一种白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物及其制备方法和生物医学应用，属于医药技术领域。


背景技术：

2.前哨淋巴结是癌症转移的第一站淋巴结，其病理情况对肿瘤外科术式及术后综合治疗有重要的指导价值。前哨淋巴结活检是乳腺癌等癌症淋巴结分期的重要技术手段，这要求能够准确定位前哨淋巴结。前哨淋巴结定位的传统示踪剂包括染料、核素、荧光等。这些方式各有优势和弊端。其中，染料法(美兰、专利蓝和纳米碳)定位前哨淋巴结主要是通过术前在原发肿瘤周围和(或)皮下注射染料后，然后于腋窝区域循着被染料染色的淋巴管精细解剖找到第一枚被染色的淋巴结，从而确定前哨淋巴结的具体位置，然而这种方法需要精湛的外科解剖技巧，并且经过学习曲线后仍存在较高的前哨淋巴结活检假阴性率，导致前哨淋巴结活检的准确性难以把握；而核素法(
99m
tc-硫胶体)定位前哨淋巴结是通过术前于乳腺原发肿瘤周围腺体和(或)皮下注射放射性核素后，术中利用γ探测仪探测放射性计数，依据放射性计数找到计数较高的淋巴结，从而确定前哨淋巴结(大于最高放射性计数10％的淋巴结)的具体位置，虽然该方法前哨淋巴结活检的准确率高、特异性好，但是硫胶体并没有通过中国食品药品监督管理局的批准，限制了其在中国临床实际工作中的推广使用；荧光法(吲哚菁绿)定位前哨淋巴结的方法与染料法相似，主要是通过术前在乳腺原发肿瘤周围和(或)皮下注射荧光示踪剂后，术中利用近红外荧光显像仪循荧光显像发亮的淋巴管找到第一枚荧光显像阳性的淋巴结，从而定位前哨淋巴结的具体位置，然而由于荧光示踪剂分子需要近红外光源激发，其被激发所释放出荧光的穿透力只有9mm左右，所以活检过程中很难发现位置较深的淋巴管，从而导致前哨淋巴结的漏检，而且，吲哚菁绿(icg)通过淋巴管迁移的速度很快，能够很快迁移至前哨淋巴结下游的其他淋巴结，形成多个淋巴结的显像，并混淆前哨淋巴结和其他下游淋巴结，造成前哨淋巴结活检的偏差。因此，将吲哚菁绿与核素探针简单的联合使用无法检测到真正的前哨淋巴结，造成临床误差(araki k,mizokami d,tomifuji m,et al.otolaryngology
–
head and neck surgery.2014；151(2):279-285.)，因而也不是理想的前哨淋巴结示踪剂。
3.同位素在临床医学上已经获得广泛应用，根据同位素的种类分别可以用于spect成像(tc-99m，i-123，i-125，i-131，lu-177)，pet成像(i-124，f-18，ga-68，zr-89，cu-64)和核素放疗(i-125，i-131，lu-177)。近年来，同位素与近红外荧光分子联合使用，实现多模成像和诊疗一体化成为医学研究的热点。这类研究成果既能够利用同位素的全身显像能力或者核素治疗能力，又能够利用近红外荧光分子的术中导航能力、光学成像能力或光热治疗能力，因而具有重要的临床意义。其中，吲哚菁绿是一种获得长期临床应用的药品，具有高度的临床安全性，并且在近红外波段吸收和发光的性质，可用于光声成像、近红外荧光成像、术中导航和光热治疗，与同位素结合使用具有重要的临床转化潜力和应用价值。
盐酸溶液和高锝[tc-99m]酸钠溶液混合，静置后纯化，得到tc-99m标记的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物。
[0013]
优选的，所述放射性同位素为tc-99m，制备方法具体包括：
[0014]
向水中加入人血清白蛋白和吲哚菁绿，吲哚菁绿诱导人血清白蛋白自组装形成纳米颗粒，使用截留分子量不小于2000da的透析袋透析，透析后加入氯化亚锡溶液，并进行冷冻干燥，得到含有氯化亚锡的白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉；
[0015]
将高锝[tc-99m]酸钠溶液注射入白蛋白吲哚菁绿复合物干粉中，混合溶解，得到tc-99m标记的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物。
[0016]
优选的，所述放射性同位素为碘同位素，制备方法具体包括：
[0017]
向水中加入人血清白蛋白和吲哚菁绿，吲哚菁绿诱导人血清白蛋白自组装形成纳米颗粒，使用截留分子量不小于2000da的透析袋透析，透析后进行冷冻干燥，得到白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉；
[0018]
将白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液，得到白蛋白吲哚菁绿复合物溶液；将白蛋白吲哚菁绿复合物溶液、氯胺t水溶液、含碘同位素的溶液混合，静置后纯化，得到碘同位素标记的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物；其中，所述碘同位素为i-123、i-124或i-125。
[0019]
优选的，所述放射性同位素为碘同位素，制备方法具体包括：
[0020]
向水中加入人血清白蛋白和吲哚菁绿，吲哚菁绿诱导人血清白蛋白自组装形成纳米颗粒，使用截留分子量不小于2000da的透析袋透析，透析后冷冻干燥，得到白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉；
[0021]
将白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液，得到白蛋白吲哚菁绿复合物溶液；将1,3,4,6-四氯-3α，6α-二苯基甘脲涂抹于反应器底部并干燥；将白蛋白吲哚菁绿复合物溶液、含碘同位素的溶液加入涂抹有碘化试剂的反应器，静置后纯化，得到碘同位素标记的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物；其中，所述碘同位素为i-123、i-124或i-125。
[0022]
优选的，吲哚菁绿的质量占人血清白蛋白和吲哚菁绿总质量的5％-20％。
[0023]
采用所述的制备方法得到的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物。
