用于治疗COVID-19的化合物

用于治疗covid-19的化合物
技术领域
1.本发明涉及能够抑制covid-19病毒sars-cov-2的功能蛋白的化合物。


背景技术：

2.冠状病毒(cov)是一大类属于冠状病毒科(coronaviridae)的单链包膜rna病毒。直至最近，已知在人中传播的有限数量的冠状病毒被认为是相对无害的人呼吸道病原体，导致轻度感染。然而，在过去几年中出现了严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)和中东呼吸综合征(mers)病毒，表明一些冠状病毒能够在人中引起严重且有时致命的呼吸道感染(pereira,h等人，andrewes’viruses of vertebrates1989,第5版,42-57；holmes,k.v.等人，virology 1996,1:1075-1093)。2012年6月，在沙特阿拉伯首次出现了mers-cov。这些事件表明，不应低估cov的威胁，并且最重要的是增进关于这些病毒的复制及其与宿主的相互作用的知识，以开发治疗和疫苗。
3.sars-cov-2在全球快速传播，2020年3月11日，who宣布sars-cov-2感染为大流行。大多数感染covid-19的人都会经历轻度至中度的呼吸道疾病(发烧、疲劳、干咳和呼吸困难)，无需特殊治疗即可康复。老年人和那些有基础医疗问题(如心血管疾病、糖尿病、慢性呼吸道疾病和癌症)的人更容易患上严重疾病。
4.对不同物种cov的系统发育分析表明，sars-cov-2的中间传播载体尚未确定(dong，n.等人，microbiology 2020)。根据这项研究，因为与人sars病毒相比高度变异，sars-cov-2属于一种新型的蝙蝠冠状病毒。sars-cov-2是cov科中第七个感染人的成员。
5.对疫情爆发初期从患者获得的sars-cov-2基因组序列的分析表明，它们与sars-cov的基因组序列具有79.5％的序列同一性。与sars-cov一样，sars-cov-2通过内体途径进入靶细胞，并使用相同的细胞进入受体(cell entry receptor)血管紧张素转化酶ii(ace2)。特别是，病毒表面的刺突蛋白通过其受体结合结构域(rbd)与ace2结合，从而使得病毒能够进入细胞。进入宿主细胞后，病毒rna释放至细胞质中，然后翻译为两种多蛋白pp1a和pp1b，它们被病毒蛋白酶：木瓜蛋白酶样蛋白酶(plpro)和3c样蛋白酶(3cl-pro)切割成非结构蛋白nsp1-16(moustaqil等人，emerging microbes&infections 2021,10(1),178-195)。
6.nsp在复制和转录中具有重要作用(rajarshi等人，gene 2021,768:145313)。
7.plpro和3cl-pro还负责切割宿主抗病毒免疫应答的介质，从而提供病毒逃逸免疫系统的机制(choudhury等人，in silico pharmacol 2021,9:26；liu等人，viruses 2020,12:1039)。
8.冠状病毒活性的重要结构蛋白是核衣壳蛋白(n-蛋白)，其在病毒粒子组装过程中包装rna基因组，形成螺旋核糖核蛋白(rnp)复合体，与其他结构蛋白相互作用。
9.因此，以上sars-cov-2蛋白以及刺突蛋白(spike)与ace2之间的复合体代表了sars-cov-2中用于预防病毒复制和增殖的有效治疗靶点。
10.新药的鉴定和开发是一个漫长的过程，因此不足以应对covid-19爆发这一紧迫全
球挑战的紧急情况。对已在人中测试为安全的药物或已批准用于不同疗法的药物改换用途(repurposing)是一种快速应对解决方案，因为药物的药代动力学、毒理学和制造数据已经可得，因此允许在临床环境中立即应用(anand等人，science 2003；300(5626):1763-7)。


技术实现要素：

11.本发明人已对含有在人中是安全的或已进行了直至晚期临床阶段经表征的商业化药物和临床候选药物的文库进行了分析，并通过计算机相关药物设计(computer associated drug design)选择了许多分子，所述分子能够结合一种或多种选自以下的sars-cov-2的蛋白并抑制其活性：3cl蛋白酶、pl蛋白酶、n-蛋白、nsp3、nsp6、nsp9、nsp12、nsp13、nsp14、nsp15、nsp16，或所述分子能够抑制刺突蛋白-ace2相互作用。发明人随后通过体外筛选确认了所选择的分子对sars-cov-2的抑制活性。
