一种抗小鼠IgG2a的山羊抗体及其应用的制作方法

一种抗小鼠igg2a的山羊抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种抗小鼠igg2a的山羊抗体及应用，属于生物技术领域。
技术背景
2.由小鼠作为第一来源的抗体被称为第一抗体，第二抗体是能和第一抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。二抗在间接酶联免疫、免疫层析等实验中发挥了巨大作用。传统二抗的制备是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白，具有制备周期长，操作繁琐的缺点。抗体库技术是一种将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原或抗体筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体的技术。抗体库技术不仅可以模拟动物免疫系统产生抗体的过程，还具有许多独特的优点，抗体库技术无需免疫，从理论上讲，10
～10
的库容就可能包容所有的抗体。利用抗原或抗体即可直接从非免疫动物抗体库中筛选出特异性抗体，并能筛选到针对该物种自身抗原的抗体。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的是：提供一种抗小鼠igg2a，且与人igg没有交叉的山羊抗体，同时还提供该抗体的应用。
4.本发明解决其技术问题的技术方案如下：
5.一种抗小鼠igg2a的山羊抗体，所述抗体选自以下任意一种：
6.i)所述抗小鼠igg2a的山羊抗体的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no:2第31-35、50-64、98-107位氨基酸序列所示，轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no:4第24-34、50-56、89-97位氨基酸序列所示；
7.或ii)所述抗小鼠igg2a的山羊抗体的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no:6第31-35、50-64、98-113位氨基酸序列所示，轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no:8第24-39、55-61、94-102位氨基酸序列所示。
8.作为本发明的一种优选,所述的抗小鼠igg2a的山羊抗体的重链氨基酸序列如seq id no：2所示，轻链氨基酸序列如seq id no：4所示；或重链氨基酸序列如seq id no：6所示；轻链氨基酸序列如seq id no：8所示。
9.编码本发明所述抗小鼠igg2a的山羊抗体的核酸。
10.作为本发明的一种优选,所述抗小鼠igg2a的山羊抗体的重链dna序列如seq id no：1所示，轻链dna序列如seq id no：3所示；或者重链dna序列如seq id no：5所示，轻链dna序列如seq id no：7所示。
11.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的所述抗体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所
述抗体的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
12.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码seq id no.1所示的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。
13.一种含有所述核酸的表达载体。可选用本领域已知的各种载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明的抗体的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成表达载体。
14.作为本发明的一种优选，表达载体为pcdna3.4。