[0024]
所述的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物在制备前哨淋巴结光学成像和/或核素成像的成像剂中的应用。
[0025]
优选的，所述核素成像为spect成像或pet成像。
[0026]
所述的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物在制备肿瘤光热治疗和/或放射治疗药物中的应用。
[0027]
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0028]
本发明白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物的制备方法，首先，通过吲哚菁绿在水中诱导人血白蛋白的自组装形成纳米颗粒，吲哚菁绿的含量能够有效影响所制备纳米颗粒的尺寸，实现粒径的可控制备；之后再进行放射性同位素的标记。本发明制备方法不同于常规先对白蛋白进行放射性标记再进行后续处理的方法，本发明先将吲哚菁绿与人血清白蛋白进行混合，通过自组装得到白蛋白吲哚菁绿复合物纳米颗粒，然后再对纳米颗粒进行放射性同位素标记，这种方式能尽量减少放射性同位素对操作人员的不良影响，具有高度的安全性和临床可操作性，制备过程绿色环保。
[0029]
进一步的，本发明在制备白蛋白吲哚菁绿复合物时，进行冷冻干燥得到冻干粉，可以防止白蛋白吲哚菁绿复合物水解。
[0030]
本发明制备得到了白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物，人血清白蛋白是人体血液中固有的成分，纯化的人血清白蛋白可用于人体静脉注射，是一种获得临床应用的药品，十分安全。即本发明所使用的人血清白蛋白和吲哚菁绿均为临床使用的药品，且未改变吲哚菁绿的化学实体结构。
[0031]
本发明的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物具有核素成像和近红外荧光成像的双模成像能力，能够用于制备前哨淋巴结光学成像和/或核素成像的成像剂，用于肿瘤前哨淋巴结定位和术中导航。与现有的单模式成像探针相比，能够提高癌症诊断的准确率和治疗的效果。
[0032]
本发明的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物能够通过光热治疗抑制肿瘤通过前哨淋巴结转移，还能通过放射治疗抑制肿瘤通过前哨淋巴结转移，因此能用于制备光热治疗和/或放射治疗药物。
附图说明
[0033]
图1为实施例1人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的电镜图；
[0034]
图2为实施例1、实施例2和实施例3中的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的粒径分布；
[0035]
图3为实施例1、实施例2和实施例3中的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的紫外-可见吸收谱；
[0036]
图4为实施例1、实施例2和实施例3中的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的荧光吸收谱；
[0037]
图5为实施例17人血清白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物溶液在激光照射下的温度-时间变化图；
[0038]
图6为实施例17人血清白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物在细胞内在近红外光照射下mtt测试结果；
[0039]
图7为实施例17人血清白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物在小鼠体内的荧光成像结果；
[0040]
图8为实施例17人血清白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物在小鼠体内的术中导航系统成像结果；
[0041]
图9为实施例17人血清白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物的放射性检测结果；
[0042]
图10为实施例17人血清白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物的spect成像结果；
[0043]
图11为4t1肿瘤荷瘤小鼠的生存曲线。
[0044]
放射性具体实施方式
[0045]
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行描述，这些描述只是进一步解释本发明的特征和优点，并非用于限制本发明的权利要求。
[0046]
本发明在研究中意外发现，吲哚菁绿能够在纯水中诱导白蛋白的自组装形成纳米颗粒，并且，吲哚菁绿的含量能够有效影响所制备纳米颗粒的尺寸。
[0047]
本发明首先制备一种白蛋白吲哚菁绿复合物，包含由人血清白蛋白和吲哚菁绿共
同自组装形成的纳米颗粒；还可以包含可静脉注射的氯化亚锡，以便于后续进行同位素tc-99m的标记。
[0048]
本发明所述白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物，是将所述白蛋白吲哚菁绿复合物使用放射性同位素进行标记得到。因此，所述白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物，包含由人血清白蛋白和吲哚菁绿共同自组装形成的纳米颗粒，所述纳米颗粒上标记有放射性同位素；放射性同位素种类优选tc-99m、i-123、i-124或i-125。放射性同位素的放射性活度为0.5-1000mci/mg。
[0049]
本发明所述白蛋白吲哚菁绿复合物的制备方法，包括：按照上述重量份数，向纯水中加入人血清白蛋白和吲哚菁绿，搅拌1-6小时后，使用截留分子量不小于2000da的透析袋透析12-48小时，再冷冻干燥，得到不含氯化亚锡的白蛋白吲哚菁绿复合物冻干粉。也可以在透析后加入氯化亚锡，再冷冻干燥，得到含氯化亚锡的白蛋白吲哚菁绿复合物冻干粉。