12.获得的结果支持鉴定的化合物在治疗sars-cov-2感染中的用途。
13.详细地说，鉴定为对该病毒具有抑制活性的化合物是：原黄素(proflavine)、雷洛昔芬(raloxifen)、美喹他嗪(mequitazine)、n-叔丁基异喹(n-tert-butylisoquine)、异氟氧硫平(isofloxythepin)、琥珀布可(succinobucol)和金丝桃素(hypericin)。所有这些化合物都是众所周知的已批准药物或用于不同适应症的候选药物。
14.原黄素是化合物3,6-二氨基吖啶的通用名，其具有以下通式(i)：
[0015][0016]
该化合物是一种针对多种革兰氏阳性细菌的抗菌抑菌剂。它以二盐酸盐和半硫酸盐的形式用作局部抗菌剂，主要用于伤口敷料中，并且以前也用作泌尿抗菌剂。
[0017]
雷洛昔芬是1-[6-羟基-2-(4-羟基苯基)苯并[b]噻吩-3-基]-1-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]甲酮的通用名，其具有以下通式(ii)：
[0018][0019]
该化合物是一种选择性苯并噻吩雌激素受体调节剂(serm)，具有降脂作用和针对骨质疏松症的活性，并被批准用于治疗和预防绝经后妇女的骨质疏松症。
[0020]
美喹他嗪是化合物10-(奎宁环-3-基甲基)-10h-吩噻嗪的通用名，其具有以下通式(iii)：
[0021][0022]
该化合物是一种组胺h1受体拮抗剂，它被批准用于治疗过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、瘙痒和荨麻疹。
[0023]
n-叔丁基异喹是化合物2-[(叔丁基氨基)甲基]-5-[(7-氯喹啉-4-基)氨基]苯酚的通用名，是一种抗疟药物，其具有以下通式(iv)：
[0024][0025]
异氟氧硫平是化合物2-[4-(9-氟-3-丙-2-基-5,6-二氢苯并[b][1]苯并噻吩-5-基)哌嗪-1-基]乙醇的通用名，其具有以下通式(v)：
[0026][0027]
该化合物是一种抗精神病剂。
[0028]
琥珀布可是以下化合物的通用名：琥珀酸2,6-二叔丁基-4-[1-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基硫烷基)-1-甲基乙基硫烷基]苯基单酯(vi)：
[0029][0030]
该化合物是一种正在临床开发用于治疗心脏血管的动脉粥样硬化或冠状动脉疾病的抗氧化剂。
[0031]
金丝桃素是蒽醌衍生物1,3,4,6,8,13-六羟基-10,11-二甲基菲并[1,10,9,8-opqra]苝-7,14-二酮的通用名，其具有通式(vii)：
[0032][0033]
该化合物正在开发用于治疗皮肤t细胞淋巴瘤。
[0034]
因此，这些化合物可用于治疗被sars-cov-2感染的患者受试者，或用于预防和/或处理表面(包括体表)或携带sars-cov-2的产品的污染。
[0035]
因此，本发明的第一目的是选自以下的化合物用于在受试者中治疗sars-cov-2感染的用途：原黄素、雷洛昔芬、美喹他嗪、n-叔丁基异喹、异氟氧硫平、琥珀布可和金丝桃素或其盐。
[0036]
本发明的第二目的是一种药物组合物用于在受试者中治疗sars-cov-2感染的用途，所述药物组合物包含：i)至少一种根据本发明的第一目的的化合物，和ii)至少一种药学上可接受的惰性赋形剂。
[0037]
本发明的第三目的是一种在受试者中治疗sars-cov-2感染的治疗方法，其包括向此类受试者施用根据本发明的第一目的的化合物。
[0038]
本发明的第四目的是原黄素(优选原黄素半硫酸盐)用于预防和/或处理sars-cov-2污染的表面的用途。
具体实施方式
[0039]
本发明的第一目的是选自以下的化合物用于在受试者中治疗sars-cov-2感染的
用途：原黄素、雷洛昔芬、美喹他嗪、n-叔丁基异喹、异氟氧硫平、琥珀布可、金丝桃素及其盐。
[0040]
本发明进一步的目的是选自以下的化合物用于治疗感染sars-cov-2的受试者的用途：原黄素、雷洛昔芬、美喹他嗪、n-叔丁基异喹、异氟氧硫平、琥珀布可、金丝桃素及其盐。