15.一种含有本发明所述表达载体的宿主细胞。可用于本发明的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。用于表达抗体的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、cos细胞、cho细胞等。
16.作为本发明的一种优选，该宿主细胞是真核细胞，所述的宿主细胞为hek-293细胞或cho细胞。
17.一种标记的抗小鼠igg2a的山羊抗体，所述抗体为本发明所述的抗小鼠igg2a的山羊抗体,所述标记为辣根过氧化物酶。
18.本发明所述的抗小鼠igg2a的山羊抗体在制备鼠igg2a二抗中的应用。
19.本发明的有益效果:：
20.本发明通过噬菌体展示技术获得了靶向小鼠igg2a的山羊抗体，该抗体能够以高亲和力特异性识别小鼠igg2a，且与人igg没有交叉。该抗体能够用于制备鼠igg2a二抗，具有重要的应用价值。
附图说明
21.图1为实施例1的单克隆富集率分析图。
22.图2为实施例2哺乳系统表达质粒示意图。
23.其中，质粒unique1-h和unique1-l分别为哺乳系统表达山羊抗体unique1所需的重链和轻链质粒，质粒unique7-h和unique7-l分别为哺乳系统表达山羊抗体unique7所需的重链和轻链质粒。
24.图3为实施例2哺乳系统表达的山羊抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。
25.1：unique1哺乳系统表达抗体
26.2：unique7哺乳系统表达抗体
27.图4为实施例3中哺乳系统表达的山羊抗体unique1的结合elisa结果图。
28.图5为实施例3中哺乳系统表达的山羊抗体unique7的结合elisa结果图。
29.图6为实施例4中的elisa检测hrp标记的哺乳系统表达的小鼠igg2a(unique1)二抗的结果图。
30.其中，mouse igg1,mouse igg3与human igg的e1isa曲线重合
31.图7为实施例4中的elisa检测hrp标记的哺乳系统表达的小鼠igg2a(unique7)二
抗的结果图。
32.其中，mouse igg1,mouse igg3与human igg的e1isa曲线重合
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。
34.实施例1、筛选抗小鼠igg2a的山羊抗体
35.以mouse igg2a为正筛抗原，以human igg为负筛抗原，应用噬菌体展示技术从山羊抗体噬菌体文库(文库大小为1.3x10
10
)中筛淘抗小鼠igg2a，且与人igg没有交叉的山羊抗体。
36.采用固相淘选的方法，将human igg包被到elisa板条上，每孔100ul，4℃过夜包被。pbst洗三遍，每孔加入200ul的酪蛋白，37℃封闭2小时。pbst洗三遍后加入噬菌体展示库(约有1x10
12
cfu)，37℃孵育1小时，收集未结合的噬菌体，重复负筛三次以去除与human igg结合的噬菌体。将负筛后的噬菌体加到封闭好的包被了mouse igg2a的elisa板条上，37℃孵育1小时。吸出未结合的噬菌体，pbst洗10遍。每孔加100ul的甘氨酸-盐酸溶液，37℃反应7分钟，轻轻吹打板孔将吸附的噬菌体洗脱下来，然后加入tris-hcl溶液中和至中性。洗脱的噬菌体感染对数生长期的tg1细胞，扩增回收后的噬菌体，用于下一轮淘选。
37.经过三轮淘选后，用phage-elisa进行验证是否特异性富集。mouse igg2a包被到elisa板条上，4℃过夜包被。pbst洗三遍后用3％的酪蛋白37℃封闭2小时。pbst洗5遍后加入三轮淘选的噬菌体展示库，首孔约1x10
12
cfu，4倍梯度稀释，末孔空白，37℃结合1小时。pbst洗5遍后加入hrp标记的小鼠抗m13的二抗，37℃孵育1小时。pbst洗5遍后加tmb显色液室温避光显色5-10分钟，最后用2m硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值并做phage-elisa结合曲线。
38.elisa检测结果显示，以辅助噬菌体为阴性对照，在三轮富集后，噬菌体群对小鼠igg2a的亲和力逐轮升高，elisa检测结果显示，以辅助噬菌体为阴性对照，在三轮富集后，噬菌体群对human igg的亲和力逐轮降低。
39.对第三轮富集的噬菌体单克隆进行抗原结合分析，具体过程为：
