.5房室延搁：与对照组比较，h208b可延长房室延搁时间，且可被不含药的k-h液洗脱，p《0.05(见表3)。
[0097]
表2.h208b对离体心脏ecg参数的影响，变化率(n＝6)
[0098]
[0099]
注：上表中数据为相对于给药前而言的百分比数值，以平均值
±
标准差表示。
[0100]
表3.h208b对离体心脏传导的影响，变化率(n＝6)
[0101][0102]
注：上表中数据为相对于给药前而言的百分比数值，以平均值
±
标准差表示。
[0103]
4结论
[0104]
h208b可减慢离体心脏的心率，延长pr间期，对qt间期未见明显作用；对左心室的传导速度和房室延搁均可见显著减慢。结合以上，本发明涉及的化合物能够调节离体心脏ecg和传导系统，具备多离子通道阻滞剂的作用特点，表明具有抗心律失常活性。
[0105]
实施例3：对心肌细胞动作电位和离子通道的作用
[0106]
1材料
[0107]
1.1动物dh豚鼠，30只，雄性，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：scxk(京)2016-0011。
[0108]
1.2药品h208b(纯度：98％以上)。
[0109]
2方法
[0110]
2.1豚鼠心肌细胞的急性分离
[0111]
豚鼠腹腔注射肝素钠1000iu
·
kg-1
，肝素化后腹腔麻醉，取出心脏，经主动脉行逆向插管开始灌流无钙台式液。待冲净心脏内血液后，以含有胶原酶ii 19mg/50ml的无钙台氏液(含50μmol/l的cacl2)循环灌流。待灌流液流出速度明显加快后，取下心脏投入kb液中剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打静置，使存活心肌细胞沉降。电生理试验前将管道系统中的空气排尽。用微操纵器将给药系统输出端移至细胞槽中的选定的细胞附近，相应浓度的药物加入到给药管后，灌流给药。
[0112]
2.2分离心肌细胞所需的液体
[0113]
2.2.1无钙台式液配制
[0114]
表4.无钙台式液的成分(调节ph至7.4
±
0.05)
[0115][0116]
2.2.2kb液配制
[0117]
表5.kb液的成分(调节ph至7.4
±
0.05)
[0118][0119]
3豚鼠心肌细胞动作电位的记录
[0120]
3.1电极内液配制
[0121]
按照下表所示浓度配制电极内液，调ph后分装，-18℃以下保存，使用当天取出，加入mgatp(4mmol/l)。
[0122]
表6.动作电位电极内液的成分(调节ph至7.2
±
0.05)
[0123][0124]
3.2细胞外液配制
[0125]
表7.动作电位细胞外液的成分(调节ph至7.4
±
0.05)
[0126][0127][0128]
3.3动作电位的记录以及h208b的给药浓度
[0129]
采用膜片钳技术i-clamp模式记录豚鼠心室肌细胞动作电位，电流钳制在0，向细胞内注入电流，刺激时间维持3ms，记录动作电位，分析给药前后动作电位时程(apd90)的变
化。给药浓度3个，30、100、300μmol/l，每一浓度下重复试验例n＝4。
[0130]
3.4数据处理
[0131]
所得数据结果均用表示，采用origin8.0统计软件用配对t检验方法进行分析。
[0132]
3.5结果
[0133]
h208b在100μmol/l、300μmol/l的浓度下可以明显延长心肌细胞的动作电位时程(p《0.05或p《0.01)，见表8。
[0134]
3.6结论
[0135]
h208b能够延长心肌细胞的动作电位时程。
[0136]
表8.h208b在不同浓度对动作电位apd90的作用
[0137][0138]
4钾电流的记录
[0139]
4.1电极内液配制
[0140]
按照下表所示浓度配制电极内液，调ph后分装，-18℃以下保存，使用当天取出，加入mgatp(4mmol/l)。
[0141]
表9.钾电流电极内液的成分(调节ph至7.2
±
0.05)
[0142][0143]
4.2细胞外液配制
[0144]
表10.钾电流细胞外液的成分(调节ph至7.4
±
0.05)
[0145][0146][0147]
4.3钾电流的记录以及h208b的给药浓度
[0148]
记录钾电流，细胞钳制在-80mv，从-60mv开始以阶跃电压5mv的方式逐步去极化至 40mv，刺激电压维持450ms，分析 40mv下给药前后电流的变化。给药浓度分别为10、30、100、300、500μmol/l，每一浓度下重复试验例n＝3。
[0149]
4.4数据处理
[0150]
所得数据结果均用表示，采用origin8.0统计软件用配对t检验方法进行分析。
[0151]
4.5结果
[0152]
h208b在100μmol/l、300μmol/l、500μmol/l的浓度下可以明显抑制钾电流(p《0.05或p《0.01)，见表11。
[0153]
4.6结论
[0154]
h208b对钾电流有抑制作用。
[0155]
表11.h208b在不同浓度对钾电流的作用
[0156][0157][0158]
5钙电流的记录
[0159]
5.1电极内液配制
[0160]
表12.钙电流电极内液的成分(调节ph至7.2
±
0.05)
[0161][0162]
5.2细胞外液配制
[0163]
表13.钙电流细胞外液的成分(调节ph至7.4
±
0.05)
[0164][0165]
5.3钙电流的记录以及h208b的给药浓度
[0166]
