用于治疗颗粒蛋白前体相关的神经退行性疾病或病症的腺伴随病毒(aav)系统
1.相关申请的交叉引用本技术根据35 u.s.c.
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119(e)要求于2019年10月22日提交的美国临时申请号62/924,340的利益，所述美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
2.本发明涉及基因治疗领域，包括用于在受试者或细胞中表达分离的多核苷酸的aav载体。本公开内容还涉及核酸构建体、启动子、载体和包括多核苷酸的宿主细胞，以及将外源dna序列递送至靶细胞、组织、器官或生物的方法，以及用于治疗或预防颗粒蛋白前体相关的神经退行性疾病或病症的方法。
背景技术：
3.基因治疗旨在改善患者的临床后果，所述患者患有由基因表达谱中的异常引起的遗传突变或获得性疾病。基因治疗包括治疗或预防起因于缺陷基因或者异常调控或表达例如表达不足或过表达(其可以导致病症、疾病、恶性肿瘤等)的医学状况。例如，由缺陷基因引起的疾病或病症可以通过向患者递送校正性遗传材料进行治疗、预防或改善，或者可以通过例如用校正性遗传材料，使患者的缺陷基因改变或沉默进行治疗、预防或改善，导致遗传材料在患者内的治疗性表达。
4.基因疗法的基础是供应具有活性基因产物(有时称为转基因或治疗性核酸)的转录盒，例如，其可以导致正面的功能获得效应、负面的功能丧失效应或另一种后果。此类后果可以归于治疗性蛋白质例如抗体、功能性酶或融合蛋白的表达。基因疗法也可以用于治疗由其它因素引起的疾病或恶性肿瘤。人单基因病症可以通过正常基因对靶细胞的递送和表达进行治疗。校正基因在患者的靶细胞中的递送和表达可以经由众多方法来进行，所述方法包括使用改造的病毒和病毒基因递送载体。
5.腺伴随病毒(aav)属于细小病毒科(parvoviridae)，且更具体而言构成依赖性细小病毒属。衍生自aav的载体(即重组aav (ravv)或aav载体)对于递送遗传材料是有吸引力的，因为(i)它们能够感染(转导)广泛多种非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而减少对病毒感染的宿主细胞应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒在人中被视为非病理性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组内的野生型aav形成对比，复制缺陷型aav载体缺乏rep基因并且一般作为附加体持续存在，因此限制了插入诱变或基因毒性的风险；并且(v)与其它载体系统相比，aav载体一般被视为相对较弱的免疫原，并且因此并不触发显著的免疫应答(参见ii)，因此获得载体dna的持久性和治疗性转基因的潜在地长期表达。
6.颗粒蛋白前体(pgrn)是广泛表达的分泌性糖蛋白，其充当许多细胞类型包括神经元细胞的营养因子，调节炎症，并且促进伤口修复。pgrn涉及多个过程的调控，所述过程包括发育、伤口愈合、血管生成、神经元细胞的生长和维持、以及炎症。pgrn在神经元和小胶质
trends in neurosci. 2014 37(7): 388-98)。
10.神经退行性病症代表了老龄化社会中相当大的社会和经济挑战。尽管ftd在痴呆谱系上在流行率和发病率方面仅次于阿尔茨海默氏症，但目前不存在用于ftd的批准治疗或治愈。神经退行性病症的目前治疗一般涉及通过医生减缓症状的进展并使患者更舒适的努力，并且大多数治疗仅掩盖神经衰退的进展。目前，在用于神经退行性疾病或病症的临床开发中不存在颗粒蛋白前体基因疗法。因此，仍然需要用于治疗神经退行性疾病或病症的方法和组合物。
技术实现要素：
11.本公开内容涉及重组腺伴随病毒(raav)载体，颗粒蛋白表达盒可以通过其进行包装，用于cns靶向递送至患有与颗粒蛋白前体(pgrn)突变相关的神经退行性病症的患者。
12.根据一个方面，本公开内容提供了分离的多核苷酸，其包含编码颗粒蛋白前体的核酸序列。根据一些实施方案，核酸序列是非天然存在的序列。根据一些实施方案，核酸序列编码哺乳动物颗粒蛋白前体。根据一些实施方案，哺乳动物颗粒蛋白前体是人颗粒蛋白前体。根据一些实施方案，核酸包含选自以下的序列：seq id no: 5、seq id no: 6、seq id no: 7、seq id no: 8、seq id no: 9、seq id no: 10、seq id no: 11、seq id no: 12、seq id no: 13和seq id no: 14。根据一些实施方案，核酸包含与选自以下的核酸序列具有至少85%同一性的序列：seq id no: 5、seq id no: 6、seq id no: 7、seq id no: 8、seq id no: 9、seq id no: 10、seq id no: 11、seq id no: 12、seq id no: 13和seq id no: 14。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 5组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 6组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 7组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 8具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸
包含与seq id no: 8具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 8具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 8具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 8具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 8具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 8具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 8组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 9组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 10组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 11组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 12组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 13组成。根据一些实施方案，核酸序列对于哺乳动物表达进行密码子优化。根据一些实施方案，核酸序列对于人细胞中的表达进行密码子优化。根据一些实施方案，核酸序列是cdna序列。
根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的功能优化的n末端信号序列。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的血凝素c末端标签。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的分拣蛋白结合抑制(sbi)结构域。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的神经元特异性人突触素-1启动子(hsyn1)。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的遍在活性的cba启动子。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii (camkii)启动子。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含ef1α启动子。根据一些实施方案，本文的各方面和实施方案中描述的任何启动子可以进一步包含位于启动子序列的5' (上游)的另外的cag/cmv增强子元件。根据一些实施方案，启动子进行优化以驱动高颗粒蛋白前体表达。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的3'utr调控区，其包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的多聚腺苷酸化信号。根据一些实施方案，多聚腺苷酸化信号是sv40多聚腺苷酸化信号。根据一些实施方案，多聚腺苷酸化信号是人生长激素(hgh)多聚腺苷酸化信号。根据一些实施方案，多核苷酸进一步包含可操作地连接的n末端信号序列，任选地包含血凝素c末端标签或分拣蛋白结合抑制(sbi)结构域，其可操作地连接到神经元特异性人突触素-1启动子、小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii (camkii)启动子、大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子、大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子、人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子、或遍在活性的cba启动子、遍在活性的ef1α启动子、或者在本文的任何方面或实施方案中阐述的任何启动子，进一步包含可操作地连接到3'utr调控区的另外的5' cag/cmv增强子元件，所述3'utr调控区包含可操作地连接到多聚腺苷酸化信号的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。
13.根据一些实施方案，本公开内容提供了宿主细胞，其包含本文的任何方面或实施方案的多核苷酸。根据一些实施方案，宿主细胞是哺乳动物细胞。
14.根据一些实施方案，本公开内容提供了重组单纯疱疹病毒(rhsv)，其包含本文的任何方面或实施方案的多核苷酸。
15.根据一些实施方案，本公开内容提供了转基因表达盒，其包含本文的任何一个方面或实施方案的多核苷酸、以及最小调控元件。根据一些实施方案，本公开内容提供了核酸载体，其包含权利要求24的表达盒。根据一些实施方案，载体是腺伴随病毒(aav)载体。根据一些实施方案，本公开内容提供了宿主细胞，其包含本文的任何方面或实施方案的转基因表达盒。根据一些实施方案，本公开内容提供了表达载体，其包含本文的任何方面和实施方案的多核苷酸。根据一些实施方案，载体是腺伴随病毒(aav)载体。根据一些实施方案，所述aav载体的衣壳序列的血清型和itr的血清型独立地选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11和aav12。
16.根据一些实施方案，本公开内容提供了重组腺伴随(raav)表达载体，其包含本文的任何方面和实施方案的多核苷酸、以及aav基因组盒。根据一些实施方案，aav基因组盒的侧翼为两个序列调节的反向末端重复。
17.根据一些实施方案，本公开内容提供了重组腺伴随(raav)表达载体，其包含本文
的任何一个方面和实施方案的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到n末端信号序列，任选地包含血凝素c末端标签或分拣蛋白结合抑制(sbi)结构域，其可操作地连接到神经元特异性人突触素-1启动子(hsyn)、小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii (camkii)启动子、大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子、大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子、人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子、或遍在活性的cba启动子、遍在活性的ef1α启动子、或者在本文的任何方面或实施方案中阐述的任何启动子，进一步包含可操作地连接到3'utr调控区的另外的5' cag/cmv增强子元件，所述3'utr调控区包含可操作地连接到多聚腺苷酸化信号的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)，其中两个序列调节的反向末端重复(itr)侧接aav基因组盒，并且进一步包含蛋白质衣壳变体。根据一些实施方案，多聚腺苷酸化信号是sv40或人生长激素(hgh)多聚腺苷酸化信号。根据一些实施方案，启动子进行优化以驱动高颗粒蛋白前体表达。根据一些实施方案，raav是选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aa-9、rhaav10 (也称为aavrh10)、aav10、aav11和aav12的血清型。根据一些实施方案，raav是选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、rh-aav10、aav10、aav11和aav12的血清型的变体或杂合体。根据一些实施方案，raav包含在aav病毒粒子内。
18.根据一些方面，本公开内容包含表达载体，其包含aavrh10-hsyn-pgrnwt。
19.根据一些实施方案，本公开内容提供了重组单纯疱疹病毒(rhsv)，其包含本文的任何方面或实施方案的表达载体。根据一些实施方案，本公开内容提供了宿主细胞，其包含本文的任何方面和实施方案的表达载体。根据一些实施方案，宿主细胞是哺乳动物细胞。
20.根据一些实施方案，本公开内容提供了转基因表达盒，其包含本文的任何方面和实施方案的多核苷酸、以及最小调控元件。根据一些实施方案，本公开内容提供了核酸载体，其包含本文的任何方面或实施方案的表达盒。根据一些实施方案，载体是腺伴随病毒(aav)载体。
21.根据一些实施方案，本公开内容提供了组合物，其包含本文的任何方面或实施方案的多核苷酸。根据一些实施方案，本公开内容提供了组合物，其包含本文的任何方面或实施方案的宿主细胞。根据一些实施方案，本公开内容提供了组合物，其包含本文的任何方面或实施方案的重组单纯疱疹病毒(rhsv)。根据一些实施方案，本公开内容提供了组合物，其包含本文的任何方面或实施方案的转基因表达盒。根据一些实施方案，本公开内容提供了组合物，其包含本文的任何方面或实施方案的表达载体。根据一些实施方案，组合物是药物组合物。
22.根据一些实施方案，本公开内容提供了治疗神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的多核苷酸施用于有此需要的受试者。
23.根据一些实施方案，本公开内容提供了治疗神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的转基因表达盒施用于有此需要的受试者。
24.根据一些实施方案，本公开内容提供了治疗神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的表达载体施用于有此需要的受试者。
25.根据一些实施方案，本公开内容提供了治疗神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的重组腺伴随(raav)表达载体施用于有此需要的受试者。
26.根据一些实施方案，本公开内容提供了预防神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的多核苷酸施用于有此需要的受试者。
27.根据一些实施方案，本公开内容提供了预防神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的转基因表达盒施用于有此需要的受试者。
28.根据一些实施方案，本公开内容提供了预防神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的表达载体施用于有此需要的受试者。
29.根据一些实施方案，本公开内容提供了预防神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的重组腺伴随(raav)表达载体施用于有此需要的受试者。
30.根据一些实施方案，本公开内容提供了治疗神经退行性病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用重组腺伴随(raav)病毒颗粒，其包含本文的任何方面或实施方案的多核苷酸。根据一些实施方案，本公开内容提供了预防神经退行性病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用重组腺伴随(raav)病毒颗粒，其包含本文的任何方面或实施方案的多核苷酸。根据一些实施方案，神经退行性病症的特征在于认知破坏、行为损害、缺陷型溶酶体贮存或其组合。根据一些实施方案，神经退行性病症是颗粒蛋白前体相关的神经退行性病症。根据一些实施方案，神经退行性病症是家族性额颞叶痴呆(ftd)、额颞叶变性(ftld)、神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl)或阿尔茨海默氏病(ad)。根据一些实施方案，神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl)是神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)。根据一些实施方案，施用针对中枢神经系统。根据一些实施方案，施用是静脉内的、脑室内的、鞘内的或其组合。
31.根据一个方面，本公开内容提供了用于产生重组aav病毒颗粒的方法，其包括：用第一重组疱疹病毒和第二重组疱疹病毒共感染悬浮细胞，所述第一重组疱疹病毒包含编码aav rep和aav cap基因的核酸，所述基因各自可操作地连接到启动子，所述第二重组疱疹病毒包含颗粒蛋白前体基因以及与所述基因可操作地连接的启动子；并且允许细胞产生重组aav病毒颗粒，从而产生重组aav病毒颗粒。根据一些实施方案，cap基因选自具有选自aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、rh-aav-10、aav11和aav12的血清型的aav。根据一些实施方案，第一疱疹病毒和第二疱疹病毒是选自巨细胞病毒(cmv)、单纯疱疹病毒(hsv)和水痘带状疱疹(vzv)和eb病毒(ebv)的病毒。根据一些实施方案，疱疹病毒是复制缺陷型的。根据一些实施方案，共感染是同时的。
附图说明
32.图1显示了pgrn构建体的示意图，其包含在每个端部处的反向末端重复(itr)、人突触素1 (hsyn1)或鸡β肌动蛋白(cba)启动子、任选地包含c末端ha标签或c末端中的3-16个核酸的缺失的pgrn、土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件(wpre)、sv40早期多聚腺苷酸化信号(sv40pa)和任选的填充dna。下图显示了自互补aav基因组的示意图。
33.图2显示了鸡β肌动蛋白(cba)启动子的核酸序列(seq id no: 1)。
34.图3显示了人突触素1 (hsyn1)启动子的核酸序列(seq id no: 2)。
35.图4显示了用于单链(ss)和自互补(sc) aav基因组的5'-3'反向末端重复(itr) (seq id no: 3)。
36.图5a显示了仅用于单链(ss) aav基因组的3
’‑5’ꢀ
itr (seq id no: 4)。图5b显示了仅用于自互补(sc) aav基因组的3
’‑5’ꢀ
trs (seq id no: 26)。trs指缩短的itr。
37.图6显示了野生型人颗粒蛋白前体(hpgrnwt)的核酸序列(seq id no: 5)。
38.图7显示了野生型小鼠颗粒蛋白前体(mpgrnwt)的核酸序列(seq id no: 6)。
mpgrnwt与hpgrn是78%相似的。
39.图8显示了猕猴(恒河猴(macaca mulatta))的核酸序列(seq id no: 7)。猕猴pgrn与hpgrn是96%相似的。
40.图9显示了hpgrncoa的核酸序列(seq id no: 8)。
41.图10显示了hpgrncob的核酸序列(seq id no: 9)。
42.图11显示了hpgrncoc的核酸序列(seq id no: 10)。
43.图12显示了hpgrncod的核酸序列(seq id no: 11)。
44.图13显示了hpgrncoe的核酸序列(seq id no: 12)。
45.图14显示了hpgrncof的核酸序列(seq id no: 13)。
46.图15显示了hpgrn分拣蛋白结合缺陷变体的核酸序列(seq id no: 14)。
47.图16显示了血凝素(ha)标签的核酸序列(seq id no: 15)。
48.图17显示了wpre的核酸序列(seq id no: 16)。
49.图18显示了sv40 pa的核酸序列(seq id no: 17)。
50.图19显示了camkii启动子(364 bp)的核酸序列，其对应于来自genbank aj222796的序列，nuc 7625-7988 (seq id no: 18)。
51.图20显示了大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子(1034 bp)的核酸序列(seq id no: 19)。
52.图21显示了大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子(1801 bp)的核酸序列(seq id no: 20)。
53.图22显示了人血小板衍生生长因子-β链(pdgf-b)启动子的核酸序列(seq id no: 21 (pdgfb_1)、seq id no: 24 (pdg-b_2)和seq id no: 25 (pdgfb_3))。人基因组中存在三个限定的pdgf-b启动子，跨越染色体nc_000022.11的[-]链上的定位39244982
ꢀ–ꢀ
39244621。关于pdgf-b启动子的序列包括所提供的3个核心启动子序列中的最少1个或其任何独特的组合。散在的序列可以是任何非编码、非调控的功能序列，包括完全没有序列。
[0054]
图23显示了ef1α启动子(806 bp)的核酸序列(seq id no: 22)。
[0055]
图24显示了cag/cmv增强子的核酸序列(seq id no: 23)。
[0056]
图25概括了在鞘内注射后，测试非人灵长类动物中的gfp报道分子表达的raavrh10、aav9、δhsmax和aav2tyf衣壳的结果。显示了脑的不同区域中的gfp阳性细胞百分比和gfp强度。
[0057]
图26概括了通过注射到大池(icm)内，在非人灵长类动物中的raavrh10生物分布结果。
[0058]
图27显示了描绘实验结果的图，所述实验测试cba或hsyn启动子对hek293和sh-sy5y细胞中的gfp表达的作用。
[0059]
图28显示了描绘伴随和不伴随ad5载体，在hek293和shsy-5y细胞中的raavrh10-cba-hgfp转导后的gfp表达的图。
[0060]
图29显示了确定与野生型相比，6种pgrn密码子优化变体(指定为coa-cof)的蛋白质表达的elisa实验结果。
[0061]
图30显示了确定与野生型相比，6种pgrn密码子优化变体(指定为coa-cof)的蛋白质表达的蛋白质印迹实验结果。
[0062]
图31显示了描绘测试在hsyn启动子的控制下的密码子优化变体coe (pgrncoe)和cof (pgrncof)对hek 293细胞中的颗粒蛋白前体表达的作用的图。
[0063]
图32显示了确认颗粒蛋白前体表达的蛋白质印迹实验结果。
[0064]
图33显示了确定与野生型相比，6种pgrn密码子优化变体(指定为coa-cof)的蛋白质表达的elisa实验结果。
[0065]
图34显示了在nhp中用raavrh10-hsyn-pgrnwt的体内研究中，在8和10周后确定的颗粒蛋白前体表达。
具体实施方式
[0066]
定义除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有由本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下述参考为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：singleton等人，dictionary of microbiology and molecular biology (第2版1994)；the cambridge dictionary of science and technology (walker编辑，1988)；the glossary of genetics，第5版，r. rieger等人(编辑)，springer verlag (1991)；以及hale & marham，the harper collins dictionary of biology (1991)。如本文使用的，下述术语具有下文归于其的含义，除非另有说明。
[0067]
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个/种或多于一个/种(即至少一个/种)冠词的语法对象。例如，“元件”意指一个元件或多于一个元件。
[0068]
术语“包括”在本文中用于意指短语“包括但不限于”，并且可与短语“包括但不限于”互换使用。
[0069]
除非上下文另有明确说明，否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与术语“和/或”互换使用。
[0070]
术语“例如”在本文中用于意指短语“例如但不限于”，并且可与短语“例如但不限于”互换使用。
[0071]
如本文使用的，术语“施用(administer)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”等等，是指用于致使治疗剂或药物组合物递送至所需的生物作用部位的方法。
[0072]
如本文使用的，术语“aav病毒粒子”广义上是指完整的病毒颗粒，例如如野生型aav病毒粒子颗粒，其包含包装到aav衣壳蛋白内的单链基因组dna。单链核酸分子是有义链或反义链，因为两条链是同等感染性的。术语“raav病毒颗粒”指重组aav病毒颗粒，即其为感染性但复制缺陷型的颗粒。raav病毒颗粒包含包装到aav衣壳蛋白内的单链基因组dna。
[0073]
如本文使用的，术语“生物反应器”广义上是指可以用于培养细胞的目的的任何仪器。
[0074]
如本文使用的，术语“载体”意欲包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。补充的活性成分也可以掺入组合物内。短语“药学上可接受的”指当施用于宿主时，不产生毒性、过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。
[0075]
如本文使用的，术语“侧翼”指一个核酸序列关于另一个核酸序列的相对位置。一般地，在序列abc中，b的侧翼为a和c。排列axbxc也是如此。因此，侧翼序列在侧接序列之前或之后，但无需与侧接序列邻接或紧邻。
[0076]
如本文使用的，术语“基因递送”意指通过其将外源dna转移到宿主细胞用于基因疗法的应用的过程。
[0077]
如本文使用的，术语“基因”或“编码序列”广义上是指编码蛋白质的dna区域(转录区域)。当置于适当的调控区例如启动子的控制下时，编码序列被转录(dna)且翻译(rna)成多肽。基因可以包含几个可操作连接的片段，例如启动子、5'-前导序列、编码序列和3'-非翻译序列，包含多聚腺苷酸化位点。短语“基因的表达”指其中基因被转录成rna和/或翻译成活性蛋白质的过程。
[0078]
如本文使用的，如本文使用的术语“目的基因(goi)”广义上指引入aav表达载体内的异源序列，并且通常指编码在人或动物中具有治疗用途的蛋白质的核酸序列。
[0079]
如本文使用的，术语“疱疹病毒”或“疱疹病毒科”广义上是指具有相对较大基因组的有包膜的双链dna病毒的一般科。该科在广泛范围的脊椎动物和无脊椎动物宿主的核中复制，在优选的实施方案中，在哺乳动物宿主例如在人、马、牛、小鼠和猪中复制。疱疹病毒科的示例性成员包括巨细胞病毒(cmv)、单纯疱疹病毒1型和2型(hsv1和hsv2)和水痘带状疱疹(vzv)和eb病毒(ebv)。
[0080]
如本文使用的，术语“异源的”意指衍生自基因型不同于它与之进行比较或者引入或掺入其内的实体其余部分的实体。例如，通过遗传改造技术引入不同细胞类型内的多核苷酸是异源多核苷酸(并且在表达时，可以编码异源多肽)。类似地，掺入病毒载体内的细胞序列(例如基因或其一部分)是关于载体的异源核苷酸序列。
[0081]
如本文使用的，术语“增加”、“增强”、“上升”(和类似术语)一般指相对于天然、预计或平均值，或者相对于对照条件，直接或间接地增加浓度、水平、功能、活动或行为的动作。
[0082]
如本文使用的，术语“感染”广义上是指通过病毒将异源dna递送到细胞内。如本文使用的，术语“共感染”意指用两种或更多种病毒的“同时感染”、“双重感染”、“多重感染”或“连续感染”。用两种(或更多种)病毒感染生产细胞将被称为“共感染”。术语“转染”指通过物理或化学方法将异源dna递送至细胞的过程，例如借助于电穿孔、磷酸钙沉淀或本领域众所周知的其它方法转移到细胞内的质粒dna。
[0083]
如本文使用的，术语“反向末端重复”或“itr”序列是指在病毒基因组的末端处发现的相对短的序列，其处于相反取向。本领域众所周知的术语，“aav反向末端重复(itr)”序列是大约145个核苷酸的序列，其存在于天然单链aav基因组的两个末端处。itr最外面的核苷酸可以以两种替代取向中的任一种存在，导致在不同aav基因组之间和单个aav基因组的两端之间的异质性。
[0084]“野生型itr”、“wt-itr”或“itr”指aav或其它依赖病毒属(dependovirus)中天然存在的itr序列的序列，其保留例如rep结合活性和rep切口能力。由于遗传密码的简并性或漂移，来自任何aav血清型的wt-itr的核苷酸序列可能与规范的天然存在的序列略微不同，并且因此对于在本文中使用所涵盖的wt-itr序列包括由于在生产过程期间发生的天然存在的变化的wt-itr序列 (例如，复制错误)。
[0085]
如本文使用的，术语“末端重复”或“tr”包括任何病毒末端重复或合成序列，其包含至少一个最小所需复制起点和包含回文发夹结构的区域。rep结合序列(“rbs”) (也称为rbe (rep结合元件))和末端解离位点(“trs”)一起构成“最小所需复制起点”，并且因此tr包含至少一种rbs和至少一种trs。其在给定的多核苷酸序列段内是彼此的反向互补体的tr通常各自被称为“反向末端重复”或“itr”。在病毒的背景下，itr介导复制、病毒包装、整合和前病毒拯救。
[0086]
术语“在体内”指在生物如多细胞动物中或其内发生的测定或过程。在本文所述的一些方面，当使用单细胞生物如细菌时，方法或用途可以被说成“在体内”发生。术语“离体”指使用具有完整膜的活细胞执行的方法和用途，所述活细胞在多细胞动物或植物的机体外部，例如外植体、培养的细胞包括原代细胞和细胞系、转化的细胞系和提取的组织或细胞包括血细胞等。术语“在体外”指不要求具有完整膜的细胞存在的测定和方法，例如细胞提取物，并且可以指在非细胞系统中引入可编程的合成生物回路，例如不包含细胞或细胞系统的培养基，例如细胞提取物。
[0087]
如本文使用的，术语“分离的”分子(例如，分离的核酸或蛋白质或细胞)意指它已从其天然环境的组分中鉴定且分离和/或回收。
[0088]
如本文使用的，术语“最小调控元件”是指对于基因在靶细胞中的有效表达所必需的调控元件，并且因此应该包括在转基因表达盒中。此类序列可以包括例如启动子或增强子序列、促进dna片段插入质粒载体内的多接头序列、以及负责mrna转录物的内含子剪接和多聚腺苷酸化的序列。
[0089]
如本文使用的，术语“降到最低”、“减少”、“降低”和/或“抑制”(和类似术语)一般指相对于天然、预计或平均值，或者相对于对照条件，直接或间接地减少浓度、水平、功能、活动或行为的动作。