[0041]
根据本发明，术语“受试者”是指人或动物。优选地，所述受试者是人。
[0042]
根据本发明，待治疗的患有sars-cov-2感染的受试者可以是有症状的、缺乏典型症状的(paucisymtpomatic)或无症状的。
[0043]
优选地，所述受试者患有covid-19。因此，本发明进一步的目的是选自以下的化合物用于在受试者中治疗covid-19的用途：原黄素、雷洛昔芬、美喹他嗪、n-叔丁基异喹、异氟氧硫平、琥珀布可、金丝桃素及其盐。
[0044]
根据本发明的第一目的，特别优选的用于用途的化合物是雷洛昔芬或其盐，优选盐酸雷洛昔芬。
[0045]
根据本发明的第一目的，另一种特别优选的用于用途的化合物是金丝桃素或其盐。
[0046]
根据本发明的特别优选的原黄素的盐是原黄素半硫酸盐或二盐酸盐。
[0047]
如将在实验部分详细描述的那样，本发明人已发现，除了其已知活性之外，以上多种化合物都具有结合sars-cov-2的必需途径并抑制其活性从而抑制该病毒复制的能力。
[0048]
所选择的化合物具有的优点是，它们已被批准用于临床用途或已在人中测试为安全的，在某些情况下是上市药物，因此可以提供治疗感染sars-cov-2的人(优选治疗covid-19患者)的快速治疗方法。
[0049]
根据本发明的第一目的，用于用途的化合物以药物组合物的形式施用，其中所述化合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂掺加。
[0050]
根据本发明的第一目的，化合物可以单独施用。或者，可以使用根据本发明的第一目的的化合物的组合。根据后者，在组合疗法中使用两种选自以下的化合物的组合：原黄素、雷洛昔芬、美喹他嗪、n-叔丁基异喹、异氟氧硫平、琥珀布可、金丝桃素及其盐。两种化合物可以同时施用或相继施用。
[0051]
作为优选的实施方案，两种化合物是：雷洛昔芬和原黄素、雷洛昔芬和美喹他嗪、雷洛昔芬和n-叔丁基异喹、雷洛昔芬和异氟氧硫平、雷洛昔芬和琥珀布可、或雷洛昔芬和金丝桃素、或其盐。
[0052]
作为优选的实施方案，两种化合物是：金丝桃素和雷洛昔芬、金丝桃素和原黄素、金丝桃素和美喹他嗪、金丝桃素和n-叔丁基异喹、金丝桃素和异氟氧硫平、金丝桃素和琥珀布可、或其盐。
[0053]
作为优选的实施方案，两种化合物是：原黄素和美喹他嗪、原黄素和n-叔丁基异喹、原黄素和异氟氧硫平、原黄素和琥珀布可、原黄素和金丝桃素、或其盐。
[0054]
因此，如上所述，本发明的第二目的是一种药物组合物用于治疗感染sars-cov-2的受试者的用途，所述药物组合物包含至少一种根据本发明的第一目的的化合物和至少一种药学上可接受的惰性赋形剂。
[0055]
根据优选的实施方案，药物组合物包含一种根据本发明的第一目的的化合物。
[0056]
根据替代的实施方案，药物组合物包含两种选自以下的根据本发明的第一目的的化合物：原黄素、雷洛昔芬、美喹他嗪、n-叔丁基异喹、异氟氧硫平、琥珀布可、金丝桃素及其盐。
[0057]
作为优选的实施方案，两种化合物是雷洛昔芬和一种选自以下的化合物：原黄素、美喹他嗪、n-叔丁基异喹、异氟氧硫平、琥珀布可、金丝桃素及其盐。
[0058]
作为另一个优选的实施方案，两种化合物是金丝桃素和一种选自以下的化合物：原黄素、雷洛昔芬、美喹他嗪、n-叔丁基异喹、异氟氧硫平、琥珀布可及其盐。
[0059]
作为另一个优选的实施方案，两种化合物是原黄素和一种选自以下的化合物：雷洛昔芬、美喹他嗪、n-叔丁基异喹、异氟氧硫平、琥珀布可、金丝桃素及其盐。
[0060]
本发明的化合物或药物组合物可以全身施用或局部施用。
[0061]
优选地，当根据本发明的第一目的的用于用途的化合物是原黄素或其盐时，这是用于在所述受试者中通过局部施用来治疗局部sars-cov-2感染的用途。
[0062]
按照本领域已知方法将本发明的化合物或药物组合物施用于患者，并且可以口服施用(包括每天一次至多次口服施用)、肠胃外施用(包括静脉内、腹膜内、脑内、鞘内、颅内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、眼内、动脉内、皮下、皮内或病灶内注射或输注技术)、局部施用、经颊施用和栓剂施用。
[0063]
本发明的化合物或药物组合物的施用途径取决于药物组合物中使用或含有的特定化合物以及sars-cov2的感染部位，并且按照用于施用化合物的已知方法进行。
