一种CHO细胞培养方法与流程

一种cho细胞培养方法
技术领域
1.本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种cho细胞培养方法。


背景技术：

2.动物细胞大规模培养已经被广泛应用于生产各类生物活性物质，如单克隆抗体、病毒疫苗、免疫调节因子、生长因子、特定肿瘤抗原以及各种基因重组蛋白质药物。动物细胞同微生物相比具有转录后修饰的能力，能够高效地表达和生产各类高质量的蛋白质。
3.目前，最为广泛使用的细胞系为中国仓鼠卵巢细胞(cho)细胞，cho细胞来源于中国仓鼠卵巢上皮细胞和纤维细胞。cho细胞系始于中国仓鼠卵巢cho-k1以及杂交瘤细胞等，其主要有以下优势：能悬浮培养，操作简单，易于放大；具有高效表达能力，且所分泌的蛋白具有正确的翻译后修饰功能；只分泌自身蛋白，有利于产物的纯化。大规模动物细胞悬浮培养作为商业化生产重组蛋白等需要糖基化修饰、结构复杂的蛋白质的重要手段，已成为生物制药的核心技术之一。
4.动物细胞悬浮培养就操作方式而言，主要分为batch(分批式)、fed-batch(流加式)、perfusion(灌流式)三种培养方式。在batch培养过程中，由于营养物不断消耗，代谢副产物不断积累，导致细胞培养周期短，蛋白产量低。fed-batch是指在细胞培养过程中，根据其代谢需求，连续或间接的流加特定的补料培养基，从而补充新鲜培养物质、稀释由于代谢产生的副产物，进而延长培养周期，最终获得更高的活细胞浓度和蛋白产量。perfusion是指把细胞和培养基一同加入反应器后，在细胞生长过程中，不断将旧培养基排出，同时不断灌注新的培养基的一种培养方法。其中，fed-batch培养是目前动物细胞放大培养中较为主流的操作方式。
5.动物细胞培养的相关研究内容还包括细胞培养条件及发酵参数的探索。例如可通过改进培养系统的氧传递效率、减少培养过程中细胞所受剪切力、优化培养过程中ph值等方法，从而延长细胞培养周期，增加细胞数量，使细胞蛋白产量增加。专利cn102021217b公开了一种采用动物细胞流加培养方式高效表达单克隆抗体的方法，通过不同阶段控制不同范围的细胞培养温度和ph值(三段法)，进行单克隆抗体高效表达。该专利在实施例部分与cn1869214a公开的细胞两阶段培养方法相比较，表达重组人ii型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白时，“三段法”的蛋白表达量为1.02g/l，“两段法”的蛋白表达量为0.71g/l；表达人源化抗her-2单克隆抗体时，“三段法”的蛋白表达量为1.04g/l，“两段法”最高蛋白表达量0.77g/l。有研究表明，仅通过优化细胞培养温度，会抑制细胞增殖，降低细胞相对数量，从而导致目的蛋白产量无法提高。因此，结合优化培养温度并综合考虑其他因素从而提高目的蛋白产量是本技术领域中需待解决的重要问题。
6.现有cho细胞培养工艺常用的流加培养工艺操作简单，可线性放大，但在培养过程中易出现培养时间短、收获活率低、蛋白产量低以及产品质量不稳定等问题。