[0090]
如本文使用的，术语“神经系统”包括中枢神经系统和外周神经系统两者。术语“中枢神经系统”或“cns”包括脊椎动物的脑和脊髓的所有细胞和组织。术语“外周神经系统”指脑和脊髓以外的神经系统部分的所有细胞和组织。因此，术语“神经系统”包括但不限于神经元细胞，神经胶质细胞，星形胶质细胞，脑脊液(csf)中的细胞，胞间隙中的细胞，脊髓的保护性覆盖中的细胞，硬膜外细胞(即，硬脑膜外的细胞)，与神经组织邻近或接触或由其神经支配的非神经组织中的细胞，神经外膜、神经束膜、神经内膜、索、神经束等等中的细胞。
[0091]
如本文使用的，术语“非天然存在的”广义上是指在自然界中不存在的蛋白质、核酸、核糖核酸或病毒。例如，它可以是遗传修饰的变体，例如cdna或密码子优化的核酸。
[0092]
如本文使用的，“核酸”或“核酸分子”是指由单体核苷酸链组成的分子，例如dna分子(例如，cdna或基因组dna)。核酸可以编码例如启动子、pgrn基因或其一部分、或调控元件。核酸分子可以是单链或双链的。“pgrn核酸”指包含pgrn基因或其一部分、或者pgrn基因的功能变体或其一部分的核酸。基因的功能变体包括具有微小变异的基因变体，所述微小变异例如如沉默突变、单核苷酸多态性、错义突变以及并不显著改变基因功能的其它突变或缺失。
[0093]
dna和rna链的不对称端称为5' (五引物)和3' (三引物)端，其中5'端具有末端磷酸基，而3'端具有末端羟基。五引物(5')端具有在其末端处的脱氧核糖或核糖的糖环中第五个碳。核酸在体内以5'到3'方向合成，因为用于组装新链的聚合酶经由磷酸二酯键将每
个新核苷酸附着到3'-羟基(-oh)基团。
[0094]
如本文使用的，术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离，或者被修饰为含有以否则不存在于自然界中的形式的核酸区段，或者是合成的。当核酸构建体含有对于表达本公开内容的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
[0095]“编码”特定pgrn蛋白(包括其片段和一部分)的dna序列是转录成特定rna和/或蛋白质的核酸序列。dna多核苷酸可以编码翻译成蛋白质的rna (mrna)，或者dna多核苷酸可以编码不翻译成蛋白质的rna (例如trna、rrna或靶向dna的rna；也称为“非编码”rna或"ncrna")。
[0096]
如本文使用的，术语“可操作地连接的(operatively linked)”或“可操作地连接的(operably linked)”或“偶联的”可以指遗传元件的并列，其中元件处于允许其以预计方式操作的关系中。例如，如果启动子帮助启动编码序列的转录，则启动子可以是与编码区可操作地连接的。在启动子和编码区之间可能存在间插残基，只要这种功能关系得到维持。
[0097]
如本文使用的，关于参考多肽或核酸序列的“百分比(%)序列同一性”定义为在比对序列且在需要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，并且不将任何保守取代视为序列同一性的部分，候选序列中与参考多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。用于确定百分比氨基酸或核酸序列同一性目的的比对可以以在本领域技术内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件程序，例如current protocols in molecular biology (ausubel等人，编辑1987)，supp. 30，部分7.7.18，表7.7.1中描述的那些程序，并且包括blast、blast-2、align或megalign (dnastar)软件。比对程序的实例是align plus (scientific and educational software，pennsylvania)。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。为了本文的目的，给定氨基酸序列a与、对于或针对给定氨基酸序列b的%氨基酸序列同一性(其可以可替代地表述为与、对于或针对给定氨基酸序列b具有或包含一定%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)如下进行计算：100乘以分数x/y，其中x是在该程序的a和b的比对中，通过序列比对程序中评分为相同匹配的氨基酸残基数目，并且其中y是b中氨基酸残基的总数。应了解，氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度，a与b的%氨基酸序列同一性将不等于b与a的%氨基酸序列同一性。为了本文的目的，给定核酸序列c与、对于或针对给定核酸序列d的%核酸序列同一性(其可以可替代地表述为与、对于或针对给定核酸序列d具有或包含一定%核酸序列同一性的给定核酸序列c)如下进行计算：100乘以分数w/z，其中w是在该程序的c和d的比对中，通过序列比对程序中评分为相同匹配的核苷酸数目，并且其中z是d中核苷酸的总数。应了解，核酸序列c的长度不等于核酸序列d的长度，c与d的%核酸序列同一性将不等于d与c的%核酸序列同一性。
[0098]
如本文使用的，术语“药物组合物”或“组合物”是指任选地与至少一种药学上可接受的化学组分混合的、本文所述的组合物或试剂(例如重组腺伴随(raav)表达载体)，所述化学组分例如(尽管并不限于)载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂、赋形剂等等。
[0099]
如本文使用的，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物并且不限于最小长度。此类氨基酸残基聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于肽，寡肽，氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。全长蛋白质及其片段两者均由该
no: 18。根据一些实施方案，camkii启动子由seq id no: 18组成。根据一些实施方案，启动子是大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子。大鼠微管蛋白α1启动子是负责根据形态生长调控神经元基因表达的中等强度的启动子。大鼠ta1启动子在通过引用以其整体并入本文的gloster等人1994 j of neuroscience中进行描述。图20显示了大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子的核酸序列(seq id no: 19)。根据一些实施方案，ta1启动子包含seq id no: 19。根据一些实施方案，ta1启动子由seq id no: 19组成。根据一些实施方案，启动子是大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子。大鼠神经元特异性烯醇化酶启动子是中等强度的发育调控型启动子。图21显示了大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子的核酸序列(seq id no: 20)。根据一些实施方案，nse启动子包含seq id no: 20。根据一些实施方案，nse启动子由seq id no: 20组成。根据一些实施方案，启动子是人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子。人血小板衍生生长因子-β链启动子是对神经元和(神经元相关的)神经胶质细胞特异性的中等强度的启动子。人基因组中存在三个限定的启动子，跨越染色体nc_000022.11的[-]链上的定位39244982
ꢀ–ꢀ
39244621 (跨越362个核苷酸)。图22显示了人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子的核酸序列(seq id no: 21、seq id no: 24和seq id no: 25)。根据一些实施方案，pdgf-β链启动子包含seq id no: 21。根据一些实施方案，pdgf-β链启动子由seq id no: 21组成。根据一些实施方案，启动子是遍在活性的ef1α启动子。ef1a启动子是哺乳动物起源的强遍在启动子，其在大多数细胞类型包括cns的细胞中表达。图23显示了ef1α启动子的核酸序列(seq id no: 22)。根据一些实施方案，ef1α启动子包含seq id no: 22。根据一些实施方案，ef1α启动子由seq id no: 22组成。根据一些实施方案，本文的各方面和实施方案中阐述的任何启动子进一步包含另外的5
’ꢀ
cag/cmv增强子元件。cag/cmv增强子是衍生自影响强遍在cag启动子及其cmv亲本启动子的增强子的强增强子元件；两者通常用于增强核心启动子的转录活性。图24显示了cag/cmv增强子的核酸序列(seq id no: 23)。
[0102]
启动子可以被说成驱动它调控的核酸序列的表达或转录。短语“可操作地连接(operably linked)”、“可操作地定位”、“可操作地连接(operatively linked)”、“处于控制下”和“处于转录控制下”，指示启动子相对于它调控的核酸序列处于正确的功能定位和/或取向上，以控制该序列的转录起始和/或表达。如本文使用的，“反向启动子”指其中核酸序列处于反向取向上的启动子，使得编码链现在是非编码链，且反之亦然。反向启动子序列可以用于各个实施方案中，以调控开关的状态。另外，在各个实施方案中，启动子可以与增强子结合使用。
[0103]
启动子可以是与基因或序列天然相关的启动子，如可以通过分离定位于给定基因或序列的编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列而获得。此类启动子可以被称为“内源的”。类似地，在一些实施方案中，增强子可以是与定位于该序列下游或上游的核酸序列天然相关的增强子。
[0104]
在一些实施方案中，编码核酸区段置于“重组启动子”或“异源启动子”的控制下，这两者均指通常不与它在其天然环境中与之可操作地连接的编码核酸序列相关的启动子。重组或异源增强子指在其天然环境中通常不与给定核酸序列相关的增强子。此类启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子；从任何其它原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子；以及非“天然存在”的合成启动子或增强子，即包含不同转录调控区的不同元件，和/或通过本领域已知的遗传改造方法改变表达的突变。
[0105]
如本文使用的，术语“增强子”指顺式作用调控序列(例如，50-1,500个碱基对)，其结合一种或多种蛋白质(例如，激活蛋白或转录因子)，以增加核酸序列的转录激活。增强子可以位于它们调控的基因起始位点上游或基因起始位点下游最多1,000,000个碱基对。
[0106]
如本文使用的，术语“重组体”可以指这样的生物分子，例如基因或蛋白质，其(1)已从其天然存在的环境中取出，(2)不与基因在自然界中在其中发现的多核苷酸的全部或一部分相关，(3)可操作地连接到它在自然界中不与之连接的多核苷酸，或(4)在自然界中不存在。术语“重组体”可以用于提及克隆的dna分离物、化学合成的多核苷酸类似物或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由此类核酸编码的蛋白质和/或mrna。
[0107]
如本文使用的，术语“重组hsv”、“rhsv”和“rhsv载体”广义上是指分离的、遗传修饰形式的单纯疱疹病毒1型(hsv)，其含有掺入病毒基因组内的异源基因。术语“rhsv-rep2cap2”或“rhsv-rep2cap1”意指其中来自aav血清型1或2的aav rep和cap基因已掺入rhsv基因组内的rhsv，在某些实施方案中，编码目的治疗基因的dna序列已掺入病毒基因组内。
[0108]
如本文使用的，待通过本发明的方法治疗的“受试者”或“患者”或“个体”是指人或非人动物。“非人动物”包括任何脊椎动物或无脊椎动物生物。人受试者可以具有任何年龄、性别、种族或民族，例如高加索人(白人)、亚洲人、非洲人、黑人、非裔美国人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在一些实施方案中，受试者可以是临床环境中的患者或其它受试者。在一些实施方案中，受试者已经在经历治疗。在一些实施方案中，受试者是新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。
[0109]
如本文使用的，术语“疗效”指治疗的后果，所述治疗的结果被判断为期望和有益的。疗效可以包括直接或间接地阻止、减少或消除疾病表现。疗效还可以直接或间接地包括阻止、减少或消除疾病表现的进展。
[0110]
对于本文所述的任何治疗剂，治疗有效量可以最初根据初步体外研究和/或动物模型进行确定。治疗有效剂量也可以根据人数据进行确定。可以基于所施用化合物的相对生物利用度和效力来调整施加的剂量。基于上述方法及其它众所周知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。在下文概括了关于确定治疗有效性的一般原则，其可以在通过引用并入本文的goodman和gilman的the pharmacological basis of therapeutics，第10版，mcgraw-hill (new york) (2001)的第1章中找到。
[0111]
如本文使用的，术语“取代突变谱”是指在颗粒蛋白前体的结构域间区域中的一组保守氨基酸取代，所述保守氨基酸取代消除其5个弹性蛋白酶切割位点和/或2个其它的蛋白酶解切割位点中的一个或多个(参见例如，cenik等人，jbc 2012；zhu等人，cell 2002，这两者均通过引用以其整体并入本文)。根据一些实施方案，取代突变将减少或阻止pgrn被加工成颗粒蛋白。
[0112]
如本文使用的，术语“转基因”是指引入细胞内并且能够转录成rna并且任选地在适当条件下翻译和/或表达的多核苷酸。在一些方面，它赋予它引入其内的细胞所需的性质，或以其它方式导致所需的治疗或诊断后果。
[0113]
如本文使用的，“转基因表达盒”或“表达盒”可互换使用，并且指包括转基因的线性核酸段，其与一个或多个启动子或足以指导转基因转录的其它调控序列可操作地连接，但不包含衣壳编码序列、其它载体序列或反向末端重复区。表达盒可以另外包含一种或多
种顺式作用序列(例如启动子、增强子或阻遏物)、一种或多种内含子和一种或多种转录后调控元件。转基因表达盒包含核酸载体待递送至靶细胞的基因序列。这些序列包括目的基因(例如，pgrn核酸或其变体)、一种或多种启动子和最小调控元件。
[0114]
如本文使用的，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”疾病或病症是指疾病或病症的一种或多种体征或症状的减轻，疾病或病症程度的缩小，疾病或病症的稳定(例如，不恶化)状态，预防疾病或病症的传播，疾病或病症进展的延迟或减缓，疾病或病症状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。例如，当以有效量(或剂量)表达时，pgrn足以使异常生理应答得到预防、校正和/或正常化，例如足以使疾病或病症的临床显著特征减少至少约30%、更优选至少50%、最优选至少90%的疗效。“治疗”还可以指与未接受治疗的预计存活相比延长存活。
[0115]
如本文使用的，术语“载体”是指包含待在体外或体内递送到宿主细胞内的核酸的重组质粒或病毒。
[0116]
如本文使用的，术语“表达载体”指的是指导来自与载体上的转录调控序列连接的序列的rna或多肽表达的载体。表达的序列经常(但不一定)对细胞是异源的。表达载体可以包含另外的元件，例如，表达载体可以具有两种复制系统，因此允许其在两种生物中维持，例如在人细胞中用于表达以及在原核宿主中用于克隆和扩增。术语“表达”指涉及产生rna和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，适当时包括但不限于例如转录，转录物加工、翻译和蛋白质折叠，修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的rna，以及通过从基因转录的mrna翻译获得的多肽。术语“基因”意指当可操作地连接到适当的调控序列时，在体外或体内将(dna)转录为rna的核酸序列。基因可以包括或不包括在编码区之前和之后的区域，例如，5'非翻译(5'utr)或“前导”序列和3
’ꢀ
utr或“尾随”序列、以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
[0117]
如本文使用的，术语“重组病毒载体”是指包含一种或多种异源序列(即，非病毒起源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组aav载体的情况下，重组核酸的侧翼为至少一个反向末端重复序列(itr)。根据一些实施方案，重组核酸的侧翼为两个itr。
[0118]
如本文使用的，术语“重组aav载体(raav载体)”是指包含一种或多种异源序列(即，非aav起源的核酸序列)的多核苷酸载体，所述异源序列的侧翼为至少一个aav反向末端重复序列(itr)。当存在于已被合适的辅助病毒感染(或表达合适的辅助功能)，并且表达aav rep和cap基因产物(即aav rep和cap蛋白)的宿主细胞中时，此类raav载体可以被复制并包装到感染性病毒颗粒内。当raav载体掺入更大的多核苷酸内(例如，染色体或另一种载体例如用于克隆或转染的质粒中)，那么raav载体可以被称为“前载体(pro-vector)”，其可以在aav包装功能和合适的辅助功能的存在下，通过复制和衣壳化得到“拯救”。raav载体可以是多种形式中的任一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质复合、在脂质体内封装、以及在病毒颗粒例如aav颗粒中衣壳化。raav载体可以包装到aav病毒衣壳内，以生成“重组腺伴随病毒颗粒(raav颗粒)”。
[0119]
如本文使用的，术语“raav病毒”或“raav病毒颗粒”是指由至少一种aav衣壳蛋白和衣壳化的raav载体基因组组成的病毒颗粒。
[0120]
如本文使用的，“报道分子”指可以用于提供可检测读出的蛋白质。报道分子一般产生可测量的信号，例如荧光、颜色或发光。报道蛋白编码序列编码其在细胞或生物中的存
在很容易观察到的蛋白质。例如，荧光蛋白在用特定波长的光激发时促使细胞发荧光，萤光素酶促使细胞催化产生光的反应，而酶如β-半乳糖苷酶将底物转换为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报道多肽包括但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(lacz)、碱性磷酸酶(ap)、胸苷激酶(tk)、绿色荧光蛋白(gfp)及其它荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(cat)、萤光素酶和本领域众所周知的其它。
[0121]
转录调节剂指激活或阻遏目的基因例如pgrn转录的转录激活物和阻遏物。启动子是启动特定基因转录的核酸区域。转录激活物通常在转录启动子附近结合并募集rna聚合酶以直接启动转录。阻遏物与转录启动子结合，并且在空间上阻碍通过rna聚合酶的转录起始。取决于它们结合的位置以及细胞和环境条件，其它转录调节剂可以充当激活物或阻遏物。转录调节剂类别的非限制性实例包括但不限于同源域蛋白、锌指蛋白、翼螺旋(叉头)蛋白和亮氨酸拉链蛋白。
[0122]
如本文使用的，“阻遏蛋白”或“诱导蛋白”是与调控序列元件结合，并且分别阻遏或激活与调控序列元件可操作地连接的序列转录的蛋白质。如本文所述的优选阻遏蛋白和诱导蛋白对至少一种输入试剂或环境输入的存在或不存在敏感。如本文所述的优选蛋白质在形式上是模块化的，包含例如可分离的dna结合和输入试剂结合或响应元件或结构域。
[0123]
如本文使用的，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”用于提及组合物、方法及其分别的组分，其对于方法或组合物是必需的，但对包括无论是否是必需的未指定元件开放。
[0124]
如本文使用的，术语“基本上由
……
组成”指对于给定实施方案所需的那些元件。该术语允许存在实质上并不影响该实施方案的基本和新颖或功能特性的元件。“包含”的使用指示包括而不是限制。
[0125]
术语“由
……
组成”指如本文所述的组合物、方法及其分别的组分，其排除在实施方案的描述中未叙述的任何元件。
[0126]
如本文使用的，术语“基本上由
……
组成”指对于给定实施方案所需的那些元件。该术语允许存在实质上并不影响本发明的该实施方案的基本和新颖或功能特性的另外元件。
[0127]
术语“包括”在本文中用于意指短语“包括但不限于”，并且可与短语“包括但不限于”互换使用。
[0128]
术语“例如”在本文中用于意指短语“例如但不限于”，并且可与短语“例如但不限于”互换使用。
[0129]
如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“方法”的提及包括本文所述类型和/或在阅读本公开内容后对于本领域技术人员将变得显而易见的一种或多种方法、和/或步骤等等。类似地，除非上下文另有明确说明，否则单词“或”预期包括“和”。尽管下文描述了合适的方法和材料，但与本文所述的相似或等价的方法和材料可以用于本公开内容的实践或测试中。缩写“例如”衍生自拉丁语exempli gratia，并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“例如”与术语“如”同义。
[0130]
本文公开的本发明的替代元件或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组成员可以个别地或者与组的其它成员或本文发现的其它元件以任何组合被提及且请求保护。为
了方便和/或可专利性的原因，组的一个或多个成员可以包括在组中或从组中缺失。当发生任何此类包括或缺失时，本说明书在本文中被视为含有如此修饰的组，因此满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
[0131]
在任何方面的一些实施方案中，本文所述的公开内容并不涉及用于克隆人类的方法、用于修饰人类的种系遗传同一性的方法、人胚胎用于工业或商业目的的用途或用于修饰动物的遗传同一性的方法，所述方法很可能促使其遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医疗益处，以及起因于此类方法的动物。
[0132]
其它术语在本文中在本发明的各个方面的描述内进行定义。
[0133]
在本技术自始至终引用的所有专利及其它出版物；包括参考文献、授权专利、公开专利申请和共同未决专利申请，明确地通过引用并入本文，用于描述且公开例如此类出版物中描述的可以与本文描述的技术结合使用的方法学的目的。提供这些出版物仅由于其公开内容在本技术的提交日期之前。在这点上不应解释为承认由于在先发明或出于任何其他原因，本发明人无权先于此类公开内容。关于日期的所有声明或关于这些文件内容的表达基于申请人可获得的信息，并不构成关于这些文件的日期或内容正确性的任何承认。
[0134]
本公开内容的实施方案的描述并不预期是穷举的或将本公开内容限制为所公开的精确形式。尽管本公开内容的具体实施方案和实施例在本文中为了说明性目的进行描述，但如相关领域的技术人员将认识到的，各种等价修改在本公开内容的范围内是可能的。例如，虽然方法步骤或功能以给定次序呈现，但替代实施方案可以以不同次序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开内容的教导可以适当地应用于其它程序或方法。可以组合本文描述的各个实施方案，以提供进一步的实施方案。需要时，可以修改本公开内容的各方面，以采用上述参考和申请的组合物、功能和概念，以提供本公开内容的再进一步的实施方案。此外，由于生物学功能等价性的考虑，可以在蛋白质结构中进行一些改变，而不影响在种类或量方面的生物学或化学作用。可以按照详细描述对本公开内容进行这些及其它改变。所有此类修改都预期包括在所附权利要求的范围内。
[0135]
任何前述实施方案的特定元件可以组合或取代其它实施方案中的元件。此外，虽然已在这些实施方案的上下文中描述了与本公开内容的某些实施方案相关的优点，但其它实施方案也可以显示出此类优点，并且并非所有实施方案都必须显示出此类优点才能落入本公开内容的范围内。
[0136]
本文描述的技术通过下述实施例进一步说明，所述实施例决不应被解释为进一步限制性的。应当理解，本发明并不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不预期限制仅由权利要求限定的本发明的范围。
[0137]
ii. 核酸本文提供了用于潜在治疗用途的核酸分子的表征和开发。本公开内容提供了可以用于治疗神经退行性疾病或病症的启动子、表达盒、载体、试剂盒和方法。本公开内容的某些方面涉及将异源核酸递送至受试者，其包括施用重组腺伴随病毒(raav)载体。根据一些方面，本公开内容提供了治疗或预防神经退行性疾病或病症的方法，其包括将包含本文所述的raav载体的组合物递送至受试者，其中所述raav载体包含异源核酸(例如，编码pgrn的核酸)。本公开内容的目的是将编码pgrn的核酸递送至中枢神经系统(cns)，具有在cns中的
成功表达，以及神经退行性疾病的治疗。
[0138]
根据一些实施方案，所表达的pgrn蛋白对于治疗神经退行性疾病或病症是有功能的。在一些实施方案中，所表达的pgrn蛋白并不引起免疫系统反应。
[0139]
pgrn是由grn/grn基因编码的糖蛋白，具有多种细胞功能，包括神经营养、抗炎和溶酶体调控性质。grn基因中的突变可以导致额颞叶变性(ftd) (痴呆的原因)，以及神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl) (溶酶体贮积病)。两种疾病均与pgrn功能丧失相关，在其它特征中，导致增强的小胶质细胞神经炎症和溶酶体功能障碍。pgrn也已牵涉阿尔茨海默氏病(ad)。mendsaikhan等人cells. 2019 8(3): 230。
[0140]
根据一些实施方案，目的基因(例如，pgrn)进行优化，以在表达(和/或功能)方面优于野生型pgrn，并且进一步具有与野生型pgrn区别(在dna/rna水平下)的能力。
[0141]
根据一些实施方案，目的基因(例如，pgrn)进行优化，以抑制与分拣蛋白的结合。先前已显示了，pgrn c末端基序，pgrn(589
–
593) lrqll，对于sort1介导的内吞作用是必需的(zheng等人，plos one. 2011；6(6):e21023)。
[0142]
根据一些实施方案，目的基因(例如，pgrn)进行优化，以生成更少的颗粒蛋白产物。
[0143]“pgrn核酸”指包含pgrn基因或其一部分、或者pgrn基因的功能变体或其一部分的核酸。基因的功能变体包括具有微小变异的基因变体，所述微小变异例如如沉默突变、单核苷酸多态性、错义突变以及并不显著改变基因功能的其它突变或缺失。
[0144]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 5。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 5组成。
[0145]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1767 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 6。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 6组成。
[0146]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 7。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少
99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 7组成。
[0147]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 8。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 8组成。
[0148]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 9。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 9组成。
[0149]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 10。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 10组成。
[0150]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 11。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 11具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 11具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 11具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 11具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 11具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 11具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 11组成。
[0151]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 12。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 12组成。
[0152]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 13。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 13具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 13具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与
seq id no: 13具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 13具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 13具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 13具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 13具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 13组成。
[0153]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸具有来自c末端的3-16个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个)氨基酸的缺失。根据一些实施方案，pgrn的c末端中的缺失导致pgrn分拣蛋白结合和后续加工为各个颗粒蛋白的抑制。根据一些实施方案，编码pgrn蛋白的核酸由seq id no: 1组成，所述seq id no: 1具有来自c末端的3-16个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个)氨基酸的缺失。