40.用第三轮富集的噬菌体库感染tg1细胞，并从中随机挑取792个单克隆，扩增并回收噬菌体。将mouse igg2a包被到elisa板条上，4℃过夜包被。pbst洗三遍后用3％酪蛋白37℃封闭2小时。将792个扩增后的单克隆噬菌体以1:1比例与含3％酪蛋白的pbst溶液室温孵育1小时，将孵育好的噬菌体加到封闭好的酶标板中，37℃孵育1小时。pbst洗5遍后加入hrp标记的小鼠抗m13的二抗，37℃孵育1小时。pbst洗5遍后加tmb室温避光显色5-10分钟，最后用2m硫酸终止显色，用酶标仪读取450nm波长下的吸光值，吸光值在阴性对照(辅助噬菌体)两倍以上的为阳性克隆。分析792个单克隆噬菌体对mouse igg2a和human igg的结合能力，792个单克隆噬菌体中有25个与mouse igg2a有结合,且与human igg没有结合的克隆。
41.对这25个阳性克隆进行测序分析，得到7个unique sequence，其中unique1和unique7为优势富集克隆(如图1所示)。
42.unique1的抗体重链dna序列为seq id no.1，氨基酸序列为seq id no.2。
43.在氨基酸序列中，氨基酸残基31-35(即nygvg)为重链cdr1，氨基酸残基50-64(即
tirrgggtvynpalq)为重链cdr2，氨基酸残基98-107(即lrvdwfsida)为重链cdr3。
44.unique1的抗体轻链dna序列为seq id no.3，氨基酸序列为seq id no.4。
45.在氨基酸序列中，氨基酸残基24-34(即rtsqsvrnyln)为重链cdr1，氨基酸残基50-56(即yatrlyt)为重链cdr2，氨基酸残基89-97(即lqdysipla)为重链cdr3。
46.unique7的抗体重链dna序列为seq id no.5，氨基酸序列为seq id no.6。
47.在氨基酸序列中，氨基酸残基31-35(即dygvg)为重链cdr1，氨基酸残基50-64(即viwssgntdyksalk)为重链cdr2，氨基酸残基98-113(即isgwdygsgsgyyinr)为重链cdr3。
48.unique7的抗体轻链dna序列为seq id no.7，氨基酸序列为seq id no.8。
49.在氨基酸序列中，氨基酸残基24-39(即kssqslvhsdgktyln)为重链cdr1，氨基酸残基55-61(即evskrys)为重链cdr2，氨基酸残基94-102(即fqgtelpya)为重链cdr3。
50.实施例2：抗小鼠igg2a的山羊抗体哺乳系统表达纯化
51.以实施例1中获得的阳性克隆unique1和unique7为模板，利用聚合酶链式反应(pcr)技术大量扩增重链可变区dna片段和轻链可变区dna片段,扩增unique1重链可变区dna片段的上下游引物序列为unique1-hf：gtcctcctgactggggtgagggcccaggtgagactgcaggaaagcggc和unique1-hr：gaccgatgggcccttggtgctagcggaggacactgtcaccagcaggcc,扩增unique1轻链可变区dna片段的上下游引物序列为unique1-lf：gtcctcctgactggggtgagggccgacattcaggtgacccagagcccc和unique1-lr：gacagatggtgcagccaccgtacgtttgatttccacccgggtgcctcc,扩增unique7重链可变区dna片段的上下游引物序列为unique7-hf：gtcctcctgactggggtgagggcccaggtgcagctgcaggagtcggga和unique7-hr：gaccgatgggcccttggtgctagctgaggagactgtgaccaggagccc,扩增unique7轻链可变区dna片段的上下游引物序列为unique7-lf：gtcctcctgactggggtgagggccgatgttgtgctgacccaaactcca和unique7-lr：gacagatggtgcagccaccgtacgtttgatctccactctggtcccacc。利用dna重组技术将阳性克隆unique1扩增出的重链可变区dna片段和轻链可变区dna片段分别重组到pcdna3.4中，酶切位点是hindiii/bamhi，构建图2中质粒unique1-h和unique1-l,利用dna重组技术将阳性克隆unique7扩增出的重链可变区dna片段和轻链可变区dna片段分别重组到pcdna3.4中，酶切位点是hindiii/bamhi，构建图2中质粒unique7-h和unique7-l。运用脂质体转染法将构建成功的重组载体转染hek-293细胞。取对数生长期hek-293细胞接种至6孔板中，细胞密度为1.5