技术实现要素：

7.针对现有cho细胞培养工艺培养过程中出现的细胞培养周期短、蛋白产量低、产品质量不稳定等问题，本发明公开了一种优化流加培养方式结合培养温度优化的动物细胞培养方法。本发明采用如下技术方案：
8.一种cho细胞培养方法，其特征在于，所述方法包括：
9.(a)将cho细胞在基础培养基中放大培养；
10.(b)进行高密度培养，从细胞处于对数生长期时开始每天流加补料培养基，所述补料培养基的流加量为初始培养物体积的1～3％。
11.在一项优选的实施方案中，所述补料培养基流加量为初始培养物体积的2％。
12.在一项优选的实施方案中，所述基础培养基选自cho细胞无血清培养基。
13.在一项优选的实施方案中，所述对数生长期是指细胞密度达到0.8～1
×
106cells/ml时即为对数生长期。
14.在一项优选的实施方案中，所述流加补料培养过程中，温度为32～37℃，搅拌转速为120～220rpm，溶氧含量为40～60％。
15.更优选地，所述流加补料培养过程中，温度为37℃，搅拌转速为150rpm，溶氧含量为50％。
16.在一项优选的实施方案中，所述流加补料培养过程中，当细胞密度达到6～8
×
106cells/ml时，调整培养温度为34
±
2℃，ph为6.90
±
0.2。
17.更优选地，所述流加补料培养过程中，当细胞密度达到6～8
×
106cells/ml时，调整培养温度为34
±
1℃，ph为6.90
±
0.05。
18.本发明还公开了所述cho细胞培养方法在生产单克隆抗体中的应用。
19.在一项优选的实施方案中，该方法用于生产抗her2的单克隆抗体。
20.本发明的有益效果在于：
21.(1)培养过程中可以保持高细胞密度，并维持细胞活率。
22.(2)培养温度降低至34℃，减缓细胞代谢，培养时间延长至14天，细胞活率维持在82％～91％。
23.(3)利用本发明方法，细胞株表达的蛋白浓度可达到1.9g/l。
附图说明
24.图1为实施例与对比例细胞生长曲线对比图。
25.图2为实施例与对比例细胞活率对比图。
26.图3为实施例与对比例细胞蛋白表达量对比图。
具体实施方式
27.以下将结合具体实施例对本发明中的技术方案做出进一步的阐述。下列实施例中未注明具体技术或条件者均按照本领域的文献中所描述的技术或条件进行。除另有说明外，下列实施例中所使用的试剂、药品及仪器均可通过常规商业手段获得，实施例中的基础培养基、补料培养基均可从健顺生物、上海奥浦迈等常规厂家购得。
28.对比例
29.根据专利2020112446131的工艺制备得到表达抗her2抗体的cho细胞，将细胞接种至装有cho基础培养基的细胞培养瓶中，置于摇床进行37℃恒温培养。摇床转速为100rpm，co2浓度设置为5％；每两天进行一次细胞传代，保持细胞处于早期对数生长期，细胞接种密度为0.8～1
×
106cells/ml；将细胞传代3次，群体倍增时间稳定后开始接种，接种至2l的生物反应器，培养时间为第0天(d0)，接种密度在1
×
106cells/ml，ph控制在7
±
0.1，搅拌速度为120rpm，每天取样，用细胞计数仪计数三次，取平均值，用台盼蓝染色法确定细胞存活率；培养第3天(d3)时，细胞处于对数生长期，开始隔天补加补料培养基，补料量为4％、6％、7％、6％、6％；培养过程中每天流加300g/l葡萄糖浓缩液，并控制葡萄糖浓度在4～6g/l。培养第11天(d11)收获，hplc法检测蛋白浓度。检测结果见表1。
30.表1对比例检测结果
[0031][0032]
结果表明，该培养方法培养的细胞只能生长到第11天，最高密度只有12.64
×
106cells/ml，细胞在第11天的活率只有79％，蛋白浓度只有1.09g/l。
[0033]
实施例
[0034]
根据专利2020112446131的工艺制备得到表达抗her2抗体的cho细胞，将细胞接种至装有cho基础培养基的细胞培养瓶中，置于摇床进行37℃恒温培养。摇床转速为100rpm，co2浓度设置为5％；每两天进行一次细胞传代，保持细胞处于早期对数生长期，细胞接种密度为0.8～1
×
106cells/ml；将细胞传代3次，群体倍增时间稳定后开始接种，接种至2l的生物反应器，培养时间为第0天(d0)，接种密度在1
×
106cells/ml，ph控制在7
±
0.2，搅拌速度为150rpm，每天取样，培养第4天(d4)时，细胞处于对数生长期，开始每天补加补料培养基，补料量为2％；培养过程中每天流加300g/l葡萄糖浓缩液，并控制葡萄糖浓度在4～6g/l。当细胞密度达到6～8
×
106cells/ml后降温至34℃，ph降为6.9
±
0.05进行培养；第14天(d14)收获，hplc法检测蛋白浓度。结果见表2。
[0035]
表2实施例检测结果
[0036][0037]
结果表明，与对比例相比，该培养方法培养的细胞能够生长到第14天，最高密度为22.08
×
106cells/ml，蛋白浓度为1.868g/l。在第13天的时候，细胞活率高达91％。
[0038]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。