[0064]
本发明的药物组合物可以配制成口服、吸入或可注射剂型，例如片剂、胶囊剂、粉末剂、溶液剂、悬浮剂和乳剂。
[0065]
优选地，药物组合物中的药学上可接受的赋形剂包括任何和所有的溶剂、稀释剂、或其他载剂、分散剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，如适合于期望的特定剂型。
[0066]
可以用作药学上可接受的赋形剂的材料的一些例子包括但不限于：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂；海藻酸；无热原水；用于调节渗透压的盐类；无菌水；乙醇；防腐剂、稳定剂、表面活性剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂等。
[0067]
本发明的药物组合物可以使用本领域已知的合适方法适当地配制，例如公开于remington's pharmaceutical science(最近版本),mack publishing company,easton pa中的方法。
[0068]
在一个优选的实施方案中，本发明提供了口服施用本发明的化合物或药物组合物。
[0069]
在这样的实施方案中，药物组合物优选为片剂或胶囊剂的形式。
[0070]
根据替代的优选实施方案，肠胃外施用本发明的化合物或药物组合物，优选通过静脉内施用或连续输注。这种施用途径特别适合于插管的或病危的covid-19患者。
[0071]
在又一替代的优选实施方案中，本发明提供了将本发明的化合物或药物组合物直接施用于呼吸道。直接施用于呼吸道可以是化合物或组合物的唯一施用途径，或者可以与
以下组合施用：通过其他全身途径或局部途径施用化合物或组合物。
[0072]
本领域已知用于将本发明的化合物或组合物直接施用于呼吸道的多种装置。在本发明的一方面，本发明的化合物或药物组合物以雾化或吸入的形式施用。
[0073]
如上所述的用于直接施用于呼吸道的本发明的药物组合物可以是气雾剂制剂的形式、作为干粉剂或作为合适的稀释剂中的溶液剂或悬浮剂。
[0074]
根据本发明的化合物的给药方案是通常用于该特定化合物的其他适应症的给药方案。
[0075]
根据本发明的用于治疗用途的化合物的剂量和施用频率将随以下而变化：采用的活性成分、使用的药学上可接受的赋形剂/载体、所治疗的病症的严重程度、患者的年龄、体重、一般健康状况和性别、选择的施用途径和剂型、每天施用次数、治疗的持续时间、同时疗法的性质、以及主治医师知识和专业知识范围内的类似因素。本领域技术人员可以基于已知的化合物的药代动力学特性和给药方案，以容易和例行的方式确定最佳剂量学。
[0076]
例如，当化合物是雷洛昔芬或其盐(优选盐酸雷洛昔芬)时，优选将其以每天120mg的剂量口服施用于待治疗的受试者，分一次或两次施用。因此，每日总剂量可以以单次120mg的剂量施用或分为每天两次60mg的剂量施用。如熟练技术人员将理解的那样，根据具体情况，可能需要比上述剂量更低或更高的剂量。
[0077]
如上所述，本发明的第三目的是一种在受试者中治疗sars-cov-2感染的方法，其包括向受所述感染影响的患者施用选自以下的化合物：原黄素、雷洛昔芬、美喹他嗪、n-叔丁基异喹、异氟氧硫平、琥珀布可、金丝桃素及其盐。
[0078]
由于其抗病毒活性，本发明请求保护的化合物还可以用作抗微生物剂以去除表面的病毒污染。特别是，原黄素(优选以二盐酸盐或半硫酸盐的形式)特别可用于作为抗病毒剂以消除表面(优选体表)的病毒污染的用途。
[0079]
因此，本发明的第四目的是原黄素或其盐(优选原黄素二盐酸盐或半硫酸盐)作为用于预防和/或处理sars-cov-2污染表面的抗微生物剂的用途。
[0080]
优选地，所述表面是体表。
[0081]
将在以下实施例中进一步描述本发明，以下实施例并不限制本发明的范围，本发明的范围描述于权利要求中。
[0082]
实验部分
[0083]
1.计算机相关药物设计
[0084]
exscalate平台是目前欧洲最强大的用于支持智能计算机药物设计的计算资源(由h2020-fet-hpc antarex项目共同资助)，运用该平台进行了分子动力学(md)和对接模拟，最终目的是选择和提供对sars-cov-2蛋白具有活性的分子。
[0085]