×
106cell/ml，37℃、co2培养箱中微孔板振荡器培养，1-3h后进行转染。将脂质体一载体混合液加入细胞孔，培养2、4、6天补料补液，第7天收样纯化。用20ml 1xpbs，1ml/min的流速平衡层析柱，1ml/min的流速上样，20ml 1xpbs，1ml/min的流速洗杂，用柠檬酸缓冲液(ph3.4)洗脱，流速1ml/min，分管收集，每管约500ul。共收集10管，使用nanodrop仪器读取280nm吸光度值。将高浓度蛋白吸至透析袋放1xpbs的烧杯中透析。收集纯化好的抗体其还原条件下的sds-page结果如图3。
52.实施例3哺乳系统表达的山羊抗体的结合elsia
53.用elisa对哺乳系统表达的山羊抗体进行验证。将实施例2中哺乳系统表达抗小鼠igg2a的山羊抗体稀释后分别包被到elisa板条，4℃过夜，3％的酪蛋白37℃封闭1小时，将生物素标记的mouse igg1、mouse igg2a、mouse igg3稀释后作为首孔浓度，4倍梯度稀释，末孔为空白，37℃孵育1小时，pbst洗板5次后拍干，用sa-hrp做二抗，37℃孵育1小时，pbst洗板5次后拍干。每孔加100ul tmb室温避光反应5-10min，用2m硫酸终止显色，用酶标仪读
取450nm波长下的吸光值。
54.结果如图4、图5所示，哺乳系统表达的山羊抗体unique1和unique7都与mouse igg2a呈现高亲和力结合、与mouse igg1、mouse igg3呈现弱结合，与human igg没有结合。
55.实施例4用哺乳系统表达的抗小鼠igg2a山羊抗体制备hrp标记的小鼠igg2a二抗
56.按照抗体－hrp标记试剂盒操作说明书(厂家为广州华银医药科技有限公司)对哺乳系统表达的抗小鼠igg2a山羊抗体进行标记，具体为实验前30分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温(18～25℃)。配制cb(50mm碳酸盐缓冲液，ph 9.6，25℃)和pbs(10mm磷酸盐、0.9％ nacl缓冲液，ph 7.2，25℃)各1500ml。5mg/ml的哺乳系统表达的抗小鼠igg2a山羊抗体溶液于50mm cb(ph9.6)4℃透析过夜，换液2～3次。在避光条件下取0.4ml的超纯水加入hrp管中，充分混匀，取1ml超纯水加入过碘酸钠(naio3)管中，充分混匀。取溶好的naio3溶液45ul加入到溶好的hrp溶液中，边加边混匀，室温暗置反应20min。取乙二醇40ul加入到上述溶液中，充分混匀，室温暗置反应30min。将上述氧化好的hrp溶液加入到哺乳系统表达的抗小鼠igg2a山羊抗体溶液中，充分混匀，室温透析交联2.5小时。交联透析液为50mm cb(ph 9.6)缓冲液。取0.5ml超纯水加入硼氢化钠(nabh4)管，颠倒数次混匀。将交联完毕的抗体－hrp溶液从透析袋中取出置于棕色玻璃瓶中，加nabh4溶液80ul，置4℃避光反应2小时，每隔30分钟轻轻摇匀一次。将还原完毕的抗体-hrp溶液置于10mm pbs(ph 7.2)溶液中4℃透析过夜(18小时以上)。换液3～4次，第一次换液时间间隔2小时。收获标记好的抗体－hrp溶液，备用(可加等量甘油或其他蛋白保护剂)。
57.分别用mouse igg1、mouse igg2a、mouse igg3和human-igg包被酶标板，首孔2.5ug/ml，四倍梯度稀释，末孔空白，4℃过夜。第二天用pbst洗3-5次，拍干后每孔加200ul 3％酪蛋白，37℃封闭1h，用pbst洗3-5次，拍干后每孔加100ul hrp标记的山羊抗体(1mg/ml，1:2000稀释使用)，37℃孵育1h，用pbst洗3-5次，拍干后每孔加100ul tmb，37℃避光反应5-10min，最后每孔加50ul 2m硫酸终止显色，读取450nm处的吸光值。
58.结果如图6和图7所示，hrp标记的哺乳系统表达的抗小鼠igg2a山羊抗体与mouse igg2a有结合，与mouse igg1、mouse igg3和human igg都没有结合，可作为小鼠igg2a二抗。