[0050]
本发明所述白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物的制备方法，包括：
[0051]
将人血清白蛋白和吲哚菁绿加入水中，混合，透析，得到白蛋白吲哚菁绿复合物；其中，吲哚菁绿的质量占人血清白蛋白和吲哚菁绿总质量的5％-20％；
[0052]
对白蛋白吲哚菁绿复合物进行放射性同位素标记，得到白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物。
[0053]
针对不同的放射性同位素，制备方法具体包括：
[0054]
(a)tc-99m的标记：
[0055]
首先，将不含氯化亚锡的白蛋白吲哚菁绿复合物冻干粉溶解于水中，得到浓度为0.1-10mg/ml白蛋白吲哚菁绿复合物水溶液；其次，将sncl2溶解于盐酸溶液，得到sncl2盐酸溶液；再次，将白蛋白吲哚菁绿复合物水溶液、sncl2盐酸溶液和高锝[tc-99m]酸钠溶液混合，室温静置5-40分钟后纯化，得到tc-99m标记的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物。
[0056]
或者，将高锝[tc-99m]酸钠溶液注射入含氯化亚锡的白蛋白吲哚菁绿复合物冻干粉中，充分混合溶解，即得到tc-99m标记的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物。
[0057]
(b)i-123、i-124、i-125的标记(方法相同)：
[0058]
方法1：首先，将不含氯化亚锡的白蛋白吲哚菁绿复合物溶解于磷酸缓冲液(ph 7.0-9.5)，得到浓度为0.1-10mg/ml的白蛋白吲哚菁绿复合物溶液；其次，配制氯胺t(对甲苯磺酰氯胺钠)水溶液(1-30mg/ml)；再次，将白蛋白吲哚菁绿复合物溶液、氯胺t溶液、含碘同位素的溶液混合，室温静置10-30分钟后纯化，得到碘同位素标记的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物。
[0059]
方法2：首先，将不含氯化亚锡的白蛋白吲哚菁绿复合物溶解于磷酸缓冲液(ph 7.0-9.5)，得到浓度为0.1-10mg/ml的白蛋白吲哚菁绿复合物溶液；其次，iodogen(1,3,4,6-四氯-3α，6α-二苯基甘脲)涂抹于反应管底部并干燥；再次，将白蛋白吲哚菁绿复合物溶液、含碘同位素的溶液加入含有iodogen的反应管，室温静置10-30后纯化，得到碘同位素标记的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物。
[0060]
本发明白蛋白吲哚菁绿复合物的制备过程不需要其他任何试剂，因而，工艺简单，成分安全。这是现有技术中从未报道过的结果。由于本发明技术制备白蛋白吲哚菁绿复合物的过程中采用了和文献中相比更简单的成分和制备工艺，所以本发明所开发的制剂和工艺属于新药研发所鼓励的范围，即，化学药品第三类新药规定的范围：“由已上市的多组分
药物制备为较少组分的原料药及其制剂”。后续的放射标记工艺是医院内部长期应用的人血清白蛋白放射标记技术。由此可见，尽管本发明无同类上市药品，但是即便和已有文献报道相比，已经明显具备技术的先进性和新药转化的潜力。
[0061]
本发明所述白蛋白吲哚菁绿复合物可用于制备光学成像的成像剂，通过近红外荧光成像用在肿瘤前哨淋巴结定位和术中导航中；或者制备光热治疗的药物，通过光热治疗抑制肿瘤通过前哨淋巴结转移。
[0062]
本发明所述白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物可用于制备光学成像和/或核素成像的成像剂，通过核素成像和近红外荧光成像用在肿瘤前哨淋巴结定位和术中导航中；或者，用于制备光热治疗和/或核素放疗的药物，通过光热治疗抑制肿瘤通过前哨淋巴结转移，或者通过放射治疗抑制肿瘤通过前哨淋巴结转移。
[0063]
放射性同位素为tc-99m、i-123、i-124或i-125时，所述白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物均可以用于光学成像和光热治疗。另外，根据标记的放射性同位素种类还可以用于spect成像(tc-99m，i-123，i-125)，pet成像(i-124)和核素放疗(i-125)。
[0064]
实施例1
[0065]
向10ml纯水中加入160mg人血清白蛋白和40mg吲哚菁绿，搅拌2小时后，使用截留分子量3000da的透析袋透析24小时，冷冻干燥，得到人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0066]
实施例2
[0067]
向10ml纯水中加入180mg人血清白蛋白和20mg吲哚菁绿，搅拌2小时后，使用截留分子量3000da的透析袋透析24小时，冷冻干燥，得到人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0068]
实施例3
[0069]
向10ml纯水中加入190mg人血清白蛋白和10mg吲哚菁绿，搅拌2小时后，使用截留分子量3000da的透析袋透析24小时，冷冻干燥，得到人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0070]
实施例4
[0071]
向20ml纯水中加入160mg人血清白蛋白和40mg吲哚菁绿，搅拌1小时后，使用截留分子量3000da的透析袋透析24小时，冷冻干燥，得到人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0072]
实施例5
[0073]
向10ml纯水中加入80mg人血清白蛋白和20mg吲哚菁绿，搅拌1小时后，使用截留分子量8000da的透析袋透析24小时，冷冻干燥，得到人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0074]
实施例6
[0075]