[0154]
密码子优化编码定点多肽的多核苷酸可以根据本领域标准的方法进行密码子优化，用于在含有目的靶dna的细胞中表达。例如，如果预期的靶核酸在人细胞中，则考虑将编码pgrn的人密码子优化的多核苷酸用于本文所述的构建体中。
[0155]
根据一些实施方案，核酸序列对于哺乳动物表达进行密码子优化。
[0156]
iii. 用于神经退行性疾病的pgrn基因疗法本公开内容总体上提供了用于产生包含pgrn基因构建体的重组腺伴随病毒(aav)病毒颗粒的方法，及其在用于神经退行性疾病，且特别是特征在于部分或完全pgrn缺乏的神经退行性疾病，例如额颞叶痴呆(ftd)的基因治疗方法中的用途。如本文所述的aav载体在将核酸(例如，pgrn基因构建体)递送至cns的细胞，且特别是神经元细胞方面特别有效。本文描述了产生、评估且利用重组腺伴随病毒(raav)治疗载体的方法，所述治疗载体能够将pgrn有效递送到细胞内用于表达和后续分泌。本文描述了用于基于重组腺伴随病毒(raav)的基因疗法中的优化修饰的pgrn cdna和相关遗传元件，所述基因疗法用于神经退行性疾病，包括ftd的治疗和/或预防。
[0157]
重组腺伴随病毒(raav)载体可以有效地容纳pgrn靶基因和相关遗传元件两者。此外，此类载体可以设计为在cns的治疗相关细胞中特异性表达pgrn。本公开内容描述了产生、评估且利用raav治疗载体的方法，所述raav治疗载体能够将功能性pgrn基因有效递送至患者。
[0158]
pgrn基因构建体可以包含：(1)衍生自人、小鼠或猕猴的1.8千碱基(kb)非天然存在的密码子优化的pgrn cdna序列，其可以借助于以下具有对蛋白酶解切割为颗粒蛋白的抗性：(a)取代突变谱或通过3-16个c末端氨基酸缺失(以抑制分拣蛋白结合和后续加工为各个颗粒蛋白)，具有或不具有27个核苷酸的血凝素c末端标签，(2) 0.5 kb非天然存在的神经元特异性人突触素-1启动子(hsyn1)、或0.364 kb小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii (camkii)启动子、或1.034 kb大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子、或1.81 kb大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子、或1.47 kb人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子、或遍在活性的1.7 kb cba启动子、或遍在活性的0.81 kb ef1α启动子、或者根据本文的任何方面或实施方案的任何启动子，其中所述启动子进一步包含另外的0.35 kb 5
’ꢀ
cag/cmv增强子元件，全部进行优化以驱动高pgrn表达，(3) 0.9 kb非天然存在的3'-utr调控区，其包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)，随后为sv40或人生长激素(hgh)多聚腺苷酸化信号，(4)侧接aav基因组盒的两个天然存在的141碱基序列调节的反向末端重复(itr)，和(5)最
samulski)；heilbronnr&wegers，viralvectorsforgenetransfer:currentstatusofgenetherapeutics，于m.sch
ä
fer-korting(编辑)，drugdelivery，handbookofexperimentalpharmacology，197:143-170(2010)(下文heilbronn)；howarthjl等人，usingviralvectorsasgenetransfertools.cellbioltoxicol26:1-10(2010)(下文howarth)。下文描述的生产方法预期作为非限制性实例。
[0165]
aav载体生产可以通过包装质粒的共转染来完成。heilbronn。细胞系供应缺失的aav基因rep和cap以及所需的辅助病毒功能。腺病毒辅助基因va-rna、e2a和e4连同aavrep和cap基因一起转染到两种分开的质粒或单一辅助构建体上。还转染了重组aav载体质粒，其中aav衣壳基因替换为被itr包围(bracketed)的转基因表达盒(包含目的基因，例如pgrn核酸；启动子；和最小调控元件)。这些包装质粒通常转染到293细胞内，所述293细胞是组成型表达剩余所需的ad辅助基因e1a和e1b的人细胞系。这导致携带目的基因的aav载体的扩增和包装。
[0166]
目前已鉴定了aav的多种血清型，包括12种人血清型和来自非人灵长类动物的多于100种血清型。howarth等人cellbioltoxicol26:1-10(2010)。本发明的aav载体可以包含衍生自任何已知血清型的aav的衣壳序列。如本文使用的，“已知血清型”包含可以使用本领域已知方法产生的衣壳突变体。此类方法包括例如病毒衣壳序列的遗传操纵，不同血清型的衣壳区域的暴露表面的结构域交换，以及使用技术如标记物拯救的aav嵌合体生成。参见bowles等人markerrescueofadeno-associatedvirus(aav)capsidmutants:anovelapproachforchimericaavproduction.journalofvirology，77(1):423-432(2003)，以及其中引用的参考文献。此外，本发明的aav载体可以包含衍生自任何已知血清型的aav的itr。优选地，itr衍生自人血清型aav1-aav12之一。根据本发明的一些实施方案，采用假分型方法，其中将一种itr血清型的基因组包装到不同的血清型衣壳内。
[0167]
根据一些实施方案，衣壳序列衍生自人血清型aav1-aav12之一。根据一些实施方案，衣壳序列衍生自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav2.retro及其变体或杂合体(例如，具有hspg突变的aav2变体、(aav2-hbko、aavt-tt、aav44.9)、aav1 9杂合体)。根据一些实施方案，特定衣壳序列赋予增强的神经和脑转导。根据一些实施方案，衣壳序列衍生自对于靶向cns的细胞(例如，神经元细胞、星形胶质细胞)具有高嗜性的aav2变体。根据一些实施方案，aav是aav9。根据一些实施方案，aav是aavrh10。
[0168]
aav嗜性由不同病毒衣壳蛋白与其同源细胞受体之间的特异性相互作用决定。因此，可以选择具有对于待靶向组织适当的衣壳的raav。根据一些实施方案，重组aav载体可以通过以下直接靶向：病毒衣壳序列特别是aav三维结构的环出区域中的遗传操纵，或不同血清型的衣壳区域的暴露表面的结构域交换，或使用技术例如标记物拯救的aav嵌合体生成。参见bowles等人markerrescueofadeno-associatedvirus(aav)capsidmutants:anovelapproachforchimericaavproduction.journalofvirology，77(1):423-432(2003)，以及其中引用的参考文献。
[0169]
choi等人中提供了用于产生、纯化和表征重组aav(raav)载体的一种可能方案。一般地，涉及下述步骤：设计转基因表达盒，设计用于靶向特异性受体的衣壳序列，生成无腺病毒的raav载体，纯化且滴定。这些步骤在下文概括并且在choi等人中详细描述。
[0170]
转基因表达盒可以是单链aav(ssaav)载体或者包装为假双链转基因的“二聚体”或自互补aav(scaav)载体。choi等人；howarth等人。由于单链aavdna成为双链dna的所需转换，使用传统的ssaav载体一般导致基因表达的缓慢开始(从数天到数周，直到达到转基因表达的平台)。相比之下，scaav载体显示在静止细胞的转导后数小时内开始的基因表达，其在数天内达到平台。heilbronn。根据一些实施方案，使用scaav，其中scaav与单链aav相比具有快速的转导起始和增加的稳定性。可替代地，转基因表达盒可以在两种aav载体之间拆分，其允许递送更长的构建体。参见例如，dayas.和berns，k.i.，genetherapyusingadeno-associatedvirusvectors.clinicalmicrobiologyreviews，21(4):583-593(2008)(下文daya等人)。可以通过用限制性核酸内切酶消化适当的质粒(例如，含有pgrn基因的质粒)，以去除rep和cap片段，并且使含有aavwt-itr的质粒主链凝胶纯化，来构建ssaav载体。choi等人。随后，所需的转基因表达盒可以在适当的限制位点之间插入，以构建单链raav载体质粒。可以如choi等人中所述构建scaav载体。
[0171]
然后，可以通过双重cscl梯度分级来纯化raav载体以及合适的aav辅助质粒和pxx6ad辅助质粒的大规模质粒制剂(至少1mg)。choi等人。合适的aav辅助质粒可以选自pxr系列pxr1-pxr5，其分别允许aav2itr基因组交叉包装到aav血清型1至5的衣壳内。可以基于衣壳的目的细胞靶向的效率来选择适当的衣壳。可以采用改变基因组(即转基因表达盒)长度和aav衣壳的已知方法，以改善表达和/或基因转移到特定细胞类型(例如视网膜视锥细胞)。参见例如，yanggs，virus-mediatedtransductionofmurineretinawithadeno-associatedvirus:effectsofviralcapsidandgenomesize.journalofvirology，76(15):7651-7660。
[0172]
接下来，用pxx6辅助质粒、raav载体质粒和aav辅助质粒转染293细胞。choi等人。随后，使分级的细胞裂解物经受raav纯化的多步骤过程，随后为cscl梯度纯化或肝素琼脂糖凝胶柱纯化。raav病毒粒子的产生和定量可以使用斑点印迹测定进行确定。raav在细胞培养物中的体外转导可以用于验证病毒的感染性和表达盒的功能性。
[0173]
除choi等人中描述的方法之外，用于生产aav的各种其它转染方法可以用于本发明的上下文中。例如，瞬时转染方法是可获得的，包括依赖磷酸钙沉淀方案的方法。
[0174]
除用于产生raav载体的实验室规模的方法之外，本发明可以利用本领域已知的用于aav载体的生物反应器规模制造的技术，包括例如heilbronn；clement，n.等人large-scaleadeno-associatedviralvectorproductionusingaherpesvirus-basedsystemenablesmanufacturingforclinicalstudies.humangenetherapy，20:796-606。
[0175]
朝向实现可以产生大量临床级raav载体的可扩展生产系统的所需目标的进展在很大程度上已在生产系统中取得，所述生产系统利用转染作为在细胞中递送raav生产所需的遗传元件的手段。例如，已通过在其中第三质粒包含编码腺病毒辅助蛋白的核酸序列的三质粒转染系统中，用质粒转染代替腺病毒感染来规避污染性腺病毒辅助物的去除(xiao等人，1998)。在双质粒转染系统中的改善还已简化了生产过程，并且增加了raav载体生产效率((grimm等人，1998)。
[0176]
用于改善来自培养的哺乳动物细胞的raav产率的几种策略基于通过遗传改造产生的专门生产细胞的开发。在一种方法中，已通过使用遗传改造的“前病毒”细胞系完成了
在大规模上的raav生产，其中插入的aav基因组可以通过用辅助腺病毒或hsv感染细胞得到“拯救”。前病毒细胞系可以通过简单的腺病毒感染得到拯救，提供了相对于转染方案增加的效率。
[0177]
改善来自细胞的raav产率的第二种基于细胞的方法涉及使用遗传改造的“包装”细胞系，其在其基因组中包含aav rep和cap基因、或rep-cap和itr-目的基因两者(qiao等人，2002)。在前一种方法中，为了产生raav，包装细胞系或者被感染，或者用辅助功能和aav itr-goi元件转染。后一种方法需要感染或转染仅具有辅助功能的细胞。通常，使用包装细胞系的raav产生通过用野生型腺病毒或重组腺病毒感染细胞来启动。因为包装细胞包含rep和cap基因，所以无需外源供应这些元件。
[0178]
来自包装细胞系的raav产率已显示高于通过前病毒细胞系拯救或转染方案获得的产率。
[0179]
已使用重组hsv扩增子系统，使用基于来自单纯疱疹病毒(hsv)的辅助功能递送的方法，取得了改善的raav产率。尽管最初报道了(conway等人，1997)大约150-500个病毒基因组(vg)/细胞的适度水平的raav载体产率，但基于rhsv扩增子的系统的最近改善已提供了基本上更高产率的raav v.g.和感染性颗粒(ip)/细胞(feudner等人，2002)。扩增子系统是固有地复制缺陷的；然而，
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空壳”载体、可复制型(rchsv)或复制缺陷型rhsv的使用仍将免疫原性hsv组分引入raav生产系统内。因此，必须实施用于这些组分的适当测定以及用于其去除的相应纯化方案。
[0180]
除这些方法之外，本文描述了用于在哺乳动物细胞中产生重组aav病毒颗粒的方法，其包括用第一重组疱疹病毒和第二重组疱疹病毒共感染能够悬浮生长的哺乳动物细胞，所述第一重组疱疹病毒包含编码aav rep和aav cap基因的核酸序列，所述基因各自可操作地连接到启动子，所述第二重组疱疹病毒包含pgrn基因以及与所述pgrn基因可操作地连接的启动子，侧翼为aav反向末端重复以促进目的基因的包装，并且允许病毒感染哺乳动物细胞，从而在哺乳动物细胞中产生重组aav病毒颗粒。
[0181]
能够支持疱疹病毒复制的任何类型的哺乳动物细胞都适用于根据如本文所述的本发明的方法。相应地，哺乳动物细胞可以被视为用于复制如本文方法中所述的疱疹病毒的宿主细胞。本发明考虑了用作宿主细胞的任何细胞类型，只要细胞能够支持疱疹病毒的复制。合适的未遗传修饰的哺乳动物细胞的实例包括但不限于细胞系，例如hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。
[0182]
在本发明的各个实施方案中使用的宿主细胞可以衍生自例如哺乳动物细胞，例如人胚肾细胞或灵长类动物细胞。其它细胞类型可能包括但不限于bhk细胞、vero细胞、cho细胞或对于其建立了组织培养技术的任何真核细胞，只要细胞是疱疹病毒允许的。术语“疱疹病毒允许的”意指疱疹病毒或疱疹病毒载体能够在细胞环境内完成整个细胞内病毒生命周期。在某些实施方案中，如所述的方法在悬浮生长的哺乳动物细胞系bhk中发生。宿主细胞可以衍生自现有细胞系例如bhk细胞系，或从头开发。
[0183]
用于产生本文所述的raav基因构建体的方法还包括通过方法在哺乳动物细胞中产生的重组aav病毒颗粒，所述方法包括用第一重组疱疹病毒和(ii)第二重组疱疹病毒共感染能够悬浮生长的哺乳动物细胞，所述第一重组疱疹病毒包含编码aav rep和aav cap基因的核酸，所述基因各自可操作地连接到启动子，所述第二重组疱疹病毒包含pgrn以及与
所述pgrn基因可操作地连接的启动子；并且允许病毒感染哺乳动物细胞，且从而在哺乳动物细胞中产生重组aav病毒颗粒。如本文所述，疱疹病毒是选自以下的病毒：巨细胞病毒(cmv)、单纯疱疹病毒(hsv)和水痘带状疱疹(vzv)和eb病毒(ebv)。重组疱疹病毒是复制缺陷型的。根据一些实施方案，aav cap基因具有选自以下的血清型：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav2.retro及其变体或杂合体(例如，具有hspg突变的aav2变体、(aav2-hbko、aavt-tt、aav44.9)、aav 1 9杂合体)。根据一些实施方案，特定衣壳序列赋予增强的神经和脑转导。根据一些实施方案，aav是aav9。根据一些实施方案，aav是aavrh10。
[0184]
通过引用以其整体并入本文的美国专利申请公开号2007/0202587，描述了raav生产系统所需的元件。通过将基因构建体引入称为生产细胞的细胞内，在体外产生重组aav。用于产生raav的已知系统采用三种基础元件：(1)含有目的基因的基因盒，(2)含有aav rep和cap基因的基因盒，以及(3)“辅助”病毒蛋白的来源。
[0185]
第一基因盒由侧翼为来自aav的反向末端重复(itr)的目的基因进行构建。itr发挥功能以将目的基因直接整合到宿主细胞基因组内，并且对于重组基因组的衣壳化是必须的。hermonat和muzyczka，1984；samulski等人1983。第二基因盒含有rep和cap，编码raav复制和包装所需的蛋白质的aav基因。rep基因编码dna复制所需的四种蛋白质(rep 78、68、52和40)。cap基因编码构成病毒衣壳的三种结构蛋白(vp1、vp2和vp3)。muzyczka和berns，2001。
[0186]
需要第三元件是因为aav并不自行复制。辅助功能是来自辅助dna病毒的蛋白质产物，所述辅助dna病毒产生有助于raav的有效复制和包装的细胞环境。传统上，腺病毒(ad)已用于为raav提供辅助功能，但疱疹病毒也可以提供这些功能，如本文讨论的。
[0187]
使用合适的生产细胞系例如悬浮生长的bhk细胞，在体外进行用于基因疗法的raav载体的生产。适用于本发明的其它细胞系包括hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。
[0188]
任何细胞类型都可以用作宿主细胞，只要细胞能够支持疱疹病毒的复制。本领域技术人员将熟悉可以用于从宿主细胞生产疱疹病毒的广泛范围的宿主细胞。例如，合适的未遗传修饰的哺乳动物宿主细胞的实例可以包括但不限于细胞系，例如hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。
[0189]
宿主细胞可以适于在悬浮培养中生长。宿主细胞可以是幼仓鼠肾(bhk)细胞。悬浮生长的bhk细胞系衍生自贴壁bhk细胞系的适应。两种细胞系均是商购可得的。
[0190]
用于递送raav生产的所有所需元件的一种策略利用两种质粒和辅助病毒。这种方法依赖用含有编码必需基因产物的基因盒的质粒转染生产细胞，以及用提供辅助功能的ad感染细胞。该系统采用具有两种不同基因盒的质粒。第一种是编码待包装为raav的重组dna的前病毒质粒。第二种是编码rep和cap基因的质粒。为了将这些不同的元件引入细胞内，细胞用ad进行感染以及用两种质粒进行转染。由ad提供的基因产物由基因e1a、e1b、e2a、e4orf6和va编码。samulski等人1998: hauswirth等人2000；muzyczka和burns，2001。可替代地，在最近的方案中，ad感染步骤可以替换为用含有va、e2a和e4基因的腺病毒“辅助质粒”转染。xiao等人1998；matsushita等人，1998。
[0191]
虽然ad已照常规用作raav生产的辅助病毒，但还可以使用其它dna病毒，例如单纯
疱疹病毒1型(hsv-1)。已鉴定了aav2复制和包装所需的最小hsv-1基因集合，并且包括早期基因ul5、ul8、ul52和ul29。muzyczka和burns，2001。这些基因编码hsv-1核心复制机制的组分，即解旋酶、引物酶、引物酶辅助蛋白和单链dna结合蛋白。knipe，1989；weller，1991。hsv-1的这种raav辅助性质已用于重组疱疹病毒载体的设计和构建中，所述重组疱疹病毒载体能够提供raav生产所需的辅助病毒基因产物。conway等人，1999。
[0192]
使用合适的生产细胞系例如悬浮生长的bhk细胞，在体外进行用于基因疗法的raav载体的生产。适用于本发明的其它细胞系包括hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。
[0193]
任何细胞类型都可以用作宿主细胞，只要细胞能够支持疱疹病毒的复制。本领域技术人员将熟悉可以用于从宿主细胞生产疱疹病毒的广泛范围的宿主细胞。例如，合适的未遗传修饰的哺乳动物宿主细胞的实例可以包括但不限于细胞系，例如hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。
[0194]
宿主细胞可以适于在悬浮培养中生长。在本发明的某些实施方案中，宿主细胞是幼仓鼠肾(bhk)细胞。悬浮生长的bhk细胞系衍生自贴壁bhk细胞系的适应。两种细胞系均是商购可得的。
[0195]
基于rhsv的raav制造工艺本文描述了用于在悬浮生长的细胞中产生重组aav病毒颗粒的方法。来自连续建立的细胞系的悬浮或非锚定依赖性培养物是细胞和细胞产物的大规模生产的最广泛使用的手段。基于发酵技术的大规模悬浮培养具有用于制造哺乳动物细胞产物的明确优点。均质条件可以在生物反应器中提供，所述生物反应器允许温度、溶解氧和ph的精确监测和控制，并且确保可以获取代表性的培养样品。所使用的rhsv载体很容易在组织培养瓶和生物反应器两者中的允许细胞系上繁殖至高滴度，并且提供了顺应按比例扩大用于临床和市场生产所必需的病毒生产水平的生产方案。
[0196]
搅拌罐生物反应器中的细胞培养提供了非常高的体积比培养表面积，并且已用于病毒疫苗的生产(griffiths，1986)。此外，搅拌罐生物反应器已在工业上证明为可扩展的。一个实例是多板cell cube细胞培养系统。尤其是在基因疗法的背景下，生产感染性病毒载体的能力对制药工业越来越重要。
[0197]
根据本文所述的方法使细胞生长可以在生物反应器中完成，所述生物反应器允许大规模生产能够被本发明的疱疹载体感染的完全生物活性细胞。生物反应器已广泛用于从悬浮和锚定依赖性动物细胞培养物两者生产生物产物。大多数大规模悬浮培养都作为分批或补料分批工艺进行操作，因为它们最容易操作且按比例扩大。然而，基于恒化器或灌注原理的连续工艺是可用的。生物反应器系统可以设置为包括允许培养基更换的系统。例如，可以将过滤器掺入生物反应器系统内，以允许细胞与消耗的培养基分开，以促进培养基更换。根据用于生产疱疹病毒的本文方法的一些实施方案，在细胞生长的某一天时开始进行培养基更换和灌注。例如，培养基更换和灌注可以在细胞生长的第3天时开始。过滤器可以在生物反应器的外部，或在生物反应器的内部。
[0198]
用于产生重组aav病毒颗粒的方法可以包括：用第一重组疱疹病毒和第二重组疱疹病毒共感染悬浮细胞，所述第一重组疱疹病毒包含编码aav rep和aav cap基因的核酸，所述基因各自可操作地连接到启动子，所述第二重组疱疹病毒包含pgrn基因构建体以及与
所述目的基因可操作地连接的启动子；并且允许细胞产生重组aav病毒颗粒，从而产生重组aav病毒颗粒。细胞可以是hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。根据一些实施方案，cap基因可以选自具有选自以下的血清型的aav：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav2.retro及其变体或杂合体(例如，具有hspg突变的aav2变体、(aav2-hbko、aavt-tt、aav44.9)、aav 1 9杂合体)。根据一些实施方案，特定衣壳序列赋予增强的神经和脑转导。根据一些实施方案，aav是aav9。根据一些实施方案，aav是aavrh10。细胞可以以3至14的组合感染复数(moi)进行感染。第一疱疹病毒和第二疱疹病毒可以是选自以下的病毒：巨细胞病毒(cmv)、单纯疱疹病毒(hsv)和水痘带状疱疹(vzv)和eb病毒(ebv)。疱疹病毒可能是复制缺陷型的。共感染可能是同时的。
[0199]
根据一些实施方案，重组aav病毒颗粒进一步包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。
[0200]
用于在哺乳动物细胞中产生重组aav病毒颗粒的方法可以包括用第一重组疱疹病毒和第二重组疱疹病毒共感染悬浮细胞，所述第一重组疱疹病毒包含编码aav rep和aav cap基因的核酸，所述基因各自可操作地连接到启动子，所述第二重组疱疹病毒包含pgrn基因构建体以及与所述pgrn基因构建体可操作地连接的启动子；并且允许细胞繁殖，从而产生重组aav病毒颗粒，由此所产生的病毒颗粒数目等于或大于在贴壁条件下在相同数目的细胞中生长的病毒颗粒数目。细胞可以是hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。cap基因可以选自具有选自以下的血清型的aav：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav2.retro及其变体或杂合体(例如，具有hspg突变的aav2变体、(aav2-hbko、aavt-tt、aav44.9)、aav 1 9杂合体)。根据一些实施方案，aav是aavrh10。根据一些实施方案，aav是aav9。根据一些实施方案，特定衣壳序列赋予增强的神经和脑转导。细胞可以以3至14的组合感染复数(moi)进行感染。第一疱疹病毒和第二疱疹病毒可以是选自以下的病毒：巨细胞病毒(cmv)、单纯疱疹病毒(hsv)和水痘带状疱疹(vzv)和eb病毒(ebv)。疱疹病毒可能是复制缺陷型的。共感染可能是同时的。
[0201]
一种用于将编码治疗性蛋白质的核酸序列递送至悬浮细胞的方法，该方法包括：用第一重组疱疹病毒和第二疱疹病毒共感染bhk细胞，所述第一重组疱疹病毒包含编码aav rep和aav cap基因的核酸，所述基因各自可操作地连接到启动子，所述第二疱疹病毒包含pgrn基因构建体以及与所述pgrn基因可操作地连接的启动子，其中所述目的基因包含治疗性蛋白质编码序列；并且其中所述细胞以3至14的组合感染复数(moi)进行感染；并且允许病毒感染细胞并表达治疗性蛋白质，从而将编码治疗性蛋白质的核酸序列递送至细胞。细胞可以是hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。参见例如，美国专利号9,783,826。
[0202]
v. 治疗方法aav和基因治疗基因治疗指通过替换、改变或补充负责疾病的基因来治疗遗传性或获得性疾病。它一般借助于媒介物或载体，通过将一种或多种校正基因引入宿主细胞内来实现。使用raav的基因治疗对于许多疾病的治疗具有很大的希望。本文描述了产生重组腺伴随病毒
(raav)，且特别是产生大量重组aav以支持神经退行性疾病的治疗的方法。
[0203]
迄今为止，全世界已进行了多于500项基因治疗临床试验。使用raav作为基因治疗的媒介物的努力对于其作为用于人疾病的治疗的适用性提供了希望。使用重组aav (raav)用于所引入的基因在动物中的细胞内的递送和长期表达，已经在临床前取得了一些成功，所述细胞包括临床上重要的脑、肝、骨骼肌和肺的非分裂细胞。在一些组织中，aav载体已显示整合到靶细胞的基因组内。hirata等人，2000，j. of virology 74:4612-4620。
[0204]
raav的另外优点在于其在非分裂细胞类型包括肝细胞、神经元和骨骼肌细胞中执行这一功能的能力。raav已成功地用作基因治疗媒介物，以致使促红细胞生成素在小鼠的骨骼肌中的表达(kessler等人，1996)、酪氨酸羟化酶和芳香族氨基酸脱羧酶在帕金森病的猴模型中的cns中的表达(kaplitt等人，1994)、以及因子ix在血友病的动物模型中的骨骼肌和肝中的表达。在临床水平上，raav载体已用于人临床试验中，以将cftr基因递送至囊性纤维化患者，并且将因子ix基因递送至血友病患者(flotte等人，1998；wagner等人，1998)。进一步地，aav是辅助依赖性dna细小病毒，其与人或哺乳动物中的疾病无关(berns和bohensky，1987，advances in virus research，academic press inc，32:243-307)。相应地，aav载体最重要的属性之一是其在i期临床试验中的安全性概况。
[0205]
aav基因治疗已在许多不同的病理背景下进行并治疗各种疾病和病症。例如，在一项i期研究中，aav2-fix载体施用到8个b型血友病受试者的骨骼肌内证明是安全的，并且实现了在载体注射后至少10个月的局部基因转移和因子ix表达(jiang等人，mol ther. 14 (3):452-5 2006)，先前已描述了向aat缺陷成人肌内注射重组腺伴随病毒α1-抗胰蛋白酶(raav2-cb-haat)基因载体的i期试验(flotte等人，hum gene ther. 2004 15(1):93-128)，并且在另一项临床试验中，丘脑底核的aa v-gad基因治疗已显示是安全的，并且由晚期帕金森氏病患者良好耐受(kaplitt等人lancet. 200723；369(9579):2097-105)。
[0206]
颗粒蛋白前体和神经退行性疾病本文提供了可以用于治疗受试者中的神经退行性疾病的方法。根据一些实施方案，神经退行性疾病由受试者中的可遗传突变介导。根据一些实施方案，神经退行性疾病由对受试者的环境危害介导。如本文使用的，由对患者的环境危害介导的神经退行性疾病意指这样的疾病，其由环境危害引起，而不是由修饰颗粒蛋白前体表达的颗粒蛋白前体基因的可遗传突变引起。可遗传突变是患者的dna中的永久性突变，其可能传递给患者的后代。本文所述的一种或多种核酸递送至cns细胞，且特别是神经元细胞，可以用于治疗神经退行性疾病。
[0207]
根据一些实施方案，本文提供了采用基于pgrn aav的基因疗法用于治疗颗粒蛋白前体相关的神经退行性疾病的方法，所述神经退行性疾病包括但不限于家族性额颞叶痴呆(ftd)、额颞叶变性(ftld)、神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl)包括神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)和巴藤病、以及阿尔茨海默氏病(ad)。根据一些实施方案，本文提供了采用基于pgrn aav的基因疗法用于预防颗粒蛋白前体相关的神经退行性病症的方法，所述神经退行性病症包括但不限于家族性额颞叶痴呆(ftd)、额颞叶变性(ftld)、神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl)包括神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)和巴藤病、以及阿尔茨海默氏病(ad)。
[0208]
本文所述的方法允许在哺乳动物细胞中产生重组aav病毒颗粒，其包括用第一重组疱疹病毒和第二重组疱疹病毒共感染能够悬浮生长的哺乳动物细胞，所述重组疱疹病毒
包含在颗粒蛋白前体相关的神经退行性病症的治疗中具有治疗价值的颗粒蛋白前体基因构建体，所述神经退行性病症包括但不限于家族性额颞叶痴呆(ftd)和神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)。
[0209]
本文所述的基因治疗构建体可以用于治疗和/或预防颗粒蛋白前体相关的神经退行性病症的方法和组合物中。颗粒蛋白前体相关的神经退行性病症包括但不限于家族性额颞叶痴呆(ftd)的20%发病率和神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)的所有病例。神经退行性病症包括但不限于家族性额颞叶痴呆(ftd)、额颞叶变性(ftld)、神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl)包括神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)和巴藤病、以及阿尔茨海默氏病(ad)。
[0210]
颗粒蛋白前体，分泌性糖蛋白，在人中由单个grn基因编码。颗粒蛋白前体(pgrn)占优势地由脑中的小胶质细胞表达。颗粒蛋白前体(pgrn)是分泌的593个氨基酸的多功能蛋白，其是高度保守的且在范围从真核生物到人的广泛范围的物种中发现。pgrn广泛分布于cns各处，在所述cns中，它主要在神经元和小胶质细胞中发现，但也已在星形胶质细胞和少突胶质细胞中以低得多的水平检测到。颗粒蛋白前体由12个半胱氨酸颗粒蛋白基序的七个半串联重复的不相同拷贝组成。许多细胞过程和疾病与这种独特的多效性因子有关，其包括但不限于胚胎发生、肿瘤发生、炎症、伤口修复、神经变性和溶酶体功能。由grn基因内的常染色体显性突变引起的单倍体不足导致额颞叶变性，在患者中呈现为额颞叶痴呆的进行性神经元萎缩。额颞叶痴呆是与阿尔茨海默氏病不同的早发形式的痴呆。grn有关形式的额颞叶痴呆是特征在于含有泛素化和碎片化tdp-43 (由tardbp编码)的神经元包涵体的出现的蛋白病。chitramuthu等人brain 2017 140(12): 3081-3104；su