记录钙电流，细胞钳制在-80mv，从-60mv开始以阶跃电压10mv的方式逐步去极化至 60mv，刺激电压维持200ms，分析给药前后0mv电流的变化。给药浓度分别为10、30、100、300、500μmol/l，每一浓度下重复试验例n＝4。
[0167]
5.4数据处理
[0168]
所得数据结果均用表示，采用origin8.0统计软件用配对t检验方法进行分析。
[0169]
5.5结果
[0170]
h208b在30μmol/l、100μmol/l、300μmol/l、500μmol/l的浓度下对钙电流有抑制作用(p《0.01或p《0.001)，见表14。
[0171]
5.6结论
[0172]
h208b对钙电流有抑制作用。
[0173]
表14.h208b在不同浓度对钙电流的作用
[0174][0175]
本实施例的数据表明，本发明涉及的化合物能够调节心肌细胞动作电位和离子通道，由此能够对心律失常具有改善作用。
[0176]
实施例4：对离体心脏缺血再灌注模型的作用
[0177]
1材料
[0178]
1.1动物sd大鼠，30只，雄性，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：scxk(京)2016-0011。
[0179]
1.2药品h208b(纯度：98％以上)。
[0180]
2方法
[0181]
2.1实验动物的分组与给药：
[0182]
动物随机分为5组，假手术组、模型对照组和h208b-125、250、500μm组，6只/组。假手术和模型组给予等体积的k-h液。
[0183]
2.2实验步骤：
[0184]
试验开始前，按下表精确称量配方中的化合物，配制试验所需k-h液。
[0185]
表15:实施例4所用k-h液的配方
[0186][0187]
置于超纯水中定容至1l，磁力搅拌器助溶，充氧30min，调节ph至7.4
±
0.05。打开离体心脏灌流装置恒温循环泵，保持系统温度至37℃，将配好的k-h液倒入恒温浴槽中平衡至生理温度，其中持续充氧；用k-h液充满管路(其间必须保证管路中无气泡)，开启主机、放大器电源，打开软件，设置好相应参数，备用。豚鼠麻醉后注射肝素，迅速打开胸腔，摘除心脏迅速置于预冷的k-h液中，在最短的时间内将主动脉与灌流系统连接，丝线固定，打开灌流系统，开始进行离体心脏灌流，心脏在数分钟内恢复正常跳动，待其节律稳定后，将2个
ecg探头分别放在心尖与右心房处，用于监测ecg；记录给药前数据后，按既定给药浓度加药灌流15min，结扎冠状动脉左前降支，缺血30min后去掉丝线，进行缺血再灌注，记录缺血再灌注后的心律失常发作时间；假手术组只穿线，不进行结扎及再灌注。
[0188]
2.3统计学分析结果以表示，采用spss软件进行anova分析处理和dunnett检验，不符合正态分布的数据选用非参数检验。
[0189]
3结果
[0190]
与假手术组比较，模型对照组6只动物均出现室速和室颤等心律失常。与模型对照组比较，h208b-125、250、500μm药物灌注组心律失常的出现时间明显延迟，发作时间明显缩短，见表16。
[0191]
表16.h208b对离体心脏缺血再灌注诱发心律失常的作用(n＝6)
[0192][0193]
4结论
[0194]
h208b预给药可明显延迟离体心脏缺血再灌注诱发心律失常的出现时间，缩短心律失常的发作时间。
[0195]
本实施例的数据表明，本发明涉及的化合物能够调控离体心脏缺血再灌注模型的心律，由此能够对心律失常具有改善作用。
[0196]
实施例5：对大鼠乌头碱模型的作用
[0197]
1材料
[0198]
1.1动物
[0199]
sd大鼠，30只，雄性，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：scxk(京)2016-0011。
[0200]
1.2药品：h208b(纯度：98％以上)。
[0201]
2方法
[0202]
2.1实验动物的分组与给药
[0203]
动物随机分为4组，即模型对照组和三个h208b治疗组(分别以25、50、75mg/kg给药h208b)，10只/组。给药方式：单次注射，模型对照组给予等量的溶媒(0.9％的氯化钠注射液)。
[0204]
2.2实验步骤
[0205]
动物提前检疫分组，试验当天，大鼠用25％的乌拉坦腹腔麻醉后，连接powerlab电生理记录系统，监测动物的ecg；信号稳定后，尾静脉单次注射相应给药量的h208b(治疗组)或等量的溶媒(模型对照组)，5min后股静脉快速推注乌头碱溶液(30μg/kg)，给药和造模瞬间分别标记时间，持续记录ecg，观察室性早搏等典型心律失常波形的出现和结束时间。评价指标：心律失常的出现时间(相对于造模时间计算)和发作时间(即从出现到结束的时
间)。
[0206]
2.3统计学分析
[0207]
结果以表示，采用spss软件进行anova分析处理和dunnett检验，不符合正态分布的数据选用非参数检验。
[0208]
3结果
[0209]
与模型对照组比较，三个h208b治疗组心律失常的出现时间明显延迟，发作时间明显缩短，见表17。
[0210]
表17.h208b注射给药对大鼠乌头碱诱发心律失常的作用(n＝10，平均值
±
标准偏差)
[0211][0212]
4结论
[0213]
h208b注射给药可明显延迟大鼠乌头碱诱发心律失常的出现时间，缩短心律失常的发作时间。
[0214]
大鼠乌头碱模型是本领域中常用的心律失常(特别是室性心律失常)动物模型。本实施例的数据表明，本发明涉及的化合物能够调控大鼠乌头碱模型的心律，由此能够对心律失常、特别是室性心律失常具有改善作用。