向5ml纯水中加入80mg人血清白蛋白和20mg吲哚菁绿，搅拌1小时后，使用截留分子量12000da的透析袋透析12小时，期间多次换水，冷冻干燥后得到人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0076]
实施例7
[0077]
向40ml纯水中加入800mg人血清白蛋白和200mg吲哚菁绿，搅拌6小时后，使用截留分子量8000-12000da的透析袋透析24小时，期间多次换水，冷冻干燥后得到人血清白蛋白
吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0078]
实施例8
[0079]
向300ml纯水中加入8000mg人血清白蛋白和2000mg吲哚菁绿，搅拌6小时后，使用截留分子量8000-12000da的透析袋透析48小时，期间多次换水，冷冻干燥后得到人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0080]
实施例8
[0081]
向250ml纯水中加入6000mg人血清白蛋白和1500mg吲哚菁绿，搅拌4小时后，使用截留分子量8000da的透析袋透析24小时，期间多次换水，冷冻干燥后得到人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0082]
实施例9
[0083]
向250ml纯水中加入6000mg人血清白蛋白和1500mg吲哚菁绿，搅拌4小时后，使用截留分子量8000da的透析袋透析24小时，期间多次换水，然后加入75mg氯化亚锡并冷冻干燥，得到含有氯化亚锡的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0084]
实施例10
[0085]
向250ml纯水中加入6000mg人血清白蛋白和1500mg吲哚菁绿，搅拌4小时后，使用截留分子量3000da的透析袋透析24小时，期间多次换水，然后加入50mg氯化亚锡并冷冻干燥，得到含有氯化亚锡的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0086]
实施例11
[0087]
向40ml纯水中加入800mg人血清白蛋白和200mg吲哚菁绿，搅拌6小时后，使用截留分子量5000da的透析袋透析24小时，期间多次换水，然后加入5mg氯化亚锡并冷冻干燥，得到含有氯化亚锡的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0088]
实施例12
[0089]
向10ml纯水中加入80mg人血清白蛋白和20mg吲哚菁绿，搅拌4小时后，使用截留分子量3000da的透析袋透析48小时，期间多次换水，然后加入5mg氯化亚锡并冷冻干燥，得到含有氯化亚锡的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0090]
实施例13
[0091]
向5ml纯水中加入80mg人血清白蛋白和20mg吲哚菁绿，搅拌2小时后，使用截留分子量2000da的透析袋透析48小时，期间多次换水，然后加入10mg氯化亚锡并冷冻干燥，得到含有氯化亚锡的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉。
[0092]
实施例14
[0093]
向10ml纯水中加入80mg人血清白蛋白和20mg吲哚菁绿，搅拌2小时后，使用截留分子量2000da的透析袋透析24小时，期间多次换水，取1.5ml白蛋白吲哚菁绿复合物的水溶液，加入10μl氯化亚锡的盐酸溶液(1mg/ml，ph＝4.5)和0.5ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液混合。室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0094]
实施例15
[0095]
向20ml纯水中加入80mg人血清白蛋白和20mg吲哚菁绿，搅拌4小时后，使用截留分子量8000da的透析袋透析18小时，期间多次换水，取1.5ml白蛋白吲哚菁绿复合物的水溶液，加入10μl氯化亚锡的盐酸溶液(0.5mg/ml，ph＝4.9)和0.5ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液混合。室温静置10分钟后使用超滤管离心纯化。
[0096]
实施例16
[0097]
向20ml纯水中加入80mg人血清白蛋白和20mg吲哚菁绿，搅拌4小时后，使用截留分子量8000da的透析袋透析18小时，期间多次换水，取1.5ml白蛋白吲哚菁绿复合物的水溶液，加入10μl氯化亚锡的盐酸溶液(1.5mg/ml，ph＝4.1)和0.5ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液混合。室温静置30分钟后使用超滤管离心纯化。
[0098]
实施例17
[0099]
将实施例1中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成1mg/ml的溶液a。并将氯化亚锡溶解于0.012摩尔/升的盐酸中形成1mg/ml的溶液b。然后将1.5ml的溶液a和10μl的溶液b快速混合，并加入0.5ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液，室温静置30分钟后使用超滤管离心纯化。
[0100]
实施例18
[0101]
将实施例2中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成1.5mg/ml的溶液a。并将氯化亚锡溶解于0.012摩尔/升的盐酸中形成1.2mg/ml的溶液b。然后将1.5ml的溶液a和10μl的溶液b快速混合，并加入0.5ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液，室温静置20分钟后使用超滤管离心纯化。
[0102]
实施例19
[0103]