á
rez-calvet等人embo molecular medicine 2018 e9712。
[0211]
本文所述的颗粒蛋白前体(pgrn) aav构建体提供了用于治疗pgrn相关的神经退行性病症的基因治疗媒介物，所述神经退行性病症包括家族性额颞叶痴呆(ftd)的所有发病率中的20%和神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)的所有病例。本文所述的pgrn aav基因治疗构建体和使用方法提供了用于pgrn相关的神经退行性病症的疗法，长期未满足的需要，因为不存在可用于患有pgrn相关的神经退行性病症的患者的基于基因疗法的治疗。
[0212]
根据一些实施方案，pgrn aav基因疗法在受试者已发展神经退行性疾病前进行施用。根据一些实施方案，受试者通过鉴定pgrn突变的分子遗传学测试被诊断有神经退行性疾病。根据一些实施方案，受试者具有患有神经退行性疾病的家庭成员。
[0213]
本文所述的raav构建体以比常规aav载体更高的效率转导cns细胞，且特别是神经元细胞。根据一些实施方案，本文所述的组合物和方法致使核酸高度有效递送至cns细胞，且特别是神经元细胞。根据一些实施方案，本文所述的组合物和方法致使转基因在至少50% (例如，至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)的内毛细胞中的递送和表达，或者在至少50% (例如，至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99)的神经元细胞中的递送和表达。根据一些实施方案，本文所述的组合物和方法致使转基因在至少70% (例如，至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)的内毛细胞中的递送和表达，或者在至少70% (例如，至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99)的神经元细胞中的递送和表达。根据一些实施方案，本文所述的组合物和方法致使转基因在至少80% (例如，至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)的内毛细胞中的递送和表达，或者在至少80% (例如，至少80、85、90、91、92、93、94、95、
96、97、98或99)的神经元细胞中的递送和表达。
[0214]
根据一些实施方案，在所得到的重组细胞的体内施用之前，将本文所述的核酸序列直接引入细胞内，核酸序列在所述细胞中表达以产生编码的产物。这可以通过本领域已知的众多方法中的任一种，例如通过此类方法如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染来实现。
[0215]
vi.药物组合物根据一些方面，本公开内容提供了药物组合物，其包含任选地在药学上可接受的赋形剂中的本文所述的任何载体。
[0216]
如本领域众所周知的，药学上可接受的赋形剂是相对惰性的物质，其促进药理学有效物质的施用，并且可以作为液体溶液或悬浮液、作为乳状液、或者作为适合于在使用之前溶解或悬浮于液体中的固体形式供应。例如，赋形剂可以给予形式或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透压的盐、封装剂、ph缓冲物质和缓冲剂。此类赋形剂包括适合于直接递送至耳(例如内耳或中耳)的任何药物试剂，其可以进行施用而无过度毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇，各种tween化合物中的任一种，以及液体例如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐可以包括在其中，例如矿物酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸的盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。药学上可接受的赋形剂的详尽讨论在remington's pharmaceutical sciences (mack pub. co.，n.j. 1991)中可获得。
[0217]
根据一些实施方案，特别是当存在高raav浓度时，raav组合物配制为减少组合物中的aav颗粒聚集。用于减少raav聚集的方法是本领域众所周知的，并且包括例如添加表面活性剂、ph调整、盐浓度调整等。(参见例如，wright fr等人，molecular therapy (2005) 12，171-178，其内容通过引用并入本文。)根据一些实施方案，药物组合物包含bsst、pbs或bss中的一种或多种。
[0218]
根据一些实施方案，药物组合物进一步包含组氨酸缓冲液。
[0219]
尽管不是必需的，但组合物可以任选地以适合于施用精确量的单位剂型供应。
[0220]
vii. 施用方法一般地，本文所述的组合物配制用于施用于cns。根据一些实施方案，组合物配制用于施用于神经元细胞。
[0221]
根据一些实施方案，施用是大脑内的(例如，至大池(icm))、鞘内的(it) (伴随或不伴随导管)、静脉内的(iv)、或iv和it的组合。
[0222]
如本文使用的，术语“鞘内施用”指将药剂例如包含raav的组合物施用到椎管内。例如，鞘内施用可以包括在椎管的颈部区域、椎管的胸部区域、或椎管的腰部区域中的注射。通常，鞘内施用通过将药剂例如包含raav的组合物注射到椎管的蛛网膜下腔(蛛网膜下隙)内来执行，所述蛛网膜下腔是蛛网膜和椎管的软脑膜之间的区域。蛛网膜下腔由海绵组织占据，所述海绵组织由小梁(从蛛网膜延伸并共混到软脑膜内的精细结缔组织细丝)和其中含有脑脊液的相互连通的通道组成。根据一些实施方案，鞘内施用并非施用到脊柱脉管系统内。
[0223]
如本文使用的，术语“大脑内施用”指将药剂施用到脑内和/或脑周围。大脑内施用包括但不限于将药剂施用到大脑、髓质、脑桥、小脑、颅内腔和脑周围的脑膜内。大脑内施用
可以包括施用到脑的硬脑膜、蛛网膜和软脑膜内。在一些实施方案中，大脑内施用可以包括将药剂施用到小脑延髓(cm)池内。在一些实施方案中，大脑内施用可以包括将药剂施用到围绕脑的蛛网膜下隙的脑脊液(csf)内。在一些实施方案中，大脑内施用可以包括将药剂施用到脑室，例如右侧脑室、左侧脑室、第三脑室、第四脑室内。根据一些实施方案，大脑内施用并非施用到脑脉管系统内。
[0224]
大脑内施用可以涉及直接注射到脑内和/或脑周围。根据一些实施方案，大脑内施用涉及使用立体定向程序的注射。立体定向程序是本领域众所周知的，并且通常涉及使用计算机和3维扫描装置，其一起用于将注射引导至特定的大脑内区域，例如室区域。也可以使用微型注射泵(例如，来自world precision instruments)。根据一些实施方案，显微注射泵用于递送包含raav的组合物。
[0225]
根据一些实施方案，组合物的输注速率为1 ml/分钟或更慢。根据一些实施方案，组合物的输注速率为约10μl/分钟至1000 μl/分钟。如技术人员将了解的，输注速率将取决于各种因素，包括例如受试者的物种、受试者的年龄、受试者的重量/大小、aav的血清型、所需的剂量、靶向的大脑内区域等。因此，其它输注速率在某些情况下可以由技术人员视为适当的。
[0226]
根据一些实施方案，包含如本文所述的raav的组合物使用渗透泵或输液泵进行施用。渗透泵和输液泵两者均从各种供应商商购可得，所述供应商例如alzet corporation，hamilton corporation，alza，inc.，palo alto，calif.)。
[0227]
通过如本文所述安全且有效地转导cns细胞，本发明的方法可以用于治疗个体，例如人，其中所述转导的细胞产生足以治疗或预防神经退行性疾病的量的pgrn。
[0228]
根据本发明的治疗方法，可以基于接受治疗的受试者的特性，例如受试者的年龄和载体将递送至其的区域的体积，来确定所递送的载体的体积。根据一些实施方案，注射的组合物的体积为约10
ꢀµ
l至约1000
ꢀµ
l、或约100
ꢀµ
l至约1000
ꢀµ
l、或约100
ꢀµ
l至约500
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l、或约500
ꢀµ
l至约1000
ꢀµ
l。根据一些实施方案，注射的组合物的体积多于约1
ꢀµ
l、2
ꢀµ
l、3
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l、4
ꢀµ
l、5
ꢀµ
l、6
ꢀµ
l、7
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l、8
ꢀµ
l、9
ꢀµ
l、10
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l、15
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l、20
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l、25
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l、50
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l、75
ꢀµ
l、100
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l、200
ꢀµ
l、300
ꢀµ
l、400
ꢀµ
l、500
ꢀµ
l、600
ꢀµ
l、700
ꢀµ
l、800
ꢀµ
l、900
ꢀµ
l或1 ml中的任何一个或两者之间的任何量。
[0229]
根据本公开内容的治疗方法，所施用的载体的浓度可以取决于生产方法而不同，并且可以基于确定为对于特定施用途径治疗上有效的浓度进行选择或优化。根据一些实施方案，以载体基因组/毫升(vg/ml)的浓度选自约10
8 vg/ml、约10
9 vg/ml、约10
10 vg/ml、约10
11 vg/ml、约10
12 vg/ml、约10
13 vg/ml和约10
14 vg/ml。在优选的实施方案中，浓度在约0.1 ml、约0.2 ml、约0.4 ml、约0.6 ml、约0.8 ml和约1.0 ml的体积中，在10
11 vg/ml
ꢀ‑ꢀ
10
14 vg/ml的范围内。
[0230]
本文所述的组合物的有效性可以通过几个标准来监测。
[0231]
根据一些实施方案，组合物的有效性通过监测用pgrn raav治疗的受试者中的改善来确定。根据一些实施方案，本文所述的组合物的有效性可以在体内小鼠模型中进行监测。例如，在pgrn-/-ko小鼠模型中，血液、csf和脑组织中的pgrn蛋白水平增加；血液和csf中的神经丝-1 (nfl-1)水平降低；来自脑组织的脂褐质和细胞内tdp43水平降低可以是组合物的有效性的指标。根据一些实施方案，本文所述的组合物的有效性可以在人疾病受试
者中进行监测。例如，血液和csf中的pgrn蛋白水平增加、血液和csf中的nfl-1水平降低、以及行为和认知改善可以用作组合物的有效性的指标。
[0232]
现在将参考下述实施例描述本发明的进一步实施方案。提供本文包含的实施例用于说明而决不是限制。
实施例
[0233]
实施例1. 方法本发明使用(但不限于)下述方法执行。如本文所述的方法在于2007年8月8日提交的名称为recombinant aav production in mammalian cells的pct申请号pct/us2007/017645中进行阐述，所述pct申请要求于2007年8月14日提交的名称为recombinant aav production in mammalian cells的美国申请号11/503,775的利益，所述美国申请是于2002年9月23日提交的名称为high titer recombinant aav production的美国申请序列号10/252,182，于2006年8月15日颁发的目前的美国专利号7,091,029的部分继续申请。所有上述申请的内容在此通过引用以其整体并入。
[0234]
rhsv共感染方法用于重组腺伴随病毒(raav)生产的rhsv共感染方法采用两种icp27缺陷型重组单纯疱疹病毒1型(rhsv-1)载体，一种携带aav rep和cap基因(rhsv-rep2capx，其中“capx
””
指任何aav血清型)，而第二种携带侧翼为aav反向末端重复(itr)的目的基因(goi)盒。尽管该系统用aav血清型2 rep、cap和itr以及人源化的绿色荧光蛋白基因(gfp)作为转基因进行开发，但该系统可以用于不同的转基因和血清型/假型元件。
[0235]
哺乳动物细胞用rhsv载体进行感染，所述rhsv载体提供所有顺式和反式作用的raav组分、以及用于生产性raav感染的必要辅助功能。细胞用rhsv-rep2capx和rhsv-goi的混合物进行感染。将细胞收获并裂解以释放raav-goi，并且通过下述各种方法来滴定所得到的载体原液。
[0236]
doc裂解在收获时，细胞和培养基通过离心进行分离。将培养基放在一边，同时使用2至3个冻融循环，用含有0.5% (w/v)脱氧胆酸盐(doc)的裂解缓冲液(20 mm tris-hcl，ph 8.0，150 mm nacl)提取细胞团块，所述裂解缓冲液提取细胞相关的raav。在一些情况下，培养基和细胞相关的raav裂解物是重组的。
[0237]
原位裂解用于收获raav的替代方法是原位裂解。在收获时，将mgcl2加入至1 mm的最终浓度，将10% (v/v) triton x-100加入至1% (v/v)的最终浓度，并且将benzonase加入至50单位/ml的最终浓度。将该混合物在37
°
c振荡或搅拌2小时。
[0238]
确定drp产率的定量实时pcrdna酶抗性颗粒(drp)测定采用序列特异性寡核苷酸引物和双重标记的杂交探针，使用实时定量聚合酶链反应(qpcr)技术用于检测和定量扩增的dna序列。靶序列在荧光探针的存在下进行扩增，所述荧光探针与dna杂交并发出依赖于拷贝的荧光。drp滴度(drp/ml)通过直接比较测试物品的相对荧光单位(rfu)与由携带相同dna序列的已知质粒稀释物生成的荧光信号进行计算。由该测定生成的数据反映了包装的病毒dna序列的数量，而不指
示序列完整性或颗粒感染性。
[0239]
确定感染性颗粒产率的绿色细胞感染性测定(仅raa v-gfp)使用绿色细胞测定对raa v-gfp的原液执行感染性颗粒(ip)滴定。c12细胞(表达aav2 rep和cap基因的hela衍生系
ꢀ–ꢀ
参见下文参考文献)用连续稀释的raa v-gfp加上饱和浓度的腺病毒(以提供用于aav复制的辅助功能)进行感染。在两到三天温育后，计数发荧光的绿色细胞(每个细胞代表一个感染事件)数目，并且用于计算病毒样品的ip/ml滴度。
[0240]
clark kr等人在hum. gene ther. 1995. 6:1329-1341和gene ther. 1996. 3:1124-1132中描述了重组腺病毒生产，所述两个参考文献均通过引用以其整体并入本文。
[0241]
确定raa v感染性的tcid
50
使用以50%组织培养感染剂量(tcid
50
)的测定来确定包含目的基因的raav颗粒(raav-goi)的感染性。8个raav重复在人腺病毒5型的存在下进行连续稀释，并且用于感染96孔板中的helarc32细胞(表达aav2 rep和cap的hela衍生细胞系，购自atcc)。在感染后三天，将裂解缓冲液(最终浓度为1 mm tris-hc1 ph 8.0、1 mm edta、0.25% (w/v)脱氧胆酸盐、0.45% (v/v) tween-20、0.1% (w/v)十二烷基硫酸钠、0.3 mg/ml蛋白酶k)加入每个孔中，然后在37
°
c下温育1小时，在55
°
c下温育2小时，且在95
°
c下温育30分钟。在上述drp qpcr测定中测定来自每个孔的裂解物(2.5 μl等分试样)。ct值低于标准曲线的最低数量质粒的值的孔评分为阳性。tcid
50
感染性/ml (tcid
50
/ml)基于karber方程使用以10倍连续稀释的阳性孔的比率进行计算。
[0242]
细胞系和病毒使用合适的生产细胞系例如hek293细胞(293)，在体外进行用于基因疗法的raav载体的生产。适用于本发明的其它细胞系包括vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。
[0243]
除非另有说明，否则将哺乳动物细胞系维持在含有2
ꢀ‑ꢀ
10% (v/v)胎牛血清(fbs，hyclone)的达尔贝科改良伊格尔培养基(dmem，hyclone)中。细胞培养和病毒繁殖在37
°
c、5% co2下执行指示的间隔。
[0244]
感染细胞密度细胞可以生长到各种浓度，包括但不限于至少约、至多约或约1 x 106至4 x 106个细胞/ml。然后可以以预定的moi用重组疱疹病毒感染细胞。
[0245]
实施例2. pgrn表达构建体的克隆用于神经退行性病症的成功aav-颗粒蛋白前体疗法关键地依赖于载体组分。优化载体将提供有效靶向脑的有效衣壳，适度但细胞特异性的启动子和表达人颗粒蛋白前体蛋白的稳定转基因。
[0246]
所有构建体都是下述的变体迭代：ptr*-cba*/hsyn1*-h/m(wt/co1,2,3,4,5,6,7)(ss*)pgrn(无/ha/sbi)-wpre-(sv/hgh)pa*(潜在地)优化和/或序列调节的元件图1显示了pgrn构建体的示意图，其包含在每个端部处的反向末端重复(itr)、人突触素1 (hsyn1)或鸡β肌动蛋白(cba)启动子、任选地包含c末端ha标签或c末端中的3-16个核酸的缺失的pgrn、土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件(wpre)、sv40早期多聚腺苷酸
4aav2反向末端重复(itr)3’至5’5野生型人颗粒蛋白前体(hpgrnwt)6野生型小鼠颗粒蛋白前体(mpgrnwt)7猕猴(恒河猴)颗粒蛋白前体8hpgrncoa9hpgrncob10hpgrncoc11hpgrncod12hpgrncoe13hpgrncof14hpgrn分拣蛋白结合缺陷型变体15血凝素(ha)标签16wpre17sv40pa18钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkii)启动子19大鼠微管蛋白α1(ta1)启动子20大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子21人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子pdgfb_122ef1α启动子23cag/cmv增强子24人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子pdgfb_225人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子pdgfb_3启动子载体设计和合成：完成了关于强遍在启动子(cba)相对于神经元特异性启动子(人突触素)的体外比较的研究，以比较其特异性和获得的转基因表达水平。cba启动子在paav质粒(ptr-cba-pgrnwt-wpre-pa)中获得。使用nebuilder
®ꢀ
hifi dna assembly试剂盒(new england biolabs)，将pgrnwt的序列替换为含有hgfp和多克隆位点的序列，以生成质粒ptr-cba-hgfp-wpre-pa。人突触素启动子序列是商业合成的(genscript)，随后为内部pcr扩增和提取，导致具有相容的限制位点区段的启动子区段，用于插入独特的病毒包装载体内，所述病毒包装载体含有氨苄青霉素选择盒、aav itr区段、hgfp报道基因、wpre和sv40多聚a (ptr-hsyn-hgfp-wpre-pa)。
[0264]
将构建体转化到高效率大肠杆菌细胞(sure2)内用于扩增，并且选择克隆用于验证。执行桑格测序(genewiz)和限制性消化(具有适当的限制位点(smai和xmai)以检查启动子插入和itr完整性)，以验证启动子质粒。选择关于每种构建体的阳性克隆用于后续实验。经由hek-293 (对照)或shsy-5y细胞的体外转染，测试了独特的启动子构建体在驱动hgfp表达方面的功效。体外数据指示了，cba和人突触素启动子在两种测试细胞中均起作用，其中cba在两种细胞中总是强于突触素启动子。
[0265]
衣壳选择多种免疫组织学分析指示了aav9和aavrh10均具有有利于治疗的广泛的神经元嗜
性。基于比较中枢神经系统中的aav9和aavrh10表达和功效的研究，选择aavrh10而不是aav9。发现aavrh10比aav9显著更好地转导。另外，aav9和rh10在人群体中具有相似的低中和ab血清阳性率(分别为18%和21%，thwaite r等人，2014)。
[0266]
一组实验通过鞘内给药检查了非人灵长类动物(nhp)中的衣壳选择。对于脊髓和脑中的gfp表达，测试了包含aavrh10、aav9、δhsmax和aav2tyf衣壳的gfp构建体。图25概括了在鞘内注射后，关于在脑的各个区域中的gfp阳性细胞百分比和gfp强度，关于测试的衣壳各自的结果。根据这项研究，aavrh10显示了最多的gfp表达，随后为aav9。所有载体都是良好耐受的。
[0267]
接下来，通过给药到大池(icm)内来进行nhp中的aavrh10生物分布。发现1.2e13 vg的aavrh10在icm给药之后显示了从额叶到背侧nhp脑的极佳生物分布。评分显示于图26中。
[0268]
实施例3. 启动子选择进行实验以测试用于颗粒蛋白前体载体中的启动子。采用的启动子是：hsyn启动子(也称为synp1，神经元特异性的)和嵌合cmv-鸡
ß‑
肌动蛋白启动子(cba)启动子(遍在的)。在体外执行了第一组实验。如图27中所示，cba启动子在人胚肾293细胞(hek293)和sh-sy5y细胞两者中均驱动比synp1更强的表达(使用2种不同的转染试剂确认)。sh-sy5y是衍生自sk-n-sh神经母细胞瘤细胞系的细胞系，其频繁用作神经退行性病症的模型。图28显示了伴随和不伴随ad5载体，在hek293和shsy-5y细胞中的raavrh10-cba-hgfp转导后的gfp表达。如图28中所示，在伴随和不伴随ad5，用aavrh10-cba构建体转导的sh-sy5y细胞中，没有检测到gfp。图27中所示的结果证实了hek和sh-sy5y细胞两者均可以用于展示由cba或hsyn启动子驱动的wpre增强的表达。然而，在这两种细胞类型中，hsyn驱动的表达水平远低于cba驱动的表达。图28中所示的结果证实了aav血清型(aav2tyf或aavrh10)可以用于展示载体在hek细胞中的转导(并通过ad5进一步增强)，但仅aav2tyf可以用于展示sh-sy5y细胞中的转导(与ad5添加无关)。
[0269]
这些结果指示了，对于aavrh10载体在细胞测定中的后续测试，可以使用hek293细胞，或者如果将使用神经元/神经元样细胞模型，则可能需要使用除sh-sy5y外的细胞类型，或可能需要进一步优化sh-sy5y细胞中的条件。
[0270]
总之，来自启动子选择工作的结果导致synp1启动子的选择，因为它的细胞特异性是限制过表达和因此可能的毒性所期望的。此外，显示了synp1启动子仅增加csf中的pgrn，但不增加血浆中的pgrn，这是本发明的构建体的进一步期望特性。
[0271]
实施例4. 密码子优化的颗粒蛋白前体载体设计和合成颗粒蛋白前体转基因优化由增强蛋白质表达、稳定性和功能的努力组成。合成密码子优化的颗粒蛋白前体(pgrn)变体，并且评价相对于野生型的蛋白质表达变化。生成了六种密码子优化的变体，具有或不具有27 bp c末端ha标签。加上ha标签的变体对于蛋白质表达提供了替代测量，用于区别内源性pgrn蛋白的手段，并且还允许评价抑制pgrn-分拣蛋白结合的任何治疗益处。
[0272]
每种密码子优化的变体含有独特的优化(即密码子使用、gc含量、5
’ꢀ
mrna结构的稳定性、rna不稳定序列的去除等)，其导致在其dna序列方面不同但保存其氨基酸序列的变体。这些变体由三种不同的优化算法之一(或其组合)生成。
[0273]
执行pcr扩增和提取，导致具有相容性限制位点(noti、nhei)的pgrn转基因区段，用于插入含有氨苄青霉素选择盒和aav itr区段的独特的病毒包装载体内。在完全合成之后，将密码子优化的构建体转化到高效率大肠杆菌细胞(sure2)内用于扩增，并且选择克隆用于验证。执行桑格测序(genewiz)和限制性消化(具有适当的限制位点以检查转基因插入和itr完整性)，以验证密码子优化的pgrn和pgrnwt质粒。选择关于每种密码子优化的构建体的阳性克隆用于后续实验。
[0274]
为了确定与pgrnwt相比，6种密码子优化的变体(指定为coa-f (例如pgrncoa、pgrncob、pgrncoc、pgrncod、pgrncoe、pgrncof))如何表达pgrn，执行转基因表达实验，并且经由上清液和细胞裂解物elisa分析和蛋白质印迹进行分析。elisa和蛋白质结果两者均显示了，当用human progranulin quantikine elisa kit (r&d systems)测定时，并且当用抗人颗粒蛋白前体抗体(sigma)和抗ha单克隆抗体(thermofisher)探测时，coe和cof变体具有与wt可比较的蛋白质表达，而所有其它co变体展示较差的表达(图29和图30)。因此，选择co-e和cof作为用于所选转基因的良好候选物。coe和cof两者均在sds-page上以~80 kd的预计分子量迁移(即与pgrnwt相同)，如图30中所示。
[0275]
接下来，将处于hsyn启动子的控制下的密码子优化的变体coe (pgrncoe)和cof (pgrncof)转染到hek293细胞内，并且经由上清液elisa分析所分泌的转基因表达(图31)。如图31中所示，在hek293细胞中，coe显示了与wt可比较的分泌性颗粒蛋白前体表达(ng/ml)，以及比cof更高的分泌性颗粒蛋白前体表达(ng/ml)。还在第5天(d5)测量了表达，其中可见关于变体coe的轻微降低以及关于变体cof的更大降低。蛋白质印迹结果(图32)确认了这一结果。
[0276]
在sh-sy5y细胞中执行了类似的实验。结果显示于图33中。将处于hsyn启动子的控制下的密码子优化的变体coe (pgrncoe)和cof (pgrncof)转染到sh-sy5y细胞内，并且经由上清液elisa分析所分泌的转基因表达。如图33中所示，在hek293细胞中，coe显示了与wt可比较的分泌性颗粒蛋白前体表达(ng/ml)，以及比cof更高的分泌性颗粒蛋白前体表达(ng/ml)。还在第5天(d5)测量了表达，其中可见关于变体coe在分泌性颗粒蛋白前体表达方面的轻微降低，同时可见关于变体cof的增加。
[0277]
除增强表达和针对优化的稳定性之外，避免pgrn降解为颗粒蛋白和/或pgrn被细胞摄取具有增加pgrn可用性的极大潜力。方法之一是靶向pgrn与其主要受体分拣蛋白的结合。因此，通过缺失对于分拣蛋白结合关键的5个氨基酸，生成了所选候选物的vc末端修饰的pgrn。
[0278]
执行实验以观察是否可以通过避免与作为主要受体的分拣蛋白结合来增强pgrn表达。
[0279]
实施例5. raav-x载体的生产产生了raav-x载体，其中“x”是下述血清型/变体之一：aav-rh10、含有最高选择的基因组变体的aav-9。这些载体的研究级制备将通过各种方法进行。(1)在第一种方法中，通过hek293细胞的质粒转染来包装载体，并且根据建立的方法(这种方法的参考可以在zolotukhin等人，2002 methods中找到)，通过碘克沙醇密度梯度来纯化病毒。(2)在第二种方法中，使用agtc的有专利权的重组hsv互补在悬浮培养的幼仓鼠肾(sbhk)细胞中产生载体(kang等人，gene ther 2009；thomas等人，hum gene ther 2009)。三重转染方法用于制
备用于所有临床前工作的载体。三重转染也将用于制备用于glp毒性研究的载体。载体生产使用have (hsv相关)方法进行优化，并且预计该方法用于后期工作中的生产，例如用于临床试验材料的制备。进行研究以证实通过两种方法制备的载体的可比性。
[0280]
根据一些实施方案，包含raavr10-syn-pgrnwt的载体构建体通过三重转染进行制备，所述三重转染包含具有itr-syn-pgrnwt-wpre-pa-itr盒插入的基于puc的“ptr”质粒。itr-syn-pgrnwt-wpre-pa-itr盒(图1)的核酸序列可以衍生自图4或图5a和5b (itr序列)或5ab (对于两个itr)，图3 (hsyn)，图6 (hpgrnwt)，图17 (对于wpre)和图18 (对于sv40pa)中提供的各种序列。
[0281]
实施例6. 体内研究：非人灵长类动物中的颗粒蛋白前体表达进行研究，以评估在食蟹猴中的基因疗法(使用raavr10-syn-pgrnwt)的单次脑池内注射之后的全身基因表达。为了实现这一目标，将两只雄性食蟹猴转移到研究中，所述食蟹猴之一先前植入了鞘内腰椎导管用于csf样品收集(动物002a)。根据下述研究设计，通过大池穿刺向动物施用单一剂量的1.5 ml的测试物品。
[0282]
剂量施用：使两只动物镇静用于经由鞘内大池(cm)穿刺的剂量施用。向每只动物提供盐酸右美托咪定im (0.04 mg/kg)。至少10分钟后，提供盐酸氯胺酮(2.5 mg/kg)的im注射以诱导镇静。一旦镇静，动物就被插管，并且大池区域对于脊髓穿刺作准备。根据nbr sop，将动物置于侧卧位。在将脊髓针引入大池前，使用20号针在皮肤中制备微小切口。利用gertie marx
®ꢀ
22号针执行脊髓穿刺。通过来自针的csf流动确认了对cm的接近。一旦在脊髓针的中心观察到csf，就通过手动推注在大约1-2分钟内施用1.5 ml剂量。在取出针后，对注射部位施加直接压力，随后为局部无菌软膏的施加。在剂量施用之后，在麻醉逆转之前，将动物置于特伦德伦伯卧位10分钟。以0.2 mg/kg im的剂量提供逆转剂盐酸阿替美唑，记录时间并将动物送回其笼子。
[0283]
生命中的观察和测量包括临床观察、体重和临床病理学评估，如本报告的其它地方中所述。收集血液和csf用于分析。在第57天时的样品收集后，将两只动物送回nbr灵长类动物群落。
[0284]
在研究过程中，不存在异常临床体征或测试物品有关的体重变化。
[0285]
与研究前相比，在评估的时间间隔(第57天)，不存在血液学或血清化学参数中有意义的变化。
[0286]
在用测试物品给药之后，抗aav中和抗体的滴度在所有测试样品中都是增加的。结果显示于图34中。在8周或10周的过程中，确定了脑脊液(csf)和血浆中的颗粒蛋白前体表达的倍数变化。如图34中所示，在时间过程中，颗粒蛋白前体表达在csf中增加，但在血浆中没有增加。与动物002a相比，动物001a发展更快/更高的应答，尤其是在csf中。添加第10周时间点，以确认csf颗粒蛋白前体水平的下降。
[0287]
尽管本发明已通过说明和实例的方式略微详细地进行描述，用于清楚理解的目的，但应当理解，可以在所附权利要求的范围内实践某些变化和修改。对于基因疗法、分子生物学和/或相关领域的技术人员而言，鉴于前述公开内容将理解或者用本发明的常规实践或实施变得显而易见的，用于执行本发明的上述模式的修改预期在下述权利要求的范围内。
[0288]
本说明书中提到的所有出版物(例如，非专利文献)、专利、专利申请公开和专利申请都指示了本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有此类出版物(例如，非专利文献)、专利、专利申请公开和专利申请都通过引用并入本文，其程度与每个个别出版物、专利、专利申请公开或专利申请被特异性地且个别地指示通过引用并入相同。
[0289]
虽然前述发明已与该优选实施方案结合进行描述，但它不限于此，而是仅受下述权利要求的范围限制。
1.相关申请的交叉引用本技术根据35 u.s.c.