sars-cov-2蛋白质组的主要功能单元的晶体结构获自protein data bank；
[0086]
下表1报告了分析的蛋白质的列表以及对应的pdb编码。对于无法获得晶体结构的蛋白质，生成并使用了其同源模型。特别是，选择了作为鉴定抗病毒药物的靶标最令人感兴趣的sars-cov-2蛋白。
[0087]
表1
[0088]
蛋白质pdb编码3cl蛋白酶6lu7
n-蛋白6vyonsp36w02nsp6从头(de novo)模型nsp96w4bnsp127bv2nsp13同源模型nsp14同源模型nsp156w01nsp166w4hpl蛋白酶6w9c刺突蛋白-ace26m0j
[0089]
对sars-cov-2蛋白进行了分子动力学模拟，以探索活性位点的构象空间并选择数种特别适合于对接模拟的蛋白质构象。
[0090]
在第一步中，对蛋白质结构进行了特别为此(ad hoc)准备的md模拟，以从化学和构象的角度优化3d结构。首先，通过最陡下降法对结构进行能量最小化循环，以消除所有初始空间位阻冲突(clash)并获得起始的预平衡模型。然后，对溶剂原子进行100ps的限制性md模拟(通常为1000kj/摩尔力常数)，以平衡使溶质保持受限制的水分子。最后，进行生产运行以生成1微秒轨迹，共收集20000个。对结果进行hpc运行后分析。
[0091]
在第二步中，在晶体结构和从md运行中提取的100种最相关构象上进行了高性能计算(hpc)模拟，以虚拟筛选safe in man(sim)文库，该文库含有已证明在人中安全并针对sars-cov-2的蛋白质的商业化的和正在开发的药物(》10000种药物)。
[0092]
sim文库是domp
é
的一个数据集，含有约10000种药物化合物，其建立如下：合并了已上市或在数个临床阶段中积极开发的药物列表与在早期阶段(生物测试和临床前阶段)的分子列表，并匹配查询(query)“cov抑制剂”作为作用机制。这两个列表均源自integrity数据库检索(https://clarivate.com/cortellis/solutions/pre-clinical-intelligence-analytics/)。已基于类别的作用机制(抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗真菌等)和integrity数据库中报告的信息与药物重新定位数据库“repodb”包括的信息的合并信息，对所有化合物进行了分类。此外，也将drugcentral提供的与药品、药物作用模式、适应症和药理作用有关的药物信息以及drugbank数据库中报告的药物和药物靶点信息整合至domp
é
药物虚拟文库中。
[0093]
使用的ligprep工具来准备配体。该过程为立体异构体、互变异构体、环构象(默认为1个稳定的环构象异构体)和质子化状态生成了多种状态。特别是，使用另一个包epik来指定在所选择的ph范围(ph＝7
±
1)会占主导地位的互变异构体和质子化状态。枚举了不明确的手性中心，以允许从每个输入结构中产生最多32个异构体。然后，用opls3力进行能量最小化。
[0094]
使用ligen
tm
(ligand generator)进行模拟，该软件是基于从头结构的虚拟筛选软件，设计和开发为在hpc架构上运行，代表了exscalate平台最相关的工具。ligen
tm
由一组工具组成，这些工具可以以用户定义的方式组合以生成以项目为中心的工作流。特别是，ligendock是一个对接模块，使用ligenscore计算评分函数，使用ligenpass和ligenpocket
模块获得结合位点的3d结构。本研究使用ligen中实施的对接算法、药效对接(pharmacophoric docking)(ligenph4)和几何对接(geometrical docking)(ligengeodock)以及计算出的不同评分函数，探讨了虚拟筛选(vs)的不同方案，并选择了在性能方面最佳的方案。
[0095]
通常，vs方案的性能通过评估其识别大量非活性诱饵中的活性分子的能力来评价，其中活性分子通常占化合物总数的1％。通过评估正确排名具有抗病毒活性(特别是对冠状病毒具有已知作用)的分子的能力来评价所测试的vs策略的性能。按照这种方法，将约130个分子标记为活性化合物。
[0096]