将实施例3中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成2.5mg/ml的溶液a。并将氯化亚锡溶解于0.01摩尔/升的盐酸中形成1.5mg/ml的溶液b。然后将1.53ml的溶液a和12μl的溶液b快速混合，并加入0.6ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液，室温静置18分钟后使用超滤管离心纯化。
[0104]
实施例20
[0105]
将实施例4中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成3mg/ml的溶液a。并将氯化亚锡溶解于0.02摩尔/升的盐酸中形成1.5mg/ml的溶液b。然后将1.6ml的溶液a和8μl的溶液b快速混合，并加入1ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液，室温静置10分钟后使用超滤管离心纯化。
[0106]
实施例21
[0107]
将实施例5中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成2.5mg/ml的溶液a。并将氯化亚锡溶解于0.01摩尔/升的盐酸中形成1.1mg/ml的溶液b。然后将1.6ml的溶液a和12μl的溶液b快速混合，并加入0.3ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液，室温静置35分钟后使用超滤管离心纯化。
[0108]
实施例22
[0109]
将实施例6中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成0.5mg/ml的溶液a。并将氯化亚锡溶解于0.012摩尔/升的盐酸中形成1.5mg/ml的溶液b。然后将1.6ml的溶液a和12μl的溶液b快速混合，并加入0.6ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液，室温静置40分钟后使用超滤管离心纯化。
[0110]
实施例23
[0111]
将实施例7中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成0.1mg/ml的溶液a。并将氯化亚锡溶解于0.02摩尔/升的盐酸中形成0.7mg/ml的溶液b。然后将1.8ml的溶液a和5μl的溶液b快速混合，并加入1.6ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液，室温静置
20分钟后使用超滤管离心纯化。
[0112]
实施例24
[0113]
将实施例8中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成0.2mg/ml的溶液a。并将氯化亚锡溶解于0.015摩尔/升的盐酸中形成1.1mg/ml的溶液b。然后将1ml的溶液a和8μl的溶液b快速混合，并加入0.4ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液，室温静置22分钟后使用超滤管离心纯化。
[0114]
实施例25
[0115]
将实施例1中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成0.8mg/ml的溶液a。并将氯化亚锡溶解于水中形成1.1mg/ml的溶液b。然后将1ml的溶液a和8μl的溶液b快速混合，并加入0.4ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液，室温静置22分钟后使用超滤管离心纯化。
[0116]
实施例26
[0117]
将实施例2中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成0.5mg/ml的溶液a。并将氯化亚锡溶解于水中形成1mg/ml的溶液b。然后将1ml的溶液a和8μl的溶液b快速混合，并加入0.4ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液，室温静置22分钟后使用超滤管离心纯化。
[0118]
实施例27
[0119]
将0.2mg实施例9中制备的含有氯化亚锡的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成0.2mg/ml的溶液。并加入0.4ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液并快速混合，室温静置20分钟后使用超滤管离心纯化。
[0120]
实施例28
[0121]
将1.2mg实施例10中制备的含有氯化亚锡的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成1mg/ml的溶液。加入0.8ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液并快速混合，室温静置30分钟后使用超滤管离心纯化。
[0122]
实施例29
[0123]
将5mg实施例11中制备的含有氯化亚锡的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成2mg/ml的溶液。加入5ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液并快速混合，室温静置30分钟后使用超滤管离心纯化。
[0124]
实施例30
[0125]
将3.2mg实施例12中制备的含有氯化亚锡的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成2mg/ml的溶液。加入5ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液并快速混合，室温静置20分钟后使用超滤管离心纯化。
[0126]
实施例31
[0127]
将4.2mg实施例13中制备的含有氯化亚锡的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于纯水中，形成2mg/ml的溶液。加入4.5ml的高锝[tc-99m]酸钠溶液并快速混合，室温静置40分钟后使用超滤管离心纯化。