ꢀ§ꢀ
119(e)要求于2019年10月22日提交的美国临时申请号62/924,340的利益，所述美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
2.本发明涉及基因治疗领域，包括用于在受试者或细胞中表达分离的多核苷酸的aav载体。本公开内容还涉及核酸构建体、启动子、载体和包括多核苷酸的宿主细胞，以及将外源dna序列递送至靶细胞、组织、器官或生物的方法，以及用于治疗或预防颗粒蛋白前体相关的神经退行性疾病或病症的方法。
背景技术：
3.基因治疗旨在改善患者的临床后果，所述患者患有由基因表达谱中的异常引起的遗传突变或获得性疾病。基因治疗包括治疗或预防起因于缺陷基因或者异常调控或表达例如表达不足或过表达(其可以导致病症、疾病、恶性肿瘤等)的医学状况。例如，由缺陷基因引起的疾病或病症可以通过向患者递送校正性遗传材料进行治疗、预防或改善，或者可以通过例如用校正性遗传材料，使患者的缺陷基因改变或沉默进行治疗、预防或改善，导致遗传材料在患者内的治疗性表达。
4.基因疗法的基础是供应具有活性基因产物(有时称为转基因或治疗性核酸)的转录盒，例如，其可以导致正面的功能获得效应、负面的功能丧失效应或另一种后果。此类后果可以归于治疗性蛋白质例如抗体、功能性酶或融合蛋白的表达。基因疗法也可以用于治疗由其它因素引起的疾病或恶性肿瘤。人单基因病症可以通过正常基因对靶细胞的递送和表达进行治疗。校正基因在患者的靶细胞中的递送和表达可以经由众多方法来进行，所述方法包括使用改造的病毒和病毒基因递送载体。
5.腺伴随病毒(aav)属于细小病毒科(parvoviridae)，且更具体而言构成依赖性细小病毒属。衍生自aav的载体(即重组aav (ravv)或aav载体)对于递送遗传材料是有吸引力的，因为(i)它们能够感染(转导)广泛多种非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而减少对病毒感染的宿主细胞应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒在人中被视为非病理性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组内的野生型aav形成对比，复制缺陷型aav载体缺乏rep基因并且一般作为附加体持续存在，因此限制了插入诱变或基因毒性的风险；并且(v)与其它载体系统相比，aav载体一般被视为相对较弱的免疫原，并且因此并不触发显著的免疫应答(参见ii)，因此获得载体dna的持久性和治疗性转基因的潜在地长期表达。
6.颗粒蛋白前体(pgrn)是广泛表达的分泌性糖蛋白，其充当许多细胞类型包括神经元细胞的营养因子，调节炎症，并且促进伤口修复。pgrn涉及多个过程的调控，所述过程包括发育、伤口愈合、血管生成、神经元细胞的生长和维持、以及炎症。pgrn在神经元和小胶质
trends in neurosci. 2014 37(7): 388-98)。
10.神经退行性病症代表了老龄化社会中相当大的社会和经济挑战。尽管ftd在痴呆谱系上在流行率和发病率方面仅次于阿尔茨海默氏症，但目前不存在用于ftd的批准治疗或治愈。神经退行性病症的目前治疗一般涉及通过医生减缓症状的进展并使患者更舒适的努力，并且大多数治疗仅掩盖神经衰退的进展。目前，在用于神经退行性疾病或病症的临床开发中不存在颗粒蛋白前体基因疗法。因此，仍然需要用于治疗神经退行性疾病或病症的方法和组合物。
技术实现要素：
11.本公开内容涉及重组腺伴随病毒(raav)载体，颗粒蛋白表达盒可以通过其进行包装，用于cns靶向递送至患有与颗粒蛋白前体(pgrn)突变相关的神经退行性病症的患者。
12.根据一个方面，本公开内容提供了分离的多核苷酸，其包含编码颗粒蛋白前体的核酸序列。根据一些实施方案，核酸序列是非天然存在的序列。根据一些实施方案，核酸序列编码哺乳动物颗粒蛋白前体。根据一些实施方案，哺乳动物颗粒蛋白前体是人颗粒蛋白前体。根据一些实施方案，核酸包含选自以下的序列：seq id no: 5、seq id no: 6、seq id no: 7、seq id no: 8、seq id no: 9、seq id no: 10、seq id no: 11、seq id no: 12、seq id no: 13和seq id no: 14。根据一些实施方案，核酸包含与选自以下的核酸序列具有至少85%同一性的序列：seq id no: 5、seq id no: 6、seq id no: 7、seq id no: 8、seq id no: 9、seq id no: 10、seq id no: 11、seq id no: 12、seq id no: 13和seq id no: 14。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 5具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 5组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 6具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 6组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 7具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 7组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 8具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸
包含与seq id no: 8具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 8具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 8具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 8具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 8具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 8具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 8组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 9具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 9组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 10具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 10组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 11具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 11组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 12具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 12组成。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少85%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少90%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少95%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少96%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少97%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少98%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸包含与seq id no: 13具有至少99%同一性的序列。根据一些实施方案，核酸由seq id no: 13组成。根据一些实施方案，核酸序列对于哺乳动物表达进行密码子优化。根据一些实施方案，核酸序列对于人细胞中的表达进行密码子优化。根据一些实施方案，核酸序列是cdna序列。
根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的功能优化的n末端信号序列。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的血凝素c末端标签。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的分拣蛋白结合抑制(sbi)结构域。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的神经元特异性人突触素-1启动子(hsyn1)。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的遍在活性的cba启动子。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii (camkii)启动子。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含ef1α启动子。根据一些实施方案，本文的各方面和实施方案中描述的任何启动子可以进一步包含位于启动子序列的5' (上游)的另外的cag/cmv增强子元件。根据一些实施方案，启动子进行优化以驱动高颗粒蛋白前体表达。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的3'utr调控区，其包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。根据一些实施方案，核酸序列进一步包含可操作地连接的多聚腺苷酸化信号。根据一些实施方案，多聚腺苷酸化信号是sv40多聚腺苷酸化信号。根据一些实施方案，多聚腺苷酸化信号是人生长激素(hgh)多聚腺苷酸化信号。根据一些实施方案，多核苷酸进一步包含可操作地连接的n末端信号序列，任选地包含血凝素c末端标签或分拣蛋白结合抑制(sbi)结构域，其可操作地连接到神经元特异性人突触素-1启动子、小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii (camkii)启动子、大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子、大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子、人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子、或遍在活性的cba启动子、遍在活性的ef1α启动子、或者在本文的任何方面或实施方案中阐述的任何启动子，进一步包含可操作地连接到3'utr调控区的另外的5' cag/cmv增强子元件，所述3'utr调控区包含可操作地连接到多聚腺苷酸化信号的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。
13.根据一些实施方案，本公开内容提供了宿主细胞，其包含本文的任何方面或实施方案的多核苷酸。根据一些实施方案，宿主细胞是哺乳动物细胞。
14.根据一些实施方案，本公开内容提供了重组单纯疱疹病毒(rhsv)，其包含本文的任何方面或实施方案的多核苷酸。
15.根据一些实施方案，本公开内容提供了转基因表达盒，其包含本文的任何一个方面或实施方案的多核苷酸、以及最小调控元件。根据一些实施方案，本公开内容提供了核酸载体，其包含权利要求24的表达盒。根据一些实施方案，载体是腺伴随病毒(aav)载体。根据一些实施方案，本公开内容提供了宿主细胞，其包含本文的任何方面或实施方案的转基因表达盒。根据一些实施方案，本公开内容提供了表达载体，其包含本文的任何方面和实施方案的多核苷酸。根据一些实施方案，载体是腺伴随病毒(aav)载体。根据一些实施方案，所述aav载体的衣壳序列的血清型和itr的血清型独立地选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11和aav12。
16.根据一些实施方案，本公开内容提供了重组腺伴随(raav)表达载体，其包含本文的任何方面和实施方案的多核苷酸、以及aav基因组盒。根据一些实施方案，aav基因组盒的侧翼为两个序列调节的反向末端重复。
17.根据一些实施方案，本公开内容提供了重组腺伴随(raav)表达载体，其包含本文
的任何一个方面和实施方案的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到n末端信号序列，任选地包含血凝素c末端标签或分拣蛋白结合抑制(sbi)结构域，其可操作地连接到神经元特异性人突触素-1启动子(hsyn)、小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii (camkii)启动子、大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子、大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子、人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子、或遍在活性的cba启动子、遍在活性的ef1α启动子、或者在本文的任何方面或实施方案中阐述的任何启动子，进一步包含可操作地连接到3'utr调控区的另外的5' cag/cmv增强子元件，所述3'utr调控区包含可操作地连接到多聚腺苷酸化信号的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)，其中两个序列调节的反向末端重复(itr)侧接aav基因组盒，并且进一步包含蛋白质衣壳变体。根据一些实施方案，多聚腺苷酸化信号是sv40或人生长激素(hgh)多聚腺苷酸化信号。根据一些实施方案，启动子进行优化以驱动高颗粒蛋白前体表达。根据一些实施方案，raav是选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aa-9、rhaav10 (也称为aavrh10)、aav10、aav11和aav12的血清型。根据一些实施方案，raav是选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、rh-aav10、aav10、aav11和aav12的血清型的变体或杂合体。根据一些实施方案，raav包含在aav病毒粒子内。
18.根据一些方面，本公开内容包含表达载体，其包含aavrh10-hsyn-pgrnwt。
19.根据一些实施方案，本公开内容提供了重组单纯疱疹病毒(rhsv)，其包含本文的任何方面或实施方案的表达载体。根据一些实施方案，本公开内容提供了宿主细胞，其包含本文的任何方面和实施方案的表达载体。根据一些实施方案，宿主细胞是哺乳动物细胞。
20.根据一些实施方案，本公开内容提供了转基因表达盒，其包含本文的任何方面和实施方案的多核苷酸、以及最小调控元件。根据一些实施方案，本公开内容提供了核酸载体，其包含本文的任何方面或实施方案的表达盒。根据一些实施方案，载体是腺伴随病毒(aav)载体。
21.根据一些实施方案，本公开内容提供了组合物，其包含本文的任何方面或实施方案的多核苷酸。根据一些实施方案，本公开内容提供了组合物，其包含本文的任何方面或实施方案的宿主细胞。根据一些实施方案，本公开内容提供了组合物，其包含本文的任何方面或实施方案的重组单纯疱疹病毒(rhsv)。根据一些实施方案，本公开内容提供了组合物，其包含本文的任何方面或实施方案的转基因表达盒。根据一些实施方案，本公开内容提供了组合物，其包含本文的任何方面或实施方案的表达载体。根据一些实施方案，组合物是药物组合物。
22.根据一些实施方案，本公开内容提供了治疗神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的多核苷酸施用于有此需要的受试者。
23.根据一些实施方案，本公开内容提供了治疗神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的转基因表达盒施用于有此需要的受试者。
24.根据一些实施方案，本公开内容提供了治疗神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的表达载体施用于有此需要的受试者。
25.根据一些实施方案，本公开内容提供了治疗神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的重组腺伴随(raav)表达载体施用于有此需要的受试者。
26.根据一些实施方案，本公开内容提供了预防神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的多核苷酸施用于有此需要的受试者。
27.根据一些实施方案，本公开内容提供了预防神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的转基因表达盒施用于有此需要的受试者。
28.根据一些实施方案，本公开内容提供了预防神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的表达载体施用于有此需要的受试者。
29.根据一些实施方案，本公开内容提供了预防神经退行性病症的方法，其包括将本文的任何方面或实施方案的重组腺伴随(raav)表达载体施用于有此需要的受试者。
30.根据一些实施方案，本公开内容提供了治疗神经退行性病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用重组腺伴随(raav)病毒颗粒，其包含本文的任何方面或实施方案的多核苷酸。根据一些实施方案，本公开内容提供了预防神经退行性病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用重组腺伴随(raav)病毒颗粒，其包含本文的任何方面或实施方案的多核苷酸。根据一些实施方案，神经退行性病症的特征在于认知破坏、行为损害、缺陷型溶酶体贮存或其组合。根据一些实施方案，神经退行性病症是颗粒蛋白前体相关的神经退行性病症。根据一些实施方案，神经退行性病症是家族性额颞叶痴呆(ftd)、额颞叶变性(ftld)、神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl)或阿尔茨海默氏病(ad)。根据一些实施方案，神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl)是神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)。根据一些实施方案，施用针对中枢神经系统。根据一些实施方案，施用是静脉内的、脑室内的、鞘内的或其组合。
31.根据一个方面，本公开内容提供了用于产生重组aav病毒颗粒的方法，其包括：用第一重组疱疹病毒和第二重组疱疹病毒共感染悬浮细胞，所述第一重组疱疹病毒包含编码aav rep和aav cap基因的核酸，所述基因各自可操作地连接到启动子，所述第二重组疱疹病毒包含颗粒蛋白前体基因以及与所述基因可操作地连接的启动子；并且允许细胞产生重组aav病毒颗粒，从而产生重组aav病毒颗粒。根据一些实施方案，cap基因选自具有选自aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、rh-aav-10、aav11和aav12的血清型的aav。根据一些实施方案，第一疱疹病毒和第二疱疹病毒是选自巨细胞病毒(cmv)、单纯疱疹病毒(hsv)和水痘带状疱疹(vzv)和eb病毒(ebv)的病毒。根据一些实施方案，疱疹病毒是复制缺陷型的。根据一些实施方案，共感染是同时的。
附图说明
32.图1显示了pgrn构建体的示意图，其包含在每个端部处的反向末端重复(itr)、人突触素1 (hsyn1)或鸡β肌动蛋白(cba)启动子、任选地包含c末端ha标签或c末端中的3-16个核酸的缺失的pgrn、土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件(wpre)、sv40早期多聚腺苷酸化信号(sv40pa)和任选的填充dna。下图显示了自互补aav基因组的示意图。
33.图2显示了鸡β肌动蛋白(cba)启动子的核酸序列(seq id no: 1)。
34.图3显示了人突触素1 (hsyn1)启动子的核酸序列(seq id no: 2)。
35.图4显示了用于单链(ss)和自互补(sc) aav基因组的5'-3'反向末端重复(itr) (seq id no: 3)。
36.图5a显示了仅用于单链(ss) aav基因组的3
’‑5’ꢀ
itr (seq id no: 4)。图5b显示了仅用于自互补(sc) aav基因组的3
’‑5’ꢀ
trs (seq id no: 26)。trs指缩短的itr。
37.图6显示了野生型人颗粒蛋白前体(hpgrnwt)的核酸序列(seq id no: 5)。
38.图7显示了野生型小鼠颗粒蛋白前体(mpgrnwt)的核酸序列(seq id no: 6)。
mpgrnwt与hpgrn是78%相似的。
39.图8显示了猕猴(恒河猴(macaca mulatta))的核酸序列(seq id no: 7)。猕猴pgrn与hpgrn是96%相似的。
40.图9显示了hpgrncoa的核酸序列(seq id no: 8)。
41.图10显示了hpgrncob的核酸序列(seq id no: 9)。
42.图11显示了hpgrncoc的核酸序列(seq id no: 10)。
43.图12显示了hpgrncod的核酸序列(seq id no: 11)。
44.图13显示了hpgrncoe的核酸序列(seq id no: 12)。
45.图14显示了hpgrncof的核酸序列(seq id no: 13)。
46.图15显示了hpgrn分拣蛋白结合缺陷变体的核酸序列(seq id no: 14)。
47.图16显示了血凝素(ha)标签的核酸序列(seq id no: 15)。
48.图17显示了wpre的核酸序列(seq id no: 16)。
49.图18显示了sv40 pa的核酸序列(seq id no: 17)。
50.图19显示了camkii启动子(364 bp)的核酸序列，其对应于来自genbank aj222796的序列，nuc 7625-7988 (seq id no: 18)。
51.图20显示了大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子(1034 bp)的核酸序列(seq id no: 19)。
52.图21显示了大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子(1801 bp)的核酸序列(seq id no: 20)。
53.图22显示了人血小板衍生生长因子-β链(pdgf-b)启动子的核酸序列(seq id no: 21 (pdgfb_1)、seq id no: 24 (pdg-b_2)和seq id no: 25 (pdgfb_3))。人基因组中存在三个限定的pdgf-b启动子，跨越染色体nc_000022.11的[-]链上的定位39244982
ꢀ–ꢀ
39244621。关于pdgf-b启动子的序列包括所提供的3个核心启动子序列中的最少1个或其任何独特的组合。散在的序列可以是任何非编码、非调控的功能序列，包括完全没有序列。
[0054]
图23显示了ef1α启动子(806 bp)的核酸序列(seq id no: 22)。
[0055]
图24显示了cag/cmv增强子的核酸序列(seq id no: 23)。
[0056]
图25概括了在鞘内注射后，测试非人灵长类动物中的gfp报道分子表达的raavrh10、aav9、δhsmax和aav2tyf衣壳的结果。显示了脑的不同区域中的gfp阳性细胞百分比和gfp强度。
[0057]
图26概括了通过注射到大池(icm)内，在非人灵长类动物中的raavrh10生物分布结果。
[0058]
图27显示了描绘实验结果的图，所述实验测试cba或hsyn启动子对hek293和sh-sy5y细胞中的gfp表达的作用。
[0059]
图28显示了描绘伴随和不伴随ad5载体，在hek293和shsy-5y细胞中的raavrh10-cba-hgfp转导后的gfp表达的图。
[0060]
图29显示了确定与野生型相比，6种pgrn密码子优化变体(指定为coa-cof)的蛋白质表达的elisa实验结果。
[0061]
图30显示了确定与野生型相比，6种pgrn密码子优化变体(指定为coa-cof)的蛋白质表达的蛋白质印迹实验结果。
[0062]
图31显示了描绘测试在hsyn启动子的控制下的密码子优化变体coe (pgrncoe)和cof (pgrncof)对hek 293细胞中的颗粒蛋白前体表达的作用的图。
[0063]
图32显示了确认颗粒蛋白前体表达的蛋白质印迹实验结果。
[0064]
图33显示了确定与野生型相比，6种pgrn密码子优化变体(指定为coa-cof)的蛋白质表达的elisa实验结果。
[0065]
图34显示了在nhp中用raavrh10-hsyn-pgrnwt的体内研究中，在8和10周后确定的颗粒蛋白前体表达。
具体实施方式
[0066]
定义除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有由本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下述参考为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：singleton等人，dictionary of microbiology and molecular biology (第2版1994)；the cambridge dictionary of science and technology (walker编辑，1988)；the glossary of genetics，第5版，r. rieger等人(编辑)，springer verlag (1991)；以及hale & marham，the harper collins dictionary of biology (1991)。如本文使用的，下述术语具有下文归于其的含义，除非另有说明。
[0067]
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个/种或多于一个/种(即至少一个/种)冠词的语法对象。例如，“元件”意指一个元件或多于一个元件。
[0068]
术语“包括”在本文中用于意指短语“包括但不限于”，并且可与短语“包括但不限于”互换使用。
[0069]
除非上下文另有明确说明，否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与术语“和/或”互换使用。
[0070]
术语“例如”在本文中用于意指短语“例如但不限于”，并且可与短语“例如但不限于”互换使用。
[0071]
如本文使用的，术语“施用(administer)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”等等，是指用于致使治疗剂或药物组合物递送至所需的生物作用部位的方法。
[0072]
如本文使用的，术语“aav病毒粒子”广义上是指完整的病毒颗粒，例如如野生型aav病毒粒子颗粒，其包含包装到aav衣壳蛋白内的单链基因组dna。单链核酸分子是有义链或反义链，因为两条链是同等感染性的。术语“raav病毒颗粒”指重组aav病毒颗粒，即其为感染性但复制缺陷型的颗粒。raav病毒颗粒包含包装到aav衣壳蛋白内的单链基因组dna。
[0073]
如本文使用的，术语“生物反应器”广义上是指可以用于培养细胞的目的的任何仪器。
[0074]
如本文使用的，术语“载体”意欲包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。补充的活性成分也可以掺入组合物内。短语“药学上可接受的”指当施用于宿主时，不产生毒性、过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。
[0075]
如本文使用的，术语“侧翼”指一个核酸序列关于另一个核酸序列的相对位置。一般地，在序列abc中，b的侧翼为a和c。排列axbxc也是如此。因此，侧翼序列在侧接序列之前或之后，但无需与侧接序列邻接或紧邻。
[0076]
如本文使用的，术语“基因递送”意指通过其将外源dna转移到宿主细胞用于基因疗法的应用的过程。
[0077]
如本文使用的，术语“基因”或“编码序列”广义上是指编码蛋白质的dna区域(转录区域)。当置于适当的调控区例如启动子的控制下时，编码序列被转录(dna)且翻译(rna)成多肽。基因可以包含几个可操作连接的片段，例如启动子、5'-前导序列、编码序列和3'-非翻译序列，包含多聚腺苷酸化位点。短语“基因的表达”指其中基因被转录成rna和/或翻译成活性蛋白质的过程。
[0078]
如本文使用的，如本文使用的术语“目的基因(goi)”广义上指引入aav表达载体内的异源序列，并且通常指编码在人或动物中具有治疗用途的蛋白质的核酸序列。
[0079]
如本文使用的，术语“疱疹病毒”或“疱疹病毒科”广义上是指具有相对较大基因组的有包膜的双链dna病毒的一般科。该科在广泛范围的脊椎动物和无脊椎动物宿主的核中复制，在优选的实施方案中，在哺乳动物宿主例如在人、马、牛、小鼠和猪中复制。疱疹病毒科的示例性成员包括巨细胞病毒(cmv)、单纯疱疹病毒1型和2型(hsv1和hsv2)和水痘带状疱疹(vzv)和eb病毒(ebv)。
[0080]
如本文使用的，术语“异源的”意指衍生自基因型不同于它与之进行比较或者引入或掺入其内的实体其余部分的实体。例如，通过遗传改造技术引入不同细胞类型内的多核苷酸是异源多核苷酸(并且在表达时，可以编码异源多肽)。类似地，掺入病毒载体内的细胞序列(例如基因或其一部分)是关于载体的异源核苷酸序列。
[0081]
如本文使用的，术语“增加”、“增强”、“上升”(和类似术语)一般指相对于天然、预计或平均值，或者相对于对照条件，直接或间接地增加浓度、水平、功能、活动或行为的动作。
[0082]
如本文使用的，术语“感染”广义上是指通过病毒将异源dna递送到细胞内。如本文使用的，术语“共感染”意指用两种或更多种病毒的“同时感染”、“双重感染”、“多重感染”或“连续感染”。用两种(或更多种)病毒感染生产细胞将被称为“共感染”。术语“转染”指通过物理或化学方法将异源dna递送至细胞的过程，例如借助于电穿孔、磷酸钙沉淀或本领域众所周知的其它方法转移到细胞内的质粒dna。
[0083]
如本文使用的，术语“反向末端重复”或“itr”序列是指在病毒基因组的末端处发现的相对短的序列，其处于相反取向。本领域众所周知的术语，“aav反向末端重复(itr)”序列是大约145个核苷酸的序列，其存在于天然单链aav基因组的两个末端处。itr最外面的核苷酸可以以两种替代取向中的任一种存在，导致在不同aav基因组之间和单个aav基因组的两端之间的异质性。
[0084]“野生型itr”、“wt-itr”或“itr”指aav或其它依赖病毒属(dependovirus)中天然存在的itr序列的序列，其保留例如rep结合活性和rep切口能力。由于遗传密码的简并性或漂移，来自任何aav血清型的wt-itr的核苷酸序列可能与规范的天然存在的序列略微不同，并且因此对于在本文中使用所涵盖的wt-itr序列包括由于在生产过程期间发生的天然存在的变化的wt-itr序列 (例如，复制错误)。