因此，采用不同的对接算法和不同的评分函数，比较了sim文库对sars-cov-2的3c样蛋白酶晶体结构和对md运行中提取的100种最相关构象的筛选结果，评估了vs方案的性能。使用显示出识别活性分子的最佳能力的条件，以确定经筛选分子的总列表的优先级，并根据预测分子在蛋白质结合位点中的结合亲和力的评分值(csopt)选择评分最高的化合物。
[0097]
对主要的sars-cov-2蛋白进行了虚拟筛选，以评估化合物对covid-19病毒的潜在多药理作用(poly-pharmacological effect)。
[0098]
还为每个分子计算了总分，其对应于每种蛋白质获得的对接评分的总和，并用于确定最令人感兴趣的分子的优先级。
[0099]
在总分(total_score，表示多药理概况)方面，在评分最高的分子中选择了原黄素、雷洛昔芬、美喹他嗪、n-叔丁基异喹、异氟氧硫平、琥珀布可和金丝桃素分子，用于在体外实验中进一步验证抑制活性。
[0100]
表2和表3报告了所选择的化合物对每种蛋白质获得的结果，而表4报告了每种化合物获得的总分。
[0101]
表2
[0102][0103]
表3
[0104][0105]
表4
[0106][0107][0108]
2.针对sars-cov-2的活性的体外筛选
[0109]
已在体外实验中确认了通过该筛选获得的结果，验证了它们的抗病毒活性。
[0110]
在sars-cov 2veroe6-egfp hts抗病毒测定中测试了通过cadd分析选择的化合物。该测定基于veroe6细胞的病毒感染，然后对细胞病变作用进行视觉监测。
[0111]
详细而言，组成性表达egfp-荧光报告基因的细胞系veroe6-egfp获自jnj，而sars-cov-2获自比利时毒株(betacov/belgium/ghb-03021/2020)。
[0112]
将测试化合物以10mm溶解于二甲基亚砜(dmso)中，然后在细胞培养基中稀释至最终dmso浓度低于0.5％，并在384孔板中每孔与30ccid 50的sars-cov和2000个veroe6-egfp细胞混合。作为对照，还设置了每孔含有30ccid50的sars-cov细胞和2000个veroe6-egfp细胞的孔。
[0113]
在37℃孵育5天后，使用基于led的高内涵成像仪arrayscan记录每孔的egfp信号。
[0114]
进行标准全孔荧光板读数(自优化方案，每个384孔板约6min，4次读数/孔)，并测量测试化合物孔和对照孔的荧光总强度。
[0115]
还进行高内涵成像读数，使用5x物镜以允许一次拍摄384孔板的几乎整个孔(自动聚焦于每孔，无像素合并(binning)，1个通道)。每种化合物由高内涵成像获得两个值，示于表5中：
[0116]
汇合度％：这是与对照孔相比，测试化合物孔中汇合度增加的百分比，其基于视野的绿色总面积读数“spottotalareach2”。由于gfp标志物位于细胞质和细胞核中，因此它允许计算(仍然)被细胞覆盖的孔的表面(大的值表示微量滴定板底表面上仍然有很多细胞，
小的值表示大部分荧光(即细胞)消失)。
[0117]
抑制％：这是与对照孔相比，测试化合物孔中细胞数量增加的百分比，其基于细胞核数的总计数“validobjectcount”。细胞核比细胞质呈现出更亮的绿色，这允许计数细胞数量，前提是细胞密度不太高。
[0118]
表5
[0119]
化合物汇合度％抑制％原黄素8.56208.4盐酸雷洛昔芬45.2670.75美喹他嗪61.7462.09n-叔丁基异喹77.8644.99异氟氧硫平67.6735.39琥珀布可18.7337.53金丝桃素20.85na
[0120]
此外，通过测试化合物在8种不同浓度的抗病毒作用而获得剂量-反应曲线，从中获得每种化合物的ic50。该值表示能够扭转感染的细胞病变作用的半最大浓度，并且是物质抑制病毒性细胞死亡的效力的量度。
[0121]
每种测试化合物获得的结果示于下表6中。
[0122]
表6
[0123]
化合物ic50(μm)原黄素27.46盐酸雷洛昔芬9.78美喹他嗪5.99n-叔丁基异喹3.43异氟氧硫平106.22琥珀布可17.21金丝桃素0.25
[0124]
从结果中可以看出，与对照相比，所有化合物都能够抑制病毒复制和随后的病毒的细胞病变作用。
[0125]
此外，在基于fret的测定中评估了抑制sars-cov-2主要蛋白酶和木瓜蛋白酶样蛋白酶的蛋白活性的能力。
[0126]