[0128]
实施例32
[0129]
将4.2mg实施例1中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.0)中，形成2mg/ml的溶液。再加入20μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和4ml的i-123溶
液，并快速混合，室温静置20分钟后使用超滤管离心纯化。
[0130]
实施例33
[0131]
将4.2mg实施例2中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.5)中，形成3mg/ml的溶液。再加入14μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和2ml的i-124溶液，并快速混合，室温静置10分钟后使用超滤管离心纯化。
[0132]
实施例34
[0133]
将2mg实施例3中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.9)中，形成2mg/ml的溶液。再加入10μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和0.5ml的i-123溶液，并快速混合，室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0134]
实施例35
[0135]
将2mg实施例4中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.9)中，形成2mg/ml的溶液。再加入10μl氯胺t水溶液(1.2mg/ml)和1.5ml的i-123溶液，并快速混合，室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0136]
实施例36
[0137]
将4mg实施例5中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 8.5)中，形成2.5mg/ml的溶液。再加入15μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和2.5ml的i-123溶液，并快速混合，室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0138]
实施例37
[0139]
将6mg实施例6中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 9.5)中，形成3mg/ml的溶液。再加入20μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和4ml的i-123溶液，并快速混合，室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0140]
实施例38
[0141]
将4.2mg实施例7中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.0)中，形成2mg/ml的溶液。再加入20μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和4ml的i-125溶液，并快速混合，室温静置10分钟后使用超滤管离心纯化。
[0142]
实施例39
[0143]
将4.2mg实施例8中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.5)中，形成3mg/ml的溶液。再加入14μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和2ml的i-124溶液，并快速混合，室温静置10分钟后使用超滤管离心纯化。
[0144]
实施例40
[0145]
将2mg实施例1中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.9)中，形成2mg/ml的溶液。再加入10μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和0.5ml的i-125溶液，并快速混合，室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0146]
实施例41
[0147]
将2mg实施例2中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.9)中，形成2mg/ml的溶液。再加入10μl氯胺t水溶液(1.2mg/ml)和1.5ml的i-125溶液，并快速混合，室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0148]
实施例42
[0149]
将4mg实施例3中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲
液(ph 8.5)中，形成2.5mg/ml的溶液。再加入15μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和2.5ml的i-125溶液，并快速混合，室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0150]
实施例43
[0151]
将6mg实施例4中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 9.5)中，形成3mg/ml的溶液。再加入20μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和4ml的i-125溶液，并快速混合，室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0152]
实施例44
[0153]