[0085]
如本文使用的，术语“末端重复”或“tr”包括任何病毒末端重复或合成序列，其包含至少一个最小所需复制起点和包含回文发夹结构的区域。rep结合序列(“rbs”) (也称为rbe (rep结合元件))和末端解离位点(“trs”)一起构成“最小所需复制起点”，并且因此tr包含至少一种rbs和至少一种trs。其在给定的多核苷酸序列段内是彼此的反向互补体的tr通常各自被称为“反向末端重复”或“itr”。在病毒的背景下，itr介导复制、病毒包装、整合和前病毒拯救。
[0086]
术语“在体内”指在生物如多细胞动物中或其内发生的测定或过程。在本文所述的一些方面，当使用单细胞生物如细菌时，方法或用途可以被说成“在体内”发生。术语“离体”指使用具有完整膜的活细胞执行的方法和用途，所述活细胞在多细胞动物或植物的机体外部，例如外植体、培养的细胞包括原代细胞和细胞系、转化的细胞系和提取的组织或细胞包括血细胞等。术语“在体外”指不要求具有完整膜的细胞存在的测定和方法，例如细胞提取物，并且可以指在非细胞系统中引入可编程的合成生物回路，例如不包含细胞或细胞系统的培养基，例如细胞提取物。
[0087]
如本文使用的，术语“分离的”分子(例如，分离的核酸或蛋白质或细胞)意指它已从其天然环境的组分中鉴定且分离和/或回收。
[0088]
如本文使用的，术语“最小调控元件”是指对于基因在靶细胞中的有效表达所必需的调控元件，并且因此应该包括在转基因表达盒中。此类序列可以包括例如启动子或增强子序列、促进dna片段插入质粒载体内的多接头序列、以及负责mrna转录物的内含子剪接和多聚腺苷酸化的序列。
[0089]
如本文使用的，术语“降到最低”、“减少”、“降低”和/或“抑制”(和类似术语)一般指相对于天然、预计或平均值，或者相对于对照条件，直接或间接地减少浓度、水平、功能、活动或行为的动作。
[0090]
如本文使用的，术语“神经系统”包括中枢神经系统和外周神经系统两者。术语“中枢神经系统”或“cns”包括脊椎动物的脑和脊髓的所有细胞和组织。术语“外周神经系统”指脑和脊髓以外的神经系统部分的所有细胞和组织。因此，术语“神经系统”包括但不限于神经元细胞，神经胶质细胞，星形胶质细胞，脑脊液(csf)中的细胞，胞间隙中的细胞，脊髓的保护性覆盖中的细胞，硬膜外细胞(即，硬脑膜外的细胞)，与神经组织邻近或接触或由其神经支配的非神经组织中的细胞，神经外膜、神经束膜、神经内膜、索、神经束等等中的细胞。
[0091]
如本文使用的，术语“非天然存在的”广义上是指在自然界中不存在的蛋白质、核酸、核糖核酸或病毒。例如，它可以是遗传修饰的变体，例如cdna或密码子优化的核酸。
[0092]
如本文使用的，“核酸”或“核酸分子”是指由单体核苷酸链组成的分子，例如dna分子(例如，cdna或基因组dna)。核酸可以编码例如启动子、pgrn基因或其一部分、或调控元件。核酸分子可以是单链或双链的。“pgrn核酸”指包含pgrn基因或其一部分、或者pgrn基因的功能变体或其一部分的核酸。基因的功能变体包括具有微小变异的基因变体，所述微小变异例如如沉默突变、单核苷酸多态性、错义突变以及并不显著改变基因功能的其它突变或缺失。
[0093]
dna和rna链的不对称端称为5' (五引物)和3' (三引物)端，其中5'端具有末端磷酸基，而3'端具有末端羟基。五引物(5')端具有在其末端处的脱氧核糖或核糖的糖环中第五个碳。核酸在体内以5'到3'方向合成，因为用于组装新链的聚合酶经由磷酸二酯键将每
个新核苷酸附着到3'-羟基(-oh)基团。
[0094]
如本文使用的，术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离，或者被修饰为含有以否则不存在于自然界中的形式的核酸区段，或者是合成的。当核酸构建体含有对于表达本公开内容的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
[0095]“编码”特定pgrn蛋白(包括其片段和一部分)的dna序列是转录成特定rna和/或蛋白质的核酸序列。dna多核苷酸可以编码翻译成蛋白质的rna (mrna)，或者dna多核苷酸可以编码不翻译成蛋白质的rna (例如trna、rrna或靶向dna的rna；也称为“非编码”rna或"ncrna")。
[0096]
如本文使用的，术语“可操作地连接的(operatively linked)”或“可操作地连接的(operably linked)”或“偶联的”可以指遗传元件的并列，其中元件处于允许其以预计方式操作的关系中。例如，如果启动子帮助启动编码序列的转录，则启动子可以是与编码区可操作地连接的。在启动子和编码区之间可能存在间插残基，只要这种功能关系得到维持。
[0097]
如本文使用的，关于参考多肽或核酸序列的“百分比(%)序列同一性”定义为在比对序列且在需要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，并且不将任何保守取代视为序列同一性的部分，候选序列中与参考多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。用于确定百分比氨基酸或核酸序列同一性目的的比对可以以在本领域技术内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件程序，例如current protocols in molecular biology (ausubel等人，编辑1987)，supp. 30，部分7.7.18，表7.7.1中描述的那些程序，并且包括blast、blast-2、align或megalign (dnastar)软件。比对程序的实例是align plus (scientific and educational software，pennsylvania)。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。为了本文的目的，给定氨基酸序列a与、对于或针对给定氨基酸序列b的%氨基酸序列同一性(其可以可替代地表述为与、对于或针对给定氨基酸序列b具有或包含一定%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)如下进行计算：100乘以分数x/y，其中x是在该程序的a和b的比对中，通过序列比对程序中评分为相同匹配的氨基酸残基数目，并且其中y是b中氨基酸残基的总数。应了解，氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度，a与b的%氨基酸序列同一性将不等于b与a的%氨基酸序列同一性。为了本文的目的，给定核酸序列c与、对于或针对给定核酸序列d的%核酸序列同一性(其可以可替代地表述为与、对于或针对给定核酸序列d具有或包含一定%核酸序列同一性的给定核酸序列c)如下进行计算：100乘以分数w/z，其中w是在该程序的c和d的比对中，通过序列比对程序中评分为相同匹配的核苷酸数目，并且其中z是d中核苷酸的总数。应了解，核酸序列c的长度不等于核酸序列d的长度，c与d的%核酸序列同一性将不等于d与c的%核酸序列同一性。
[0098]
如本文使用的，术语“药物组合物”或“组合物”是指任选地与至少一种药学上可接受的化学组分混合的、本文所述的组合物或试剂(例如重组腺伴随(raav)表达载体)，所述化学组分例如(尽管并不限于)载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂、赋形剂等等。
[0099]
如本文使用的，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物并且不限于最小长度。此类氨基酸残基聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于肽，寡肽，氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。全长蛋白质及其片段两者均由该
no: 18。根据一些实施方案，camkii启动子由seq id no: 18组成。根据一些实施方案，启动子是大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子。大鼠微管蛋白α1启动子是负责根据形态生长调控神经元基因表达的中等强度的启动子。大鼠ta1启动子在通过引用以其整体并入本文的gloster等人1994 j of neuroscience中进行描述。图20显示了大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子的核酸序列(seq id no: 19)。根据一些实施方案，ta1启动子包含seq id no: 19。根据一些实施方案，ta1启动子由seq id no: 19组成。根据一些实施方案，启动子是大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子。大鼠神经元特异性烯醇化酶启动子是中等强度的发育调控型启动子。图21显示了大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子的核酸序列(seq id no: 20)。根据一些实施方案，nse启动子包含seq id no: 20。根据一些实施方案，nse启动子由seq id no: 20组成。根据一些实施方案，启动子是人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子。人血小板衍生生长因子-β链启动子是对神经元和(神经元相关的)神经胶质细胞特异性的中等强度的启动子。人基因组中存在三个限定的启动子，跨越染色体nc_000022.11的[-]链上的定位39244982
ꢀ–ꢀ
39244621 (跨越362个核苷酸)。图22显示了人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子的核酸序列(seq id no: 21、seq id no: 24和seq id no: 25)。根据一些实施方案，pdgf-β链启动子包含seq id no: 21。根据一些实施方案，pdgf-β链启动子由seq id no: 21组成。根据一些实施方案，启动子是遍在活性的ef1α启动子。ef1a启动子是哺乳动物起源的强遍在启动子，其在大多数细胞类型包括cns的细胞中表达。图23显示了ef1α启动子的核酸序列(seq id no: 22)。根据一些实施方案，ef1α启动子包含seq id no: 22。根据一些实施方案，ef1α启动子由seq id no: 22组成。根据一些实施方案，本文的各方面和实施方案中阐述的任何启动子进一步包含另外的5
’ꢀ
cag/cmv增强子元件。cag/cmv增强子是衍生自影响强遍在cag启动子及其cmv亲本启动子的增强子的强增强子元件；两者通常用于增强核心启动子的转录活性。图24显示了cag/cmv增强子的核酸序列(seq id no: 23)。
[0102]
启动子可以被说成驱动它调控的核酸序列的表达或转录。短语“可操作地连接(operably linked)”、“可操作地定位”、“可操作地连接(operatively linked)”、“处于控制下”和“处于转录控制下”，指示启动子相对于它调控的核酸序列处于正确的功能定位和/或取向上，以控制该序列的转录起始和/或表达。如本文使用的，“反向启动子”指其中核酸序列处于反向取向上的启动子，使得编码链现在是非编码链，且反之亦然。反向启动子序列可以用于各个实施方案中，以调控开关的状态。另外，在各个实施方案中，启动子可以与增强子结合使用。
[0103]
启动子可以是与基因或序列天然相关的启动子，如可以通过分离定位于给定基因或序列的编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列而获得。此类启动子可以被称为“内源的”。类似地，在一些实施方案中，增强子可以是与定位于该序列下游或上游的核酸序列天然相关的增强子。
[0104]
在一些实施方案中，编码核酸区段置于“重组启动子”或“异源启动子”的控制下，这两者均指通常不与它在其天然环境中与之可操作地连接的编码核酸序列相关的启动子。重组或异源增强子指在其天然环境中通常不与给定核酸序列相关的增强子。此类启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子；从任何其它原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子；以及非“天然存在”的合成启动子或增强子，即包含不同转录调控区的不同元件，和/或通过本领域已知的遗传改造方法改变表达的突变。
[0105]
如本文使用的，术语“增强子”指顺式作用调控序列(例如，50-1,500个碱基对)，其结合一种或多种蛋白质(例如，激活蛋白或转录因子)，以增加核酸序列的转录激活。增强子可以位于它们调控的基因起始位点上游或基因起始位点下游最多1,000,000个碱基对。
[0106]
如本文使用的，术语“重组体”可以指这样的生物分子，例如基因或蛋白质，其(1)已从其天然存在的环境中取出，(2)不与基因在自然界中在其中发现的多核苷酸的全部或一部分相关，(3)可操作地连接到它在自然界中不与之连接的多核苷酸，或(4)在自然界中不存在。术语“重组体”可以用于提及克隆的dna分离物、化学合成的多核苷酸类似物或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由此类核酸编码的蛋白质和/或mrna。
[0107]
如本文使用的，术语“重组hsv”、“rhsv”和“rhsv载体”广义上是指分离的、遗传修饰形式的单纯疱疹病毒1型(hsv)，其含有掺入病毒基因组内的异源基因。术语“rhsv-rep2cap2”或“rhsv-rep2cap1”意指其中来自aav血清型1或2的aav rep和cap基因已掺入rhsv基因组内的rhsv，在某些实施方案中，编码目的治疗基因的dna序列已掺入病毒基因组内。
[0108]
如本文使用的，待通过本发明的方法治疗的“受试者”或“患者”或“个体”是指人或非人动物。“非人动物”包括任何脊椎动物或无脊椎动物生物。人受试者可以具有任何年龄、性别、种族或民族，例如高加索人(白人)、亚洲人、非洲人、黑人、非裔美国人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在一些实施方案中，受试者可以是临床环境中的患者或其它受试者。在一些实施方案中，受试者已经在经历治疗。在一些实施方案中，受试者是新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。
[0109]
如本文使用的，术语“疗效”指治疗的后果，所述治疗的结果被判断为期望和有益的。疗效可以包括直接或间接地阻止、减少或消除疾病表现。疗效还可以直接或间接地包括阻止、减少或消除疾病表现的进展。
[0110]
对于本文所述的任何治疗剂，治疗有效量可以最初根据初步体外研究和/或动物模型进行确定。治疗有效剂量也可以根据人数据进行确定。可以基于所施用化合物的相对生物利用度和效力来调整施加的剂量。基于上述方法及其它众所周知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。在下文概括了关于确定治疗有效性的一般原则，其可以在通过引用并入本文的goodman和gilman的the pharmacological basis of therapeutics，第10版，mcgraw-hill (new york) (2001)的第1章中找到。
[0111]
如本文使用的，术语“取代突变谱”是指在颗粒蛋白前体的结构域间区域中的一组保守氨基酸取代，所述保守氨基酸取代消除其5个弹性蛋白酶切割位点和/或2个其它的蛋白酶解切割位点中的一个或多个(参见例如，cenik等人，jbc 2012；zhu等人，cell 2002，这两者均通过引用以其整体并入本文)。根据一些实施方案，取代突变将减少或阻止pgrn被加工成颗粒蛋白。
[0112]
如本文使用的，术语“转基因”是指引入细胞内并且能够转录成rna并且任选地在适当条件下翻译和/或表达的多核苷酸。在一些方面，它赋予它引入其内的细胞所需的性质，或以其它方式导致所需的治疗或诊断后果。
[0113]
如本文使用的，“转基因表达盒”或“表达盒”可互换使用，并且指包括转基因的线性核酸段，其与一个或多个启动子或足以指导转基因转录的其它调控序列可操作地连接，但不包含衣壳编码序列、其它载体序列或反向末端重复区。表达盒可以另外包含一种或多
种顺式作用序列(例如启动子、增强子或阻遏物)、一种或多种内含子和一种或多种转录后调控元件。转基因表达盒包含核酸载体待递送至靶细胞的基因序列。这些序列包括目的基因(例如，pgrn核酸或其变体)、一种或多种启动子和最小调控元件。
[0114]
如本文使用的，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”疾病或病症是指疾病或病症的一种或多种体征或症状的减轻，疾病或病症程度的缩小，疾病或病症的稳定(例如，不恶化)状态，预防疾病或病症的传播，疾病或病症进展的延迟或减缓，疾病或病症状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。例如，当以有效量(或剂量)表达时，pgrn足以使异常生理应答得到预防、校正和/或正常化，例如足以使疾病或病症的临床显著特征减少至少约30%、更优选至少50%、最优选至少90%的疗效。“治疗”还可以指与未接受治疗的预计存活相比延长存活。
[0115]
如本文使用的，术语“载体”是指包含待在体外或体内递送到宿主细胞内的核酸的重组质粒或病毒。
[0116]
如本文使用的，术语“表达载体”指的是指导来自与载体上的转录调控序列连接的序列的rna或多肽表达的载体。表达的序列经常(但不一定)对细胞是异源的。表达载体可以包含另外的元件，例如，表达载体可以具有两种复制系统，因此允许其在两种生物中维持，例如在人细胞中用于表达以及在原核宿主中用于克隆和扩增。术语“表达”指涉及产生rna和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，适当时包括但不限于例如转录，转录物加工、翻译和蛋白质折叠，修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的rna，以及通过从基因转录的mrna翻译获得的多肽。术语“基因”意指当可操作地连接到适当的调控序列时，在体外或体内将(dna)转录为rna的核酸序列。基因可以包括或不包括在编码区之前和之后的区域，例如，5'非翻译(5'utr)或“前导”序列和3
’ꢀ
utr或“尾随”序列、以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
[0117]
如本文使用的，术语“重组病毒载体”是指包含一种或多种异源序列(即，非病毒起源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组aav载体的情况下，重组核酸的侧翼为至少一个反向末端重复序列(itr)。根据一些实施方案，重组核酸的侧翼为两个itr。
[0118]
如本文使用的，术语“重组aav载体(raav载体)”是指包含一种或多种异源序列(即，非aav起源的核酸序列)的多核苷酸载体，所述异源序列的侧翼为至少一个aav反向末端重复序列(itr)。当存在于已被合适的辅助病毒感染(或表达合适的辅助功能)，并且表达aav rep和cap基因产物(即aav rep和cap蛋白)的宿主细胞中时，此类raav载体可以被复制并包装到感染性病毒颗粒内。当raav载体掺入更大的多核苷酸内(例如，染色体或另一种载体例如用于克隆或转染的质粒中)，那么raav载体可以被称为“前载体(pro-vector)”，其可以在aav包装功能和合适的辅助功能的存在下，通过复制和衣壳化得到“拯救”。raav载体可以是多种形式中的任一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质复合、在脂质体内封装、以及在病毒颗粒例如aav颗粒中衣壳化。raav载体可以包装到aav病毒衣壳内，以生成“重组腺伴随病毒颗粒(raav颗粒)”。
[0119]
如本文使用的，术语“raav病毒”或“raav病毒颗粒”是指由至少一种aav衣壳蛋白和衣壳化的raav载体基因组组成的病毒颗粒。
[0120]
如本文使用的，“报道分子”指可以用于提供可检测读出的蛋白质。报道分子一般产生可测量的信号，例如荧光、颜色或发光。报道蛋白编码序列编码其在细胞或生物中的存
在很容易观察到的蛋白质。例如，荧光蛋白在用特定波长的光激发时促使细胞发荧光，萤光素酶促使细胞催化产生光的反应，而酶如β-半乳糖苷酶将底物转换为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报道多肽包括但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(lacz)、碱性磷酸酶(ap)、胸苷激酶(tk)、绿色荧光蛋白(gfp)及其它荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(cat)、萤光素酶和本领域众所周知的其它。
[0121]
转录调节剂指激活或阻遏目的基因例如pgrn转录的转录激活物和阻遏物。启动子是启动特定基因转录的核酸区域。转录激活物通常在转录启动子附近结合并募集rna聚合酶以直接启动转录。阻遏物与转录启动子结合，并且在空间上阻碍通过rna聚合酶的转录起始。取决于它们结合的位置以及细胞和环境条件，其它转录调节剂可以充当激活物或阻遏物。转录调节剂类别的非限制性实例包括但不限于同源域蛋白、锌指蛋白、翼螺旋(叉头)蛋白和亮氨酸拉链蛋白。
[0122]
如本文使用的，“阻遏蛋白”或“诱导蛋白”是与调控序列元件结合，并且分别阻遏或激活与调控序列元件可操作地连接的序列转录的蛋白质。如本文所述的优选阻遏蛋白和诱导蛋白对至少一种输入试剂或环境输入的存在或不存在敏感。如本文所述的优选蛋白质在形式上是模块化的，包含例如可分离的dna结合和输入试剂结合或响应元件或结构域。
[0123]
如本文使用的，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”用于提及组合物、方法及其分别的组分，其对于方法或组合物是必需的，但对包括无论是否是必需的未指定元件开放。
[0124]
如本文使用的，术语“基本上由
……
组成”指对于给定实施方案所需的那些元件。该术语允许存在实质上并不影响该实施方案的基本和新颖或功能特性的元件。“包含”的使用指示包括而不是限制。
[0125]
术语“由
……
组成”指如本文所述的组合物、方法及其分别的组分，其排除在实施方案的描述中未叙述的任何元件。
[0126]
如本文使用的，术语“基本上由
……
组成”指对于给定实施方案所需的那些元件。该术语允许存在实质上并不影响本发明的该实施方案的基本和新颖或功能特性的另外元件。
[0127]
术语“包括”在本文中用于意指短语“包括但不限于”，并且可与短语“包括但不限于”互换使用。
[0128]
术语“例如”在本文中用于意指短语“例如但不限于”，并且可与短语“例如但不限于”互换使用。
[0129]
如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“方法”的提及包括本文所述类型和/或在阅读本公开内容后对于本领域技术人员将变得显而易见的一种或多种方法、和/或步骤等等。类似地，除非上下文另有明确说明，否则单词“或”预期包括“和”。尽管下文描述了合适的方法和材料，但与本文所述的相似或等价的方法和材料可以用于本公开内容的实践或测试中。缩写“例如”衍生自拉丁语exempli gratia，并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“例如”与术语“如”同义。
[0130]
本文公开的本发明的替代元件或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组成员可以个别地或者与组的其它成员或本文发现的其它元件以任何组合被提及且请求保护。为
了方便和/或可专利性的原因，组的一个或多个成员可以包括在组中或从组中缺失。当发生任何此类包括或缺失时，本说明书在本文中被视为含有如此修饰的组，因此满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
[0131]
在任何方面的一些实施方案中，本文所述的公开内容并不涉及用于克隆人类的方法、用于修饰人类的种系遗传同一性的方法、人胚胎用于工业或商业目的的用途或用于修饰动物的遗传同一性的方法，所述方法很可能促使其遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医疗益处，以及起因于此类方法的动物。
[0132]
其它术语在本文中在本发明的各个方面的描述内进行定义。
[0133]
在本技术自始至终引用的所有专利及其它出版物；包括参考文献、授权专利、公开专利申请和共同未决专利申请，明确地通过引用并入本文，用于描述且公开例如此类出版物中描述的可以与本文描述的技术结合使用的方法学的目的。提供这些出版物仅由于其公开内容在本技术的提交日期之前。在这点上不应解释为承认由于在先发明或出于任何其他原因，本发明人无权先于此类公开内容。关于日期的所有声明或关于这些文件内容的表达基于申请人可获得的信息，并不构成关于这些文件的日期或内容正确性的任何承认。
[0134]
本公开内容的实施方案的描述并不预期是穷举的或将本公开内容限制为所公开的精确形式。尽管本公开内容的具体实施方案和实施例在本文中为了说明性目的进行描述，但如相关领域的技术人员将认识到的，各种等价修改在本公开内容的范围内是可能的。例如，虽然方法步骤或功能以给定次序呈现，但替代实施方案可以以不同次序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开内容的教导可以适当地应用于其它程序或方法。可以组合本文描述的各个实施方案，以提供进一步的实施方案。需要时，可以修改本公开内容的各方面，以采用上述参考和申请的组合物、功能和概念，以提供本公开内容的再进一步的实施方案。此外，由于生物学功能等价性的考虑，可以在蛋白质结构中进行一些改变，而不影响在种类或量方面的生物学或化学作用。可以按照详细描述对本公开内容进行这些及其它改变。所有此类修改都预期包括在所附权利要求的范围内。
[0135]
任何前述实施方案的特定元件可以组合或取代其它实施方案中的元件。此外，虽然已在这些实施方案的上下文中描述了与本公开内容的某些实施方案相关的优点，但其它实施方案也可以显示出此类优点，并且并非所有实施方案都必须显示出此类优点才能落入本公开内容的范围内。
[0136]
本文描述的技术通过下述实施例进一步说明，所述实施例决不应被解释为进一步限制性的。应当理解，本发明并不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不预期限制仅由权利要求限定的本发明的范围。
[0137]
ii. 核酸本文提供了用于潜在治疗用途的核酸分子的表征和开发。本公开内容提供了可以用于治疗神经退行性疾病或病症的启动子、表达盒、载体、试剂盒和方法。本公开内容的某些方面涉及将异源核酸递送至受试者，其包括施用重组腺伴随病毒(raav)载体。根据一些方面，本公开内容提供了治疗或预防神经退行性疾病或病症的方法，其包括将包含本文所述的raav载体的组合物递送至受试者，其中所述raav载体包含异源核酸(例如，编码pgrn的核酸)。本公开内容的目的是将编码pgrn的核酸递送至中枢神经系统(cns)，具有在cns中的
成功表达，以及神经退行性疾病的治疗。
[0138]
根据一些实施方案，所表达的pgrn蛋白对于治疗神经退行性疾病或病症是有功能的。在一些实施方案中，所表达的pgrn蛋白并不引起免疫系统反应。
[0139]
pgrn是由grn/grn基因编码的糖蛋白，具有多种细胞功能，包括神经营养、抗炎和溶酶体调控性质。grn基因中的突变可以导致额颞叶变性(ftd) (痴呆的原因)，以及神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl) (溶酶体贮积病)。两种疾病均与pgrn功能丧失相关，在其它特征中，导致增强的小胶质细胞神经炎症和溶酶体功能障碍。pgrn也已牵涉阿尔茨海默氏病(ad)。mendsaikhan等人cells. 2019 8(3): 230。
[0140]
根据一些实施方案，目的基因(例如，pgrn)进行优化，以在表达(和/或功能)方面优于野生型pgrn，并且进一步具有与野生型pgrn区别(在dna/rna水平下)的能力。
[0141]
根据一些实施方案，目的基因(例如，pgrn)进行优化，以抑制与分拣蛋白的结合。先前已显示了，pgrn c末端基序，pgrn(589
–
593) lrqll，对于sort1介导的内吞作用是必需的(zheng等人，plos one. 2011；6(6):e21023)。
[0142]
根据一些实施方案，目的基因(例如，pgrn)进行优化，以生成更少的颗粒蛋白产物。
[0143]“pgrn核酸”指包含pgrn基因或其一部分、或者pgrn基因的功能变体或其一部分的核酸。基因的功能变体包括具有微小变异的基因变体，所述微小变异例如如沉默突变、单核苷酸多态性、错义突变以及并不显著改变基因功能的其它突变或缺失。
[0144]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 5。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 5具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 5组成。
[0145]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1767 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 6。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 6具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 6组成。
[0146]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 7。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 7具有至少
99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 7组成。
[0147]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 8。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 8组成。
[0148]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 9。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 9具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 9组成。
[0149]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 10。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 10具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 10组成。