在类似于zhang等人(pmid：32198291)报告的条件下进行sars-cov-2 3cl-pro的酶活性检测，并经过调整如下。通过共振能量转移(fret)测量酶活性，使用双标记底物dabcyl-ktsavlq
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sgfrkm-edans(bachem#4045664)，其含有在gln之后的蛋白酶特异性裂解位点。在完整的肽中，edans荧光被dabcyl基团淬灭。在酶解后，监测荧光产物的产生(ex/em＝340/460nm)(envision,perkin elmer)。
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还根据shin等人，2020(https://doi.org/10.1038/s41586-020-2601-5)最近的公开，开发了用于检测sars-cov-2plpro酶活性的生化测定。在此，我们使用商业来源的蛋白质(bps bioscience#100735)，并使用荧光标记的isg15作为底物(bostonbiochem isg15/ucrp amc,#ul-553)。在含有50mm tris(ph 7.5)和150mm nacl的缓冲液中进行测
定，使用100nm的sars-cov-2 3clpro和2.5μm fret底物。
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对于这两种测定，我们进行了初步筛选，其中将测试化合物(以10mm储存于100％dmso中)、阳性对照(吡啶硫酮锌(medchemexpress,#hy-b0572)，10mm，100％dmso中)和阴性对照(100％dmso)通过声波分配(acoustic dispensing)(echo,labcyte)转移至384孔测定微孔板中。将5μl测定缓冲液中的sars-cov-23cl-pro储存液(120nm)加入化合物板中，并在37℃孵育60min。该预孵育步骤有助于鉴定缓慢结合的推定的半胱氨酸反应性抑制剂。加入5μl底物(30μm，测定缓冲液中)后，终浓度为：15μm底物；60nm sars-cov-2蛋白酶；和0.2％dmso，总体积为10μl/孔。然后在15min时测量荧光信号，并计算相对于对照的抑制(％)(envision,perkinelmer)。结果归一化至100％(阳性对照)和0％(阴性对照)抑制。为了标记可能的光学干扰效应，在加入底物后60min反应完成时，也读取初步测定板。在该实验设置中，一些用作阳性对照的化合物在dtt存在下抑制活性减慢或失去其抑制活性。因此，考虑到任何dtt依赖性效应，在没有dtt的测定缓冲液中进行初步筛选。
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在证明的独特测试化合物浓度20μm下进行初步筛选，以评价蛋白酶抑制。在没有dtt的情况下，使用在对数稀释(起始浓度0.033μm)之后8个不同浓度点的连续稀释，对所得化合物进行剂量应答的分析。
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为了选择化合物，我们评估了以下参数：
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抑制(％)：该参数与测定过程中显示的荧光信号严格相关。鉴于阳性和阴性对照荧光分别被认为是100％和0％；在该尺度下报告化合物孔中显示的荧光。有趣地，所有所选择的化合物都具有高于80％的抑制。
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对于所选择的三种化合物，确认了对sars-cov-2 3cl-pro和plpro-pro的活性。这些化合物获得的结果报告于表7中。
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表7
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化合物3cl-pro抑制[％]pl_pro抑制[％]盐酸雷洛昔芬20.0060.00原黄素89.86 金丝桃素45.6740.11