将4.2mg实施例1中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.0)中，形成2mg/ml的溶液。再加入20μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和4ml的i-124溶液，并快速混合，室温静置20分钟后使用超滤管离心纯化。
[0154]
实施例45
[0155]
将4.2mg实施例2中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.5)中，形成3mg/ml的溶液。再加入14μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和2ml的i-124溶液，并快速混合，室温静置10分钟后使用超滤管离心纯化。
[0156]
实施例46
[0157]
将2mg实施例3中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.9)中，形成2mg/ml的溶液。再加入10μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和0.5ml的i-125溶液，并快速混合，室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0158]
实施例47
[0159]
将2mg实施例4中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.9)中，形成2mg/ml的溶液。再加入10μl氯胺t水溶液(1.2mg/ml)和1.5ml的i-124溶液，并快速混合，室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0160]
实施例48
[0161]
将4mg实施例5中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 8.5)中，形成2.5mg/ml的溶液。再加入15μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和2.5ml的i-25溶液，并快速混合，室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0162]
实施例49
[0163]
将6mg实施例6中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 9.5)中，形成3mg/ml的溶液。再加入20μl氯胺t水溶液(1mg/ml)和4ml的i-125溶液，并快速混合，室温静置15分钟后使用超滤管离心纯化。
[0164]
实施例50
[0165]
将10mg实施例1中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.4)中，形成3mg/ml的溶液。其次，将0.05mg iodogen(1,3,4,6-四氯-3α，6α-二苯基甘脲)的二氯甲烷溶液涂抹于反应管底部并干燥；再次，将白蛋白吲哚菁绿复合物的溶液、0.5ml的i-124溶液加入含有iodogen的反应管。室温静置30分钟后，使用超滤管离心纯化。
[0166]
实施例51
[0167]
将1mg实施例2中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.4)中，形成0.5mg/ml的溶液。其次，将0.2mg iodogen(1,3,4,6-四氯-3α，6α-二苯基甘脲)的二氯甲烷溶液涂抹于反应管底部并干燥；再次，将白蛋白吲哚菁绿复合物的溶
液、1ml的i-124溶液加入含有iodogen的反应管。室温静置20分钟后，使用超滤管离心纯化。
[0168]
实施例52
[0169]
将1mg实施例3中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.1)中，形成2mg/ml的溶液。其次，将0.5mg iodogen(1,3,4,6-四氯-3α，6α-二苯基甘脲)的二氯甲烷溶液涂抹于反应管底部并干燥；再次，将白蛋白吲哚菁绿复合物的溶液、3ml的i-125溶液加入含有iodogen的反应管。室温静置20分钟后，使用超滤管离心纯化。
[0170]
实施例53
[0171]
将2mg实施例4中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 7.5)中，形成2mg/ml的溶液。其次，将1mg iodogen(1,3,4,6-四氯-3α，6α-二苯基甘脲)的二氯甲烷溶液涂抹于反应管底部并干燥；再次，将白蛋白吲哚菁绿复合物的溶液、3ml的i-124溶液加入含有iodogen的反应管。室温静置10分钟后，使用超滤管离心纯化。
[0172]
实施例54
[0173]
将4mg实施例5中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 8.5)中，形成3mg/ml的溶液。其次，将2mg iodogen(1,3,4,6-四氯-3α，6α-二苯基甘脲)的二氯甲烷溶液涂抹于反应管底部并干燥；再次，将白蛋白吲哚菁绿复合物的溶液、5ml的i-123溶液加入含有iodogen的反应管。室温静置10分钟后，使用超滤管离心纯化。
[0174]
实施例55
[0175]
将6mg实施例6中制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的冻干粉溶解于磷酸缓冲液(ph 9.5)中，形成3mg/ml的溶液。其次，将3mg iodogen(1,3,4,6-四氯-3α，6α-二苯基甘脲)的二氯甲烷溶液涂抹于反应管底部并干燥；再次，将白蛋白吲哚菁绿复合物的溶液、2.5ml的i-123溶液加入含有iodogen的反应管。室温静置10分钟后，使用超滤管离心纯化。
[0176]
以下对制备的产物进行表征
[0177]