[0150]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 11。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 11具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 11具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 11具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 11具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 11具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 11具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 8具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 11组成。
[0151]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 12。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 12具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 12组成。
[0152]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸的长度为1779 bp。根据一个实施方案，核酸包含seq id no: 13。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 13具有至少85%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 13具有至少90%同一性。根据一个实施方案，核酸与
seq id no: 13具有至少95%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 13具有至少96%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 13具有至少97%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 13具有至少98%同一性。根据一个实施方案，核酸与seq id no: 13具有至少99%同一性。根据一个实施方案，核酸由seq id no: 13组成。
[0153]
根据一个实施方案，编码pgrn蛋白的核酸具有来自c末端的3-16个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个)氨基酸的缺失。根据一些实施方案，pgrn的c末端中的缺失导致pgrn分拣蛋白结合和后续加工为各个颗粒蛋白的抑制。根据一些实施方案，编码pgrn蛋白的核酸由seq id no: 1组成，所述seq id no: 1具有来自c末端的3-16个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个)氨基酸的缺失。
[0154]
密码子优化编码定点多肽的多核苷酸可以根据本领域标准的方法进行密码子优化，用于在含有目的靶dna的细胞中表达。例如，如果预期的靶核酸在人细胞中，则考虑将编码pgrn的人密码子优化的多核苷酸用于本文所述的构建体中。
[0155]
根据一些实施方案，核酸序列对于哺乳动物表达进行密码子优化。
[0156]
iii. 用于神经退行性疾病的pgrn基因疗法本公开内容总体上提供了用于产生包含pgrn基因构建体的重组腺伴随病毒(aav)病毒颗粒的方法，及其在用于神经退行性疾病，且特别是特征在于部分或完全pgrn缺乏的神经退行性疾病，例如额颞叶痴呆(ftd)的基因治疗方法中的用途。如本文所述的aav载体在将核酸(例如，pgrn基因构建体)递送至cns的细胞，且特别是神经元细胞方面特别有效。本文描述了产生、评估且利用重组腺伴随病毒(raav)治疗载体的方法，所述治疗载体能够将pgrn有效递送到细胞内用于表达和后续分泌。本文描述了用于基于重组腺伴随病毒(raav)的基因疗法中的优化修饰的pgrn cdna和相关遗传元件，所述基因疗法用于神经退行性疾病，包括ftd的治疗和/或预防。
[0157]
重组腺伴随病毒(raav)载体可以有效地容纳pgrn靶基因和相关遗传元件两者。此外，此类载体可以设计为在cns的治疗相关细胞中特异性表达pgrn。本公开内容描述了产生、评估且利用raav治疗载体的方法，所述raav治疗载体能够将功能性pgrn基因有效递送至患者。
[0158]
pgrn基因构建体可以包含：(1)衍生自人、小鼠或猕猴的1.8千碱基(kb)非天然存在的密码子优化的pgrn cdna序列，其可以借助于以下具有对蛋白酶解切割为颗粒蛋白的抗性：(a)取代突变谱或通过3-16个c末端氨基酸缺失(以抑制分拣蛋白结合和后续加工为各个颗粒蛋白)，具有或不具有27个核苷酸的血凝素c末端标签，(2) 0.5 kb非天然存在的神经元特异性人突触素-1启动子(hsyn1)、或0.364 kb小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii (camkii)启动子、或1.034 kb大鼠微管蛋白α1 (ta1)启动子、或1.81 kb大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子、或1.47 kb人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子、或遍在活性的1.7 kb cba启动子、或遍在活性的0.81 kb ef1α启动子、或者根据本文的任何方面或实施方案的任何启动子，其中所述启动子进一步包含另外的0.35 kb 5
’ꢀ
cag/cmv增强子元件，全部进行优化以驱动高pgrn表达，(3) 0.9 kb非天然存在的3'-utr调控区，其包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)，随后为sv40或人生长激素(hgh)多聚腺苷酸化信号，(4)侧接aav基因组盒的两个天然存在的141碱基序列调节的反向末端重复(itr)，和(5)最
samulski)；heilbronnr&wegers，viralvectorsforgenetransfer:currentstatusofgenetherapeutics，于m.sch
ä
fer-korting(编辑)，drugdelivery，handbookofexperimentalpharmacology，197:143-170(2010)(下文heilbronn)；howarthjl等人，usingviralvectorsasgenetransfertools.cellbioltoxicol26:1-10(2010)(下文howarth)。下文描述的生产方法预期作为非限制性实例。
[0165]
aav载体生产可以通过包装质粒的共转染来完成。heilbronn。细胞系供应缺失的aav基因rep和cap以及所需的辅助病毒功能。腺病毒辅助基因va-rna、e2a和e4连同aavrep和cap基因一起转染到两种分开的质粒或单一辅助构建体上。还转染了重组aav载体质粒，其中aav衣壳基因替换为被itr包围(bracketed)的转基因表达盒(包含目的基因，例如pgrn核酸；启动子；和最小调控元件)。这些包装质粒通常转染到293细胞内，所述293细胞是组成型表达剩余所需的ad辅助基因e1a和e1b的人细胞系。这导致携带目的基因的aav载体的扩增和包装。
[0166]
目前已鉴定了aav的多种血清型，包括12种人血清型和来自非人灵长类动物的多于100种血清型。howarth等人cellbioltoxicol26:1-10(2010)。本发明的aav载体可以包含衍生自任何已知血清型的aav的衣壳序列。如本文使用的，“已知血清型”包含可以使用本领域已知方法产生的衣壳突变体。此类方法包括例如病毒衣壳序列的遗传操纵，不同血清型的衣壳区域的暴露表面的结构域交换，以及使用技术如标记物拯救的aav嵌合体生成。参见bowles等人markerrescueofadeno-associatedvirus(aav)capsidmutants:anovelapproachforchimericaavproduction.journalofvirology，77(1):423-432(2003)，以及其中引用的参考文献。此外，本发明的aav载体可以包含衍生自任何已知血清型的aav的itr。优选地，itr衍生自人血清型aav1-aav12之一。根据本发明的一些实施方案，采用假分型方法，其中将一种itr血清型的基因组包装到不同的血清型衣壳内。
[0167]
根据一些实施方案，衣壳序列衍生自人血清型aav1-aav12之一。根据一些实施方案，衣壳序列衍生自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav2.retro及其变体或杂合体(例如，具有hspg突变的aav2变体、(aav2-hbko、aavt-tt、aav44.9)、aav1 9杂合体)。根据一些实施方案，特定衣壳序列赋予增强的神经和脑转导。根据一些实施方案，衣壳序列衍生自对于靶向cns的细胞(例如，神经元细胞、星形胶质细胞)具有高嗜性的aav2变体。根据一些实施方案，aav是aav9。根据一些实施方案，aav是aavrh10。
[0168]
aav嗜性由不同病毒衣壳蛋白与其同源细胞受体之间的特异性相互作用决定。因此，可以选择具有对于待靶向组织适当的衣壳的raav。根据一些实施方案，重组aav载体可以通过以下直接靶向：病毒衣壳序列特别是aav三维结构的环出区域中的遗传操纵，或不同血清型的衣壳区域的暴露表面的结构域交换，或使用技术例如标记物拯救的aav嵌合体生成。参见bowles等人markerrescueofadeno-associatedvirus(aav)capsidmutants:anovelapproachforchimericaavproduction.journalofvirology，77(1):423-432(2003)，以及其中引用的参考文献。
[0169]
choi等人中提供了用于产生、纯化和表征重组aav(raav)载体的一种可能方案。一般地，涉及下述步骤：设计转基因表达盒，设计用于靶向特异性受体的衣壳序列，生成无腺病毒的raav载体，纯化且滴定。这些步骤在下文概括并且在choi等人中详细描述。
[0170]
转基因表达盒可以是单链aav(ssaav)载体或者包装为假双链转基因的“二聚体”或自互补aav(scaav)载体。choi等人；howarth等人。由于单链aavdna成为双链dna的所需转换，使用传统的ssaav载体一般导致基因表达的缓慢开始(从数天到数周，直到达到转基因表达的平台)。相比之下，scaav载体显示在静止细胞的转导后数小时内开始的基因表达，其在数天内达到平台。heilbronn。根据一些实施方案，使用scaav，其中scaav与单链aav相比具有快速的转导起始和增加的稳定性。可替代地，转基因表达盒可以在两种aav载体之间拆分，其允许递送更长的构建体。参见例如，dayas.和berns，k.i.，genetherapyusingadeno-associatedvirusvectors.clinicalmicrobiologyreviews，21(4):583-593(2008)(下文daya等人)。可以通过用限制性核酸内切酶消化适当的质粒(例如，含有pgrn基因的质粒)，以去除rep和cap片段，并且使含有aavwt-itr的质粒主链凝胶纯化，来构建ssaav载体。choi等人。随后，所需的转基因表达盒可以在适当的限制位点之间插入，以构建单链raav载体质粒。可以如choi等人中所述构建scaav载体。
[0171]
然后，可以通过双重cscl梯度分级来纯化raav载体以及合适的aav辅助质粒和pxx6ad辅助质粒的大规模质粒制剂(至少1mg)。choi等人。合适的aav辅助质粒可以选自pxr系列pxr1-pxr5，其分别允许aav2itr基因组交叉包装到aav血清型1至5的衣壳内。可以基于衣壳的目的细胞靶向的效率来选择适当的衣壳。可以采用改变基因组(即转基因表达盒)长度和aav衣壳的已知方法，以改善表达和/或基因转移到特定细胞类型(例如视网膜视锥细胞)。参见例如，yanggs，virus-mediatedtransductionofmurineretinawithadeno-associatedvirus:effectsofviralcapsidandgenomesize.journalofvirology，76(15):7651-7660。
[0172]
接下来，用pxx6辅助质粒、raav载体质粒和aav辅助质粒转染293细胞。choi等人。随后，使分级的细胞裂解物经受raav纯化的多步骤过程，随后为cscl梯度纯化或肝素琼脂糖凝胶柱纯化。raav病毒粒子的产生和定量可以使用斑点印迹测定进行确定。raav在细胞培养物中的体外转导可以用于验证病毒的感染性和表达盒的功能性。
[0173]
除choi等人中描述的方法之外，用于生产aav的各种其它转染方法可以用于本发明的上下文中。例如，瞬时转染方法是可获得的，包括依赖磷酸钙沉淀方案的方法。
[0174]
除用于产生raav载体的实验室规模的方法之外，本发明可以利用本领域已知的用于aav载体的生物反应器规模制造的技术，包括例如heilbronn；clement，n.等人large-scaleadeno-associatedviralvectorproductionusingaherpesvirus-basedsystemenablesmanufacturingforclinicalstudies.humangenetherapy，20:796-606。
[0175]
朝向实现可以产生大量临床级raav载体的可扩展生产系统的所需目标的进展在很大程度上已在生产系统中取得，所述生产系统利用转染作为在细胞中递送raav生产所需的遗传元件的手段。例如，已通过在其中第三质粒包含编码腺病毒辅助蛋白的核酸序列的三质粒转染系统中，用质粒转染代替腺病毒感染来规避污染性腺病毒辅助物的去除(xiao等人，1998)。在双质粒转染系统中的改善还已简化了生产过程，并且增加了raav载体生产效率((grimm等人，1998)。
[0176]
用于改善来自培养的哺乳动物细胞的raav产率的几种策略基于通过遗传改造产生的专门生产细胞的开发。在一种方法中，已通过使用遗传改造的“前病毒”细胞系完成了
在大规模上的raav生产，其中插入的aav基因组可以通过用辅助腺病毒或hsv感染细胞得到“拯救”。前病毒细胞系可以通过简单的腺病毒感染得到拯救，提供了相对于转染方案增加的效率。
[0177]
改善来自细胞的raav产率的第二种基于细胞的方法涉及使用遗传改造的“包装”细胞系，其在其基因组中包含aav rep和cap基因、或rep-cap和itr-目的基因两者(qiao等人，2002)。在前一种方法中，为了产生raav，包装细胞系或者被感染，或者用辅助功能和aav itr-goi元件转染。后一种方法需要感染或转染仅具有辅助功能的细胞。通常，使用包装细胞系的raav产生通过用野生型腺病毒或重组腺病毒感染细胞来启动。因为包装细胞包含rep和cap基因，所以无需外源供应这些元件。
[0178]
来自包装细胞系的raav产率已显示高于通过前病毒细胞系拯救或转染方案获得的产率。
[0179]
已使用重组hsv扩增子系统，使用基于来自单纯疱疹病毒(hsv)的辅助功能递送的方法，取得了改善的raav产率。尽管最初报道了(conway等人，1997)大约150-500个病毒基因组(vg)/细胞的适度水平的raav载体产率，但基于rhsv扩增子的系统的最近改善已提供了基本上更高产率的raav v.g.和感染性颗粒(ip)/细胞(feudner等人，2002)。扩增子系统是固有地复制缺陷的；然而，
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空壳”载体、可复制型(rchsv)或复制缺陷型rhsv的使用仍将免疫原性hsv组分引入raav生产系统内。因此，必须实施用于这些组分的适当测定以及用于其去除的相应纯化方案。
[0180]
除这些方法之外，本文描述了用于在哺乳动物细胞中产生重组aav病毒颗粒的方法，其包括用第一重组疱疹病毒和第二重组疱疹病毒共感染能够悬浮生长的哺乳动物细胞，所述第一重组疱疹病毒包含编码aav rep和aav cap基因的核酸序列，所述基因各自可操作地连接到启动子，所述第二重组疱疹病毒包含pgrn基因以及与所述pgrn基因可操作地连接的启动子，侧翼为aav反向末端重复以促进目的基因的包装，并且允许病毒感染哺乳动物细胞，从而在哺乳动物细胞中产生重组aav病毒颗粒。
[0181]
能够支持疱疹病毒复制的任何类型的哺乳动物细胞都适用于根据如本文所述的本发明的方法。相应地，哺乳动物细胞可以被视为用于复制如本文方法中所述的疱疹病毒的宿主细胞。本发明考虑了用作宿主细胞的任何细胞类型，只要细胞能够支持疱疹病毒的复制。合适的未遗传修饰的哺乳动物细胞的实例包括但不限于细胞系，例如hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。
[0182]
在本发明的各个实施方案中使用的宿主细胞可以衍生自例如哺乳动物细胞，例如人胚肾细胞或灵长类动物细胞。其它细胞类型可能包括但不限于bhk细胞、vero细胞、cho细胞或对于其建立了组织培养技术的任何真核细胞，只要细胞是疱疹病毒允许的。术语“疱疹病毒允许的”意指疱疹病毒或疱疹病毒载体能够在细胞环境内完成整个细胞内病毒生命周期。在某些实施方案中，如所述的方法在悬浮生长的哺乳动物细胞系bhk中发生。宿主细胞可以衍生自现有细胞系例如bhk细胞系，或从头开发。
[0183]
用于产生本文所述的raav基因构建体的方法还包括通过方法在哺乳动物细胞中产生的重组aav病毒颗粒，所述方法包括用第一重组疱疹病毒和(ii)第二重组疱疹病毒共感染能够悬浮生长的哺乳动物细胞，所述第一重组疱疹病毒包含编码aav rep和aav cap基因的核酸，所述基因各自可操作地连接到启动子，所述第二重组疱疹病毒包含pgrn以及与
所述pgrn基因可操作地连接的启动子；并且允许病毒感染哺乳动物细胞，且从而在哺乳动物细胞中产生重组aav病毒颗粒。如本文所述，疱疹病毒是选自以下的病毒：巨细胞病毒(cmv)、单纯疱疹病毒(hsv)和水痘带状疱疹(vzv)和eb病毒(ebv)。重组疱疹病毒是复制缺陷型的。根据一些实施方案，aav cap基因具有选自以下的血清型：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav2.retro及其变体或杂合体(例如，具有hspg突变的aav2变体、(aav2-hbko、aavt-tt、aav44.9)、aav 1 9杂合体)。根据一些实施方案，特定衣壳序列赋予增强的神经和脑转导。根据一些实施方案，aav是aav9。根据一些实施方案，aav是aavrh10。
[0184]
通过引用以其整体并入本文的美国专利申请公开号2007/0202587，描述了raav生产系统所需的元件。通过将基因构建体引入称为生产细胞的细胞内，在体外产生重组aav。用于产生raav的已知系统采用三种基础元件：(1)含有目的基因的基因盒，(2)含有aav rep和cap基因的基因盒，以及(3)“辅助”病毒蛋白的来源。
[0185]
第一基因盒由侧翼为来自aav的反向末端重复(itr)的目的基因进行构建。itr发挥功能以将目的基因直接整合到宿主细胞基因组内，并且对于重组基因组的衣壳化是必须的。hermonat和muzyczka，1984；samulski等人1983。第二基因盒含有rep和cap，编码raav复制和包装所需的蛋白质的aav基因。rep基因编码dna复制所需的四种蛋白质(rep 78、68、52和40)。cap基因编码构成病毒衣壳的三种结构蛋白(vp1、vp2和vp3)。muzyczka和berns，2001。
[0186]
需要第三元件是因为aav并不自行复制。辅助功能是来自辅助dna病毒的蛋白质产物，所述辅助dna病毒产生有助于raav的有效复制和包装的细胞环境。传统上，腺病毒(ad)已用于为raav提供辅助功能，但疱疹病毒也可以提供这些功能，如本文讨论的。
[0187]
使用合适的生产细胞系例如悬浮生长的bhk细胞，在体外进行用于基因疗法的raav载体的生产。适用于本发明的其它细胞系包括hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。
[0188]
任何细胞类型都可以用作宿主细胞，只要细胞能够支持疱疹病毒的复制。本领域技术人员将熟悉可以用于从宿主细胞生产疱疹病毒的广泛范围的宿主细胞。例如，合适的未遗传修饰的哺乳动物宿主细胞的实例可以包括但不限于细胞系，例如hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。
[0189]
宿主细胞可以适于在悬浮培养中生长。宿主细胞可以是幼仓鼠肾(bhk)细胞。悬浮生长的bhk细胞系衍生自贴壁bhk细胞系的适应。两种细胞系均是商购可得的。
[0190]
用于递送raav生产的所有所需元件的一种策略利用两种质粒和辅助病毒。这种方法依赖用含有编码必需基因产物的基因盒的质粒转染生产细胞，以及用提供辅助功能的ad感染细胞。该系统采用具有两种不同基因盒的质粒。第一种是编码待包装为raav的重组dna的前病毒质粒。第二种是编码rep和cap基因的质粒。为了将这些不同的元件引入细胞内，细胞用ad进行感染以及用两种质粒进行转染。由ad提供的基因产物由基因e1a、e1b、e2a、e4orf6和va编码。samulski等人1998: hauswirth等人2000；muzyczka和burns，2001。可替代地，在最近的方案中，ad感染步骤可以替换为用含有va、e2a和e4基因的腺病毒“辅助质粒”转染。xiao等人1998；matsushita等人，1998。
[0191]
虽然ad已照常规用作raav生产的辅助病毒，但还可以使用其它dna病毒，例如单纯
疱疹病毒1型(hsv-1)。已鉴定了aav2复制和包装所需的最小hsv-1基因集合，并且包括早期基因ul5、ul8、ul52和ul29。muzyczka和burns，2001。这些基因编码hsv-1核心复制机制的组分，即解旋酶、引物酶、引物酶辅助蛋白和单链dna结合蛋白。knipe，1989；weller，1991。hsv-1的这种raav辅助性质已用于重组疱疹病毒载体的设计和构建中，所述重组疱疹病毒载体能够提供raav生产所需的辅助病毒基因产物。conway等人，1999。
[0192]
使用合适的生产细胞系例如悬浮生长的bhk细胞，在体外进行用于基因疗法的raav载体的生产。适用于本发明的其它细胞系包括hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。
[0193]
任何细胞类型都可以用作宿主细胞，只要细胞能够支持疱疹病毒的复制。本领域技术人员将熟悉可以用于从宿主细胞生产疱疹病毒的广泛范围的宿主细胞。例如，合适的未遗传修饰的哺乳动物宿主细胞的实例可以包括但不限于细胞系，例如hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。
[0194]
宿主细胞可以适于在悬浮培养中生长。在本发明的某些实施方案中，宿主细胞是幼仓鼠肾(bhk)细胞。悬浮生长的bhk细胞系衍生自贴壁bhk细胞系的适应。两种细胞系均是商购可得的。
[0195]
基于rhsv的raav制造工艺本文描述了用于在悬浮生长的细胞中产生重组aav病毒颗粒的方法。来自连续建立的细胞系的悬浮或非锚定依赖性培养物是细胞和细胞产物的大规模生产的最广泛使用的手段。基于发酵技术的大规模悬浮培养具有用于制造哺乳动物细胞产物的明确优点。均质条件可以在生物反应器中提供，所述生物反应器允许温度、溶解氧和ph的精确监测和控制，并且确保可以获取代表性的培养样品。所使用的rhsv载体很容易在组织培养瓶和生物反应器两者中的允许细胞系上繁殖至高滴度，并且提供了顺应按比例扩大用于临床和市场生产所必需的病毒生产水平的生产方案。
[0196]
搅拌罐生物反应器中的细胞培养提供了非常高的体积比培养表面积，并且已用于病毒疫苗的生产(griffiths，1986)。此外，搅拌罐生物反应器已在工业上证明为可扩展的。一个实例是多板cell cube细胞培养系统。尤其是在基因疗法的背景下，生产感染性病毒载体的能力对制药工业越来越重要。
[0197]
根据本文所述的方法使细胞生长可以在生物反应器中完成，所述生物反应器允许大规模生产能够被本发明的疱疹载体感染的完全生物活性细胞。生物反应器已广泛用于从悬浮和锚定依赖性动物细胞培养物两者生产生物产物。大多数大规模悬浮培养都作为分批或补料分批工艺进行操作，因为它们最容易操作且按比例扩大。然而，基于恒化器或灌注原理的连续工艺是可用的。生物反应器系统可以设置为包括允许培养基更换的系统。例如，可以将过滤器掺入生物反应器系统内，以允许细胞与消耗的培养基分开，以促进培养基更换。根据用于生产疱疹病毒的本文方法的一些实施方案，在细胞生长的某一天时开始进行培养基更换和灌注。例如，培养基更换和灌注可以在细胞生长的第3天时开始。过滤器可以在生物反应器的外部，或在生物反应器的内部。
[0198]
用于产生重组aav病毒颗粒的方法可以包括：用第一重组疱疹病毒和第二重组疱疹病毒共感染悬浮细胞，所述第一重组疱疹病毒包含编码aav rep和aav cap基因的核酸，所述基因各自可操作地连接到启动子，所述第二重组疱疹病毒包含pgrn基因构建体以及与
所述目的基因可操作地连接的启动子；并且允许细胞产生重组aav病毒颗粒，从而产生重组aav病毒颗粒。细胞可以是hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。根据一些实施方案，cap基因可以选自具有选自以下的血清型的aav：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav2.retro及其变体或杂合体(例如，具有hspg突变的aav2变体、(aav2-hbko、aavt-tt、aav44.9)、aav 1 9杂合体)。根据一些实施方案，特定衣壳序列赋予增强的神经和脑转导。根据一些实施方案，aav是aav9。根据一些实施方案，aav是aavrh10。细胞可以以3至14的组合感染复数(moi)进行感染。第一疱疹病毒和第二疱疹病毒可以是选自以下的病毒：巨细胞病毒(cmv)、单纯疱疹病毒(hsv)和水痘带状疱疹(vzv)和eb病毒(ebv)。疱疹病毒可能是复制缺陷型的。共感染可能是同时的。
[0199]
根据一些实施方案，重组aav病毒颗粒进一步包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。
[0200]
用于在哺乳动物细胞中产生重组aav病毒颗粒的方法可以包括用第一重组疱疹病毒和第二重组疱疹病毒共感染悬浮细胞，所述第一重组疱疹病毒包含编码aav rep和aav cap基因的核酸，所述基因各自可操作地连接到启动子，所述第二重组疱疹病毒包含pgrn基因构建体以及与所述pgrn基因构建体可操作地连接的启动子；并且允许细胞繁殖，从而产生重组aav病毒颗粒，由此所产生的病毒颗粒数目等于或大于在贴壁条件下在相同数目的细胞中生长的病毒颗粒数目。细胞可以是hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。cap基因可以选自具有选自以下的血清型的aav：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav2.retro及其变体或杂合体(例如，具有hspg突变的aav2变体、(aav2-hbko、aavt-tt、aav44.9)、aav 1 9杂合体)。根据一些实施方案，aav是aavrh10。根据一些实施方案，aav是aav9。根据一些实施方案，特定衣壳序列赋予增强的神经和脑转导。细胞可以以3至14的组合感染复数(moi)进行感染。第一疱疹病毒和第二疱疹病毒可以是选自以下的病毒：巨细胞病毒(cmv)、单纯疱疹病毒(hsv)和水痘带状疱疹(vzv)和eb病毒(ebv)。疱疹病毒可能是复制缺陷型的。共感染可能是同时的。
[0201]
一种用于将编码治疗性蛋白质的核酸序列递送至悬浮细胞的方法，该方法包括：用第一重组疱疹病毒和第二疱疹病毒共感染bhk细胞，所述第一重组疱疹病毒包含编码aav rep和aav cap基因的核酸，所述基因各自可操作地连接到启动子，所述第二疱疹病毒包含pgrn基因构建体以及与所述pgrn基因可操作地连接的启动子，其中所述目的基因包含治疗性蛋白质编码序列；并且其中所述细胞以3至14的组合感染复数(moi)进行感染；并且允许病毒感染细胞并表达治疗性蛋白质，从而将编码治疗性蛋白质的核酸序列递送至细胞。细胞可以是hek-293 (293)、vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。参见例如，美国专利号9,783,826。
[0202]
v. 治疗方法aav和基因治疗基因治疗指通过替换、改变或补充负责疾病的基因来治疗遗传性或获得性疾病。它一般借助于媒介物或载体，通过将一种或多种校正基因引入宿主细胞内来实现。使用raav的基因治疗对于许多疾病的治疗具有很大的希望。本文描述了产生重组腺伴随病毒
(raav)，且特别是产生大量重组aav以支持神经退行性疾病的治疗的方法。
[0203]
迄今为止，全世界已进行了多于500项基因治疗临床试验。使用raav作为基因治疗的媒介物的努力对于其作为用于人疾病的治疗的适用性提供了希望。使用重组aav (raav)用于所引入的基因在动物中的细胞内的递送和长期表达，已经在临床前取得了一些成功，所述细胞包括临床上重要的脑、肝、骨骼肌和肺的非分裂细胞。在一些组织中，aav载体已显示整合到靶细胞的基因组内。hirata等人，2000，j. of virology 74:4612-4620。
[0204]
raav的另外优点在于其在非分裂细胞类型包括肝细胞、神经元和骨骼肌细胞中执行这一功能的能力。raav已成功地用作基因治疗媒介物，以致使促红细胞生成素在小鼠的骨骼肌中的表达(kessler等人，1996)、酪氨酸羟化酶和芳香族氨基酸脱羧酶在帕金森病的猴模型中的cns中的表达(kaplitt等人，1994)、以及因子ix在血友病的动物模型中的骨骼肌和肝中的表达。在临床水平上，raav载体已用于人临床试验中，以将cftr基因递送至囊性纤维化患者，并且将因子ix基因递送至血友病患者(flotte等人，1998；wagner等人，1998)。进一步地，aav是辅助依赖性dna细小病毒，其与人或哺乳动物中的疾病无关(berns和bohensky，1987，advances in virus research，academic press inc，32:243-307)。相应地，aav载体最重要的属性之一是其在i期临床试验中的安全性概况。
[0205]
aav基因治疗已在许多不同的病理背景下进行并治疗各种疾病和病症。例如，在一项i期研究中，aav2-fix载体施用到8个b型血友病受试者的骨骼肌内证明是安全的，并且实现了在载体注射后至少10个月的局部基因转移和因子ix表达(jiang等人，mol ther. 14 (3):452-5 2006)，先前已描述了向aat缺陷成人肌内注射重组腺伴随病毒α1-抗胰蛋白酶(raav2-cb-haat)基因载体的i期试验(flotte等人，hum gene ther. 2004 15(1):93-128)，并且在另一项临床试验中，丘脑底核的aa v-gad基因治疗已显示是安全的，并且由晚期帕金森氏病患者良好耐受(kaplitt等人lancet. 200723；369(9579):2097-105)。
[0206]
颗粒蛋白前体和神经退行性疾病本文提供了可以用于治疗受试者中的神经退行性疾病的方法。根据一些实施方案，神经退行性疾病由受试者中的可遗传突变介导。根据一些实施方案，神经退行性疾病由对受试者的环境危害介导。如本文使用的，由对患者的环境危害介导的神经退行性疾病意指这样的疾病，其由环境危害引起，而不是由修饰颗粒蛋白前体表达的颗粒蛋白前体基因的可遗传突变引起。可遗传突变是患者的dna中的永久性突变，其可能传递给患者的后代。本文所述的一种或多种核酸递送至cns细胞，且特别是神经元细胞，可以用于治疗神经退行性疾病。
[0207]