(1)将实施例1中的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物溶液滴加至透射电镜专用的铜网上，负染后用透射电镜观察。结果如图1所示，结果表明该条件下所制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物为粒径约10-16纳米的纳米颗粒。如图2为实施例1(20％)、实施例2(10％)和实施例3(5％)制备得到的纳米颗粒及人血清白蛋白的粒径分布，可以看出，在吲哚菁绿用量占人血清白蛋白和吲哚菁绿总质量20％时，得到的纳米颗粒的粒径在10-16nm，实施例2和实施例3制备得到的纳米颗粒尺寸小于10nm。
[0178]
(2)将实施例1(20％)、实施例2(10％)和实施例3(5％)中的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物溶液及吲哚菁绿(icg)的水溶液分别使用紫外-可见分光光度计进行表征吸收谱。结果如图3所示，结果表明所制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的吸收峰位于800nm波长附近。
[0179]
(3)将实施例1(20％)、实施例2(10％)和实施例3(5％)中的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物溶液及吲哚菁绿的水溶液分别使用荧光光谱仪进行表征吸收谱。结果如图4所示，结果表明所制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的荧光发射峰位于820nm波长附近。
[0180]
(4)将实施例17中的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物配制成100μg/ml的水溶液，使用790纳米波长的激光器以1w/cm2的功率进行照射，并使用温度计实时测量溶液的温度。结果如图5所示，在光照下，水溶液没有明显的升温作用，吲哚菁绿溶液和白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物的溶液都具有明显的升温现象。表明所制备的人血清白蛋白吲哚
菁绿复合物放射标记物能够在近红外光的照射下发生光热转化，具有潜在的光热治疗能力。
[0181]
(5)将实施例17中的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物配制成生理等渗的pbs缓冲液溶液，并分别以不同浓度加入培养有4t1细胞的96孔板中，孵育24小时后使用790纳米波长的激光器以1w/cm2的功率进行10分钟照射，并使用标准的mtt测试来进行表征。结果如图6所示，对照组(control)、单独光照组(light)和纳米颗粒孵育组(nc)的细胞都具有良好的细胞活力，但是纳米颗粒孵育并光照组(nc light)的细胞在高浓度纳米颗粒的情况下表现出明显的生长抑制效果。表明所制备的白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物能够在近红外光的照射下发生光热转化，在体外具有明显的光热治疗能力。
[0182]
(6)将实施例17中的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物配制成生理等渗的pbs缓冲液(1mg/ml)溶液。然后注射入小鼠后肢足垫(每只小鼠20μl)，然后用小动物活体荧光成像系统进行成像。结果如图7所示，给药后2小时内，所制备显像药物都可以在小鼠前哨淋巴结位置通过荧光成像设备观察到明显的荧光信号，表明所制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物能够用于前哨淋巴结的成像。
[0183]
(7)将实施例17中的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物配制成生理等渗的pbs缓冲液(2mg/ml)溶液。然后注射入大鼠后肢足垫(每只小鼠50μl)，然后用术中导航系统进行成像。结果如图8所示，成功进行显像，表明所制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物放射标记物能够用于前哨淋巴结的成像和术中导航。
[0184]
(8)将实施例17中完成tc-99m标记的溶液取2μl滴加于薄层色谱板上，然后使用85％的甲醇水溶液作为展开剂展开，并使用radiotlc机器进行读板。如图9所示，13mm位置的放射峰是tc-99m标记的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物，85mm位置的放射峰是游离的tc-99m，总标记效率约95％。
[0185]
(9)将实施例17中完成tc-99m标记的溶液注射入大鼠后肢足垫，然后用spect成像系统进行成像。结果如图10所示，给药后1小时至48小时，所制备显像药物都可以在小鼠前哨淋巴结位置通过spect观察到明显的放射性信号，表明所制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物能够用于前哨淋巴结的spect成像。
[0186]
(10)首先在小鼠后肢足垫注射4t1细胞，然后小鼠后肢腘窝淋巴结形成转移的肿瘤块后，将实施例17中完成tc-99m标记的溶液注射入小鼠后肢足垫，然后在成像系统的引导下进行成像和定位，并进行原位肿瘤组织的切除和前哨淋巴结的光热治疗。结果如图11所示，接受原位瘤手术切除(primary)或者前哨淋巴结光热治疗(ptt)的小鼠明显具有比未治疗组小鼠(untreated)更长的生存周期，接受原位瘤手术切除联合前哨淋巴结光热治疗的小鼠(ptt(primary sln))具有最长的生存周期。表明所制备的人血清白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物能够用于前哨淋巴结转移灶的光热治疗(ptt)，有效延长荷瘤小鼠寿命。结合原位瘤组织的手术治疗能够进一步延长荷瘤小鼠的寿命。
[0187]
综上所述，本发明的白蛋白吲哚菁绿复合物的放射标记物可用于前哨淋巴结光学/核素双模态显像、术中导航和抑制肿瘤通过前哨淋巴结转移；且制剂成分来源于临床药物，生物安全性好，采用的放射标记技术是医院核医学科常规院内放射标记技术，制备工艺绿色简单，适合工业化大生产，具有广阔的应用前景。