根据一些实施方案，本文提供了采用基于pgrn aav的基因疗法用于治疗颗粒蛋白前体相关的神经退行性疾病的方法，所述神经退行性疾病包括但不限于家族性额颞叶痴呆(ftd)、额颞叶变性(ftld)、神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl)包括神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)和巴藤病、以及阿尔茨海默氏病(ad)。根据一些实施方案，本文提供了采用基于pgrn aav的基因疗法用于预防颗粒蛋白前体相关的神经退行性病症的方法，所述神经退行性病症包括但不限于家族性额颞叶痴呆(ftd)、额颞叶变性(ftld)、神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl)包括神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)和巴藤病、以及阿尔茨海默氏病(ad)。
[0208]
本文所述的方法允许在哺乳动物细胞中产生重组aav病毒颗粒，其包括用第一重组疱疹病毒和第二重组疱疹病毒共感染能够悬浮生长的哺乳动物细胞，所述重组疱疹病毒
包含在颗粒蛋白前体相关的神经退行性病症的治疗中具有治疗价值的颗粒蛋白前体基因构建体，所述神经退行性病症包括但不限于家族性额颞叶痴呆(ftd)和神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)。
[0209]
本文所述的基因治疗构建体可以用于治疗和/或预防颗粒蛋白前体相关的神经退行性病症的方法和组合物中。颗粒蛋白前体相关的神经退行性病症包括但不限于家族性额颞叶痴呆(ftd)的20%发病率和神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)的所有病例。神经退行性病症包括但不限于家族性额颞叶痴呆(ftd)、额颞叶变性(ftld)、神经元蜡样脂褐质沉积症(ncl)包括神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)和巴藤病、以及阿尔茨海默氏病(ad)。
[0210]
颗粒蛋白前体，分泌性糖蛋白，在人中由单个grn基因编码。颗粒蛋白前体(pgrn)占优势地由脑中的小胶质细胞表达。颗粒蛋白前体(pgrn)是分泌的593个氨基酸的多功能蛋白，其是高度保守的且在范围从真核生物到人的广泛范围的物种中发现。pgrn广泛分布于cns各处，在所述cns中，它主要在神经元和小胶质细胞中发现，但也已在星形胶质细胞和少突胶质细胞中以低得多的水平检测到。颗粒蛋白前体由12个半胱氨酸颗粒蛋白基序的七个半串联重复的不相同拷贝组成。许多细胞过程和疾病与这种独特的多效性因子有关，其包括但不限于胚胎发生、肿瘤发生、炎症、伤口修复、神经变性和溶酶体功能。由grn基因内的常染色体显性突变引起的单倍体不足导致额颞叶变性，在患者中呈现为额颞叶痴呆的进行性神经元萎缩。额颞叶痴呆是与阿尔茨海默氏病不同的早发形式的痴呆。grn有关形式的额颞叶痴呆是特征在于含有泛素化和碎片化tdp-43 (由tardbp编码)的神经元包涵体的出现的蛋白病。chitramuthu等人brain 2017 140(12): 3081-3104；su
á
rez-calvet等人embo molecular medicine 2018 e9712。
[0211]
本文所述的颗粒蛋白前体(pgrn) aav构建体提供了用于治疗pgrn相关的神经退行性病症的基因治疗媒介物，所述神经退行性病症包括家族性额颞叶痴呆(ftd)的所有发病率中的20%和神经元蜡样脂褐质沉积症11 (cln11)的所有病例。本文所述的pgrn aav基因治疗构建体和使用方法提供了用于pgrn相关的神经退行性病症的疗法，长期未满足的需要，因为不存在可用于患有pgrn相关的神经退行性病症的患者的基于基因疗法的治疗。
[0212]
根据一些实施方案，pgrn aav基因疗法在受试者已发展神经退行性疾病前进行施用。根据一些实施方案，受试者通过鉴定pgrn突变的分子遗传学测试被诊断有神经退行性疾病。根据一些实施方案，受试者具有患有神经退行性疾病的家庭成员。
[0213]
本文所述的raav构建体以比常规aav载体更高的效率转导cns细胞，且特别是神经元细胞。根据一些实施方案，本文所述的组合物和方法致使核酸高度有效递送至cns细胞，且特别是神经元细胞。根据一些实施方案，本文所述的组合物和方法致使转基因在至少50% (例如，至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)的内毛细胞中的递送和表达，或者在至少50% (例如，至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99)的神经元细胞中的递送和表达。根据一些实施方案，本文所述的组合物和方法致使转基因在至少70% (例如，至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)的内毛细胞中的递送和表达，或者在至少70% (例如，至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99)的神经元细胞中的递送和表达。根据一些实施方案，本文所述的组合物和方法致使转基因在至少80% (例如，至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)的内毛细胞中的递送和表达，或者在至少80% (例如，至少80、85、90、91、92、93、94、95、
96、97、98或99)的神经元细胞中的递送和表达。
[0214]
根据一些实施方案，在所得到的重组细胞的体内施用之前，将本文所述的核酸序列直接引入细胞内，核酸序列在所述细胞中表达以产生编码的产物。这可以通过本领域已知的众多方法中的任一种，例如通过此类方法如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染来实现。
[0215]
vi.药物组合物根据一些方面，本公开内容提供了药物组合物，其包含任选地在药学上可接受的赋形剂中的本文所述的任何载体。
[0216]
如本领域众所周知的，药学上可接受的赋形剂是相对惰性的物质，其促进药理学有效物质的施用，并且可以作为液体溶液或悬浮液、作为乳状液、或者作为适合于在使用之前溶解或悬浮于液体中的固体形式供应。例如，赋形剂可以给予形式或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透压的盐、封装剂、ph缓冲物质和缓冲剂。此类赋形剂包括适合于直接递送至耳(例如内耳或中耳)的任何药物试剂，其可以进行施用而无过度毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇，各种tween化合物中的任一种，以及液体例如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐可以包括在其中，例如矿物酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸的盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。药学上可接受的赋形剂的详尽讨论在remington's pharmaceutical sciences (mack pub. co.，n.j. 1991)中可获得。
[0217]
根据一些实施方案，特别是当存在高raav浓度时，raav组合物配制为减少组合物中的aav颗粒聚集。用于减少raav聚集的方法是本领域众所周知的，并且包括例如添加表面活性剂、ph调整、盐浓度调整等。(参见例如，wright fr等人，molecular therapy (2005) 12，171-178，其内容通过引用并入本文。)根据一些实施方案，药物组合物包含bsst、pbs或bss中的一种或多种。
[0218]
根据一些实施方案，药物组合物进一步包含组氨酸缓冲液。
[0219]
尽管不是必需的，但组合物可以任选地以适合于施用精确量的单位剂型供应。
[0220]
vii. 施用方法一般地，本文所述的组合物配制用于施用于cns。根据一些实施方案，组合物配制用于施用于神经元细胞。
[0221]
根据一些实施方案，施用是大脑内的(例如，至大池(icm))、鞘内的(it) (伴随或不伴随导管)、静脉内的(iv)、或iv和it的组合。
[0222]
如本文使用的，术语“鞘内施用”指将药剂例如包含raav的组合物施用到椎管内。例如，鞘内施用可以包括在椎管的颈部区域、椎管的胸部区域、或椎管的腰部区域中的注射。通常，鞘内施用通过将药剂例如包含raav的组合物注射到椎管的蛛网膜下腔(蛛网膜下隙)内来执行，所述蛛网膜下腔是蛛网膜和椎管的软脑膜之间的区域。蛛网膜下腔由海绵组织占据，所述海绵组织由小梁(从蛛网膜延伸并共混到软脑膜内的精细结缔组织细丝)和其中含有脑脊液的相互连通的通道组成。根据一些实施方案，鞘内施用并非施用到脊柱脉管系统内。
[0223]
如本文使用的，术语“大脑内施用”指将药剂施用到脑内和/或脑周围。大脑内施用包括但不限于将药剂施用到大脑、髓质、脑桥、小脑、颅内腔和脑周围的脑膜内。大脑内施用
可以包括施用到脑的硬脑膜、蛛网膜和软脑膜内。在一些实施方案中，大脑内施用可以包括将药剂施用到小脑延髓(cm)池内。在一些实施方案中，大脑内施用可以包括将药剂施用到围绕脑的蛛网膜下隙的脑脊液(csf)内。在一些实施方案中，大脑内施用可以包括将药剂施用到脑室，例如右侧脑室、左侧脑室、第三脑室、第四脑室内。根据一些实施方案，大脑内施用并非施用到脑脉管系统内。
[0224]
大脑内施用可以涉及直接注射到脑内和/或脑周围。根据一些实施方案，大脑内施用涉及使用立体定向程序的注射。立体定向程序是本领域众所周知的，并且通常涉及使用计算机和3维扫描装置，其一起用于将注射引导至特定的大脑内区域，例如室区域。也可以使用微型注射泵(例如，来自world precision instruments)。根据一些实施方案，显微注射泵用于递送包含raav的组合物。
[0225]
根据一些实施方案，组合物的输注速率为1 ml/分钟或更慢。根据一些实施方案，组合物的输注速率为约10μl/分钟至1000 μl/分钟。如技术人员将了解的，输注速率将取决于各种因素，包括例如受试者的物种、受试者的年龄、受试者的重量/大小、aav的血清型、所需的剂量、靶向的大脑内区域等。因此，其它输注速率在某些情况下可以由技术人员视为适当的。
[0226]
根据一些实施方案，包含如本文所述的raav的组合物使用渗透泵或输液泵进行施用。渗透泵和输液泵两者均从各种供应商商购可得，所述供应商例如alzet corporation，hamilton corporation，alza，inc.，palo alto，calif.)。
[0227]
通过如本文所述安全且有效地转导cns细胞，本发明的方法可以用于治疗个体，例如人，其中所述转导的细胞产生足以治疗或预防神经退行性疾病的量的pgrn。
[0228]
根据本发明的治疗方法，可以基于接受治疗的受试者的特性，例如受试者的年龄和载体将递送至其的区域的体积，来确定所递送的载体的体积。根据一些实施方案，注射的组合物的体积为约10
ꢀµ
l至约1000
ꢀµ
l、或约100
ꢀµ
l至约1000
ꢀµ
l、或约100
ꢀµ
l至约500
ꢀµ
l、或约500
ꢀµ
l至约1000
ꢀµ
l。根据一些实施方案，注射的组合物的体积多于约1
ꢀµ
l、2
ꢀµ
l、3
ꢀµ
l、4
ꢀµ
l、5
ꢀµ
l、6
ꢀµ
l、7
ꢀµ
l、8
ꢀµ
l、9
ꢀµ
l、10
ꢀµ
l、15
ꢀµ
l、20
ꢀµ
l、25
ꢀµ
l、50
ꢀµ
l、75
ꢀµ
l、100
ꢀµ
l、200
ꢀµ
l、300
ꢀµ
l、400
ꢀµ
l、500
ꢀµ
l、600
ꢀµ
l、700
ꢀµ
l、800
ꢀµ
l、900
ꢀµ
l或1 ml中的任何一个或两者之间的任何量。
[0229]
根据本公开内容的治疗方法，所施用的载体的浓度可以取决于生产方法而不同，并且可以基于确定为对于特定施用途径治疗上有效的浓度进行选择或优化。根据一些实施方案，以载体基因组/毫升(vg/ml)的浓度选自约10
8 vg/ml、约10
9 vg/ml、约10
10 vg/ml、约10
11 vg/ml、约10
12 vg/ml、约10
13 vg/ml和约10
14 vg/ml。在优选的实施方案中，浓度在约0.1 ml、约0.2 ml、约0.4 ml、约0.6 ml、约0.8 ml和约1.0 ml的体积中，在10
11 vg/ml
ꢀ‑ꢀ
10
14 vg/ml的范围内。
[0230]
本文所述的组合物的有效性可以通过几个标准来监测。
[0231]
根据一些实施方案，组合物的有效性通过监测用pgrn raav治疗的受试者中的改善来确定。根据一些实施方案，本文所述的组合物的有效性可以在体内小鼠模型中进行监测。例如，在pgrn-/-ko小鼠模型中，血液、csf和脑组织中的pgrn蛋白水平增加；血液和csf中的神经丝-1 (nfl-1)水平降低；来自脑组织的脂褐质和细胞内tdp43水平降低可以是组合物的有效性的指标。根据一些实施方案，本文所述的组合物的有效性可以在人疾病受试
者中进行监测。例如，血液和csf中的pgrn蛋白水平增加、血液和csf中的nfl-1水平降低、以及行为和认知改善可以用作组合物的有效性的指标。
[0232]
现在将参考下述实施例描述本发明的进一步实施方案。提供本文包含的实施例用于说明而决不是限制。
实施例
[0233]
实施例1. 方法本发明使用(但不限于)下述方法执行。如本文所述的方法在于2007年8月8日提交的名称为recombinant aav production in mammalian cells的pct申请号pct/us2007/017645中进行阐述，所述pct申请要求于2007年8月14日提交的名称为recombinant aav production in mammalian cells的美国申请号11/503,775的利益，所述美国申请是于2002年9月23日提交的名称为high titer recombinant aav production的美国申请序列号10/252,182，于2006年8月15日颁发的目前的美国专利号7,091,029的部分继续申请。所有上述申请的内容在此通过引用以其整体并入。
[0234]
rhsv共感染方法用于重组腺伴随病毒(raav)生产的rhsv共感染方法采用两种icp27缺陷型重组单纯疱疹病毒1型(rhsv-1)载体，一种携带aav rep和cap基因(rhsv-rep2capx，其中“capx
””
指任何aav血清型)，而第二种携带侧翼为aav反向末端重复(itr)的目的基因(goi)盒。尽管该系统用aav血清型2 rep、cap和itr以及人源化的绿色荧光蛋白基因(gfp)作为转基因进行开发，但该系统可以用于不同的转基因和血清型/假型元件。
[0235]
哺乳动物细胞用rhsv载体进行感染，所述rhsv载体提供所有顺式和反式作用的raav组分、以及用于生产性raav感染的必要辅助功能。细胞用rhsv-rep2capx和rhsv-goi的混合物进行感染。将细胞收获并裂解以释放raav-goi，并且通过下述各种方法来滴定所得到的载体原液。
[0236]
doc裂解在收获时，细胞和培养基通过离心进行分离。将培养基放在一边，同时使用2至3个冻融循环，用含有0.5% (w/v)脱氧胆酸盐(doc)的裂解缓冲液(20 mm tris-hcl，ph 8.0，150 mm nacl)提取细胞团块，所述裂解缓冲液提取细胞相关的raav。在一些情况下，培养基和细胞相关的raav裂解物是重组的。
[0237]
原位裂解用于收获raav的替代方法是原位裂解。在收获时，将mgcl2加入至1 mm的最终浓度，将10% (v/v) triton x-100加入至1% (v/v)的最终浓度，并且将benzonase加入至50单位/ml的最终浓度。将该混合物在37
°
c振荡或搅拌2小时。
[0238]
确定drp产率的定量实时pcrdna酶抗性颗粒(drp)测定采用序列特异性寡核苷酸引物和双重标记的杂交探针，使用实时定量聚合酶链反应(qpcr)技术用于检测和定量扩增的dna序列。靶序列在荧光探针的存在下进行扩增，所述荧光探针与dna杂交并发出依赖于拷贝的荧光。drp滴度(drp/ml)通过直接比较测试物品的相对荧光单位(rfu)与由携带相同dna序列的已知质粒稀释物生成的荧光信号进行计算。由该测定生成的数据反映了包装的病毒dna序列的数量，而不指
示序列完整性或颗粒感染性。
[0239]
确定感染性颗粒产率的绿色细胞感染性测定(仅raa v-gfp)使用绿色细胞测定对raa v-gfp的原液执行感染性颗粒(ip)滴定。c12细胞(表达aav2 rep和cap基因的hela衍生系
ꢀ–ꢀ
参见下文参考文献)用连续稀释的raa v-gfp加上饱和浓度的腺病毒(以提供用于aav复制的辅助功能)进行感染。在两到三天温育后，计数发荧光的绿色细胞(每个细胞代表一个感染事件)数目，并且用于计算病毒样品的ip/ml滴度。
[0240]
clark kr等人在hum. gene ther. 1995. 6:1329-1341和gene ther. 1996. 3:1124-1132中描述了重组腺病毒生产，所述两个参考文献均通过引用以其整体并入本文。
[0241]
确定raa v感染性的tcid
50
使用以50%组织培养感染剂量(tcid
50
)的测定来确定包含目的基因的raav颗粒(raav-goi)的感染性。8个raav重复在人腺病毒5型的存在下进行连续稀释，并且用于感染96孔板中的helarc32细胞(表达aav2 rep和cap的hela衍生细胞系，购自atcc)。在感染后三天，将裂解缓冲液(最终浓度为1 mm tris-hc1 ph 8.0、1 mm edta、0.25% (w/v)脱氧胆酸盐、0.45% (v/v) tween-20、0.1% (w/v)十二烷基硫酸钠、0.3 mg/ml蛋白酶k)加入每个孔中，然后在37
°
c下温育1小时，在55
°
c下温育2小时，且在95
°
c下温育30分钟。在上述drp qpcr测定中测定来自每个孔的裂解物(2.5 μl等分试样)。ct值低于标准曲线的最低数量质粒的值的孔评分为阳性。tcid
50
感染性/ml (tcid
50
/ml)基于karber方程使用以10倍连续稀释的阳性孔的比率进行计算。
[0242]
细胞系和病毒使用合适的生产细胞系例如hek293细胞(293)，在体外进行用于基因疗法的raav载体的生产。适用于本发明的其它细胞系包括vero、rd、bhk-21、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5。
[0243]
除非另有说明，否则将哺乳动物细胞系维持在含有2
ꢀ‑ꢀ
10% (v/v)胎牛血清(fbs，hyclone)的达尔贝科改良伊格尔培养基(dmem，hyclone)中。细胞培养和病毒繁殖在37
°
c、5% co2下执行指示的间隔。
[0244]
感染细胞密度细胞可以生长到各种浓度，包括但不限于至少约、至多约或约1 x 106至4 x 106个细胞/ml。然后可以以预定的moi用重组疱疹病毒感染细胞。
[0245]
实施例2. pgrn表达构建体的克隆用于神经退行性病症的成功aav-颗粒蛋白前体疗法关键地依赖于载体组分。优化载体将提供有效靶向脑的有效衣壳，适度但细胞特异性的启动子和表达人颗粒蛋白前体蛋白的稳定转基因。
[0246]
所有构建体都是下述的变体迭代：ptr*-cba*/hsyn1*-h/m(wt/co1,2,3,4,5,6,7)(ss*)pgrn(无/ha/sbi)-wpre-(sv/hgh)pa*(潜在地)优化和/或序列调节的元件图1显示了pgrn构建体的示意图，其包含在每个端部处的反向末端重复(itr)、人突触素1 (hsyn1)或鸡β肌动蛋白(cba)启动子、任选地包含c末端ha标签或c末端中的3-16个核酸的缺失的pgrn、土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件(wpre)、sv40早期多聚腺苷酸
4aav2反向末端重复(itr)3’至5’5野生型人颗粒蛋白前体(hpgrnwt)6野生型小鼠颗粒蛋白前体(mpgrnwt)7猕猴(恒河猴)颗粒蛋白前体8hpgrncoa9hpgrncob10hpgrncoc11hpgrncod12hpgrncoe13hpgrncof14hpgrn分拣蛋白结合缺陷型变体15血凝素(ha)标签16wpre17sv40pa18钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkii)启动子19大鼠微管蛋白α1(ta1)启动子20大鼠神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子21人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子pdgfb_122ef1α启动子23cag/cmv增强子24人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子pdgfb_225人血小板衍生生长因子-β链(pdgf)启动子pdgfb_3启动子载体设计和合成：完成了关于强遍在启动子(cba)相对于神经元特异性启动子(人突触素)的体外比较的研究，以比较其特异性和获得的转基因表达水平。cba启动子在paav质粒(ptr-cba-pgrnwt-wpre-pa)中获得。使用nebuilder
®ꢀ
hifi dna assembly试剂盒(new england biolabs)，将pgrnwt的序列替换为含有hgfp和多克隆位点的序列，以生成质粒ptr-cba-hgfp-wpre-pa。人突触素启动子序列是商业合成的(genscript)，随后为内部pcr扩增和提取，导致具有相容的限制位点区段的启动子区段，用于插入独特的病毒包装载体内，所述病毒包装载体含有氨苄青霉素选择盒、aav itr区段、hgfp报道基因、wpre和sv40多聚a (ptr-hsyn-hgfp-wpre-pa)。
[0264]
将构建体转化到高效率大肠杆菌细胞(sure2)内用于扩增，并且选择克隆用于验证。执行桑格测序(genewiz)和限制性消化(具有适当的限制位点(smai和xmai)以检查启动子插入和itr完整性)，以验证启动子质粒。选择关于每种构建体的阳性克隆用于后续实验。经由hek-293 (对照)或shsy-5y细胞的体外转染，测试了独特的启动子构建体在驱动hgfp表达方面的功效。体外数据指示了，cba和人突触素启动子在两种测试细胞中均起作用，其中cba在两种细胞中总是强于突触素启动子。
[0265]
衣壳选择多种免疫组织学分析指示了aav9和aavrh10均具有有利于治疗的广泛的神经元嗜
性。基于比较中枢神经系统中的aav9和aavrh10表达和功效的研究，选择aavrh10而不是aav9。发现aavrh10比aav9显著更好地转导。另外，aav9和rh10在人群体中具有相似的低中和ab血清阳性率(分别为18%和21%，thwaite r等人，2014)。
[0266]
一组实验通过鞘内给药检查了非人灵长类动物(nhp)中的衣壳选择。对于脊髓和脑中的gfp表达，测试了包含aavrh10、aav9、δhsmax和aav2tyf衣壳的gfp构建体。图25概括了在鞘内注射后，关于在脑的各个区域中的gfp阳性细胞百分比和gfp强度，关于测试的衣壳各自的结果。根据这项研究，aavrh10显示了最多的gfp表达，随后为aav9。所有载体都是良好耐受的。
[0267]
接下来，通过给药到大池(icm)内来进行nhp中的aavrh10生物分布。发现1.2e13 vg的aavrh10在icm给药之后显示了从额叶到背侧nhp脑的极佳生物分布。评分显示于图26中。
[0268]
实施例3. 启动子选择进行实验以测试用于颗粒蛋白前体载体中的启动子。采用的启动子是：hsyn启动子(也称为synp1，神经元特异性的)和嵌合cmv-鸡
ß‑
肌动蛋白启动子(cba)启动子(遍在的)。在体外执行了第一组实验。如图27中所示，cba启动子在人胚肾293细胞(hek293)和sh-sy5y细胞两者中均驱动比synp1更强的表达(使用2种不同的转染试剂确认)。sh-sy5y是衍生自sk-n-sh神经母细胞瘤细胞系的细胞系，其频繁用作神经退行性病症的模型。图28显示了伴随和不伴随ad5载体，在hek293和shsy-5y细胞中的raavrh10-cba-hgfp转导后的gfp表达。如图28中所示，在伴随和不伴随ad5，用aavrh10-cba构建体转导的sh-sy5y细胞中，没有检测到gfp。图27中所示的结果证实了hek和sh-sy5y细胞两者均可以用于展示由cba或hsyn启动子驱动的wpre增强的表达。然而，在这两种细胞类型中，hsyn驱动的表达水平远低于cba驱动的表达。图28中所示的结果证实了aav血清型(aav2tyf或aavrh10)可以用于展示载体在hek细胞中的转导(并通过ad5进一步增强)，但仅aav2tyf可以用于展示sh-sy5y细胞中的转导(与ad5添加无关)。
[0269]
这些结果指示了，对于aavrh10载体在细胞测定中的后续测试，可以使用hek293细胞，或者如果将使用神经元/神经元样细胞模型，则可能需要使用除sh-sy5y外的细胞类型，或可能需要进一步优化sh-sy5y细胞中的条件。
[0270]
总之，来自启动子选择工作的结果导致synp1启动子的选择，因为它的细胞特异性是限制过表达和因此可能的毒性所期望的。此外，显示了synp1启动子仅增加csf中的pgrn，但不增加血浆中的pgrn，这是本发明的构建体的进一步期望特性。
[0271]
实施例4. 密码子优化的颗粒蛋白前体载体设计和合成颗粒蛋白前体转基因优化由增强蛋白质表达、稳定性和功能的努力组成。合成密码子优化的颗粒蛋白前体(pgrn)变体，并且评价相对于野生型的蛋白质表达变化。生成了六种密码子优化的变体，具有或不具有27 bp c末端ha标签。加上ha标签的变体对于蛋白质表达提供了替代测量，用于区别内源性pgrn蛋白的手段，并且还允许评价抑制pgrn-分拣蛋白结合的任何治疗益处。
[0272]
每种密码子优化的变体含有独特的优化(即密码子使用、gc含量、5
’ꢀ
mrna结构的稳定性、rna不稳定序列的去除等)，其导致在其dna序列方面不同但保存其氨基酸序列的变体。这些变体由三种不同的优化算法之一(或其组合)生成。
[0273]
执行pcr扩增和提取，导致具有相容性限制位点(noti、nhei)的pgrn转基因区段，用于插入含有氨苄青霉素选择盒和aav itr区段的独特的病毒包装载体内。在完全合成之后，将密码子优化的构建体转化到高效率大肠杆菌细胞(sure2)内用于扩增，并且选择克隆用于验证。执行桑格测序(genewiz)和限制性消化(具有适当的限制位点以检查转基因插入和itr完整性)，以验证密码子优化的pgrn和pgrnwt质粒。选择关于每种密码子优化的构建体的阳性克隆用于后续实验。
[0274]
为了确定与pgrnwt相比，6种密码子优化的变体(指定为coa-f (例如pgrncoa、pgrncob、pgrncoc、pgrncod、pgrncoe、pgrncof))如何表达pgrn，执行转基因表达实验，并且经由上清液和细胞裂解物elisa分析和蛋白质印迹进行分析。elisa和蛋白质结果两者均显示了，当用human progranulin quantikine elisa kit (r&d systems)测定时，并且当用抗人颗粒蛋白前体抗体(sigma)和抗ha单克隆抗体(thermofisher)探测时，coe和cof变体具有与wt可比较的蛋白质表达，而所有其它co变体展示较差的表达(图29和图30)。因此，选择co-e和cof作为用于所选转基因的良好候选物。coe和cof两者均在sds-page上以~80 kd的预计分子量迁移(即与pgrnwt相同)，如图30中所示。
[0275]
接下来，将处于hsyn启动子的控制下的密码子优化的变体coe (pgrncoe)和cof (pgrncof)转染到hek293细胞内，并且经由上清液elisa分析所分泌的转基因表达(图31)。如图31中所示，在hek293细胞中，coe显示了与wt可比较的分泌性颗粒蛋白前体表达(ng/ml)，以及比cof更高的分泌性颗粒蛋白前体表达(ng/ml)。还在第5天(d5)测量了表达，其中可见关于变体coe的轻微降低以及关于变体cof的更大降低。蛋白质印迹结果(图32)确认了这一结果。
[0276]
在sh-sy5y细胞中执行了类似的实验。结果显示于图33中。将处于hsyn启动子的控制下的密码子优化的变体coe (pgrncoe)和cof (pgrncof)转染到sh-sy5y细胞内，并且经由上清液elisa分析所分泌的转基因表达。如图33中所示，在hek293细胞中，coe显示了与wt可比较的分泌性颗粒蛋白前体表达(ng/ml)，以及比cof更高的分泌性颗粒蛋白前体表达(ng/ml)。还在第5天(d5)测量了表达，其中可见关于变体coe在分泌性颗粒蛋白前体表达方面的轻微降低，同时可见关于变体cof的增加。
[0277]
除增强表达和针对优化的稳定性之外，避免pgrn降解为颗粒蛋白和/或pgrn被细胞摄取具有增加pgrn可用性的极大潜力。方法之一是靶向pgrn与其主要受体分拣蛋白的结合。因此，通过缺失对于分拣蛋白结合关键的5个氨基酸，生成了所选候选物的vc末端修饰的pgrn。
[0278]
执行实验以观察是否可以通过避免与作为主要受体的分拣蛋白结合来增强pgrn表达。
[0279]
实施例5. raav-x载体的生产产生了raav-x载体，其中“x”是下述血清型/变体之一：aav-rh10、含有最高选择的基因组变体的aav-9。这些载体的研究级制备将通过各种方法进行。(1)在第一种方法中，通过hek293细胞的质粒转染来包装载体，并且根据建立的方法(这种方法的参考可以在zolotukhin等人，2002 methods中找到)，通过碘克沙醇密度梯度来纯化病毒。(2)在第二种方法中，使用agtc的有专利权的重组hsv互补在悬浮培养的幼仓鼠肾(sbhk)细胞中产生载体(kang等人，gene ther 2009；thomas等人，hum gene ther 2009)。三重转染方法用于制
备用于所有临床前工作的载体。三重转染也将用于制备用于glp毒性研究的载体。载体生产使用have (hsv相关)方法进行优化，并且预计该方法用于后期工作中的生产，例如用于临床试验材料的制备。进行研究以证实通过两种方法制备的载体的可比性。
[0280]
根据一些实施方案，包含raavr10-syn-pgrnwt的载体构建体通过三重转染进行制备，所述三重转染包含具有itr-syn-pgrnwt-wpre-pa-itr盒插入的基于puc的“ptr”质粒。itr-syn-pgrnwt-wpre-pa-itr盒(图1)的核酸序列可以衍生自图4或图5a和5b (itr序列)或5ab (对于两个itr)，图3 (hsyn)，图6 (hpgrnwt)，图17 (对于wpre)和图18 (对于sv40pa)中提供的各种序列。
[0281]
实施例6. 体内研究：非人灵长类动物中的颗粒蛋白前体表达进行研究，以评估在食蟹猴中的基因疗法(使用raavr10-syn-pgrnwt)的单次脑池内注射之后的全身基因表达。为了实现这一目标，将两只雄性食蟹猴转移到研究中，所述食蟹猴之一先前植入了鞘内腰椎导管用于csf样品收集(动物002a)。根据下述研究设计，通过大池穿刺向动物施用单一剂量的1.5 ml的测试物品。
[0282]
剂量施用：使两只动物镇静用于经由鞘内大池(cm)穿刺的剂量施用。向每只动物提供盐酸右美托咪定im (0.04 mg/kg)。至少10分钟后，提供盐酸氯胺酮(2.5 mg/kg)的im注射以诱导镇静。一旦镇静，动物就被插管，并且大池区域对于脊髓穿刺作准备。根据nbr sop，将动物置于侧卧位。在将脊髓针引入大池前，使用20号针在皮肤中制备微小切口。利用gertie marx
®ꢀ
22号针执行脊髓穿刺。通过来自针的csf流动确认了对cm的接近。一旦在脊髓针的中心观察到csf，就通过手动推注在大约1-2分钟内施用1.5 ml剂量。在取出针后，对注射部位施加直接压力，随后为局部无菌软膏的施加。在剂量施用之后，在麻醉逆转之前，将动物置于特伦德伦伯卧位10分钟。以0.2 mg/kg im的剂量提供逆转剂盐酸阿替美唑，记录时间并将动物送回其笼子。
[0283]
生命中的观察和测量包括临床观察、体重和临床病理学评估，如本报告的其它地方中所述。收集血液和csf用于分析。在第57天时的样品收集后，将两只动物送回nbr灵长类动物群落。
[0284]
在研究过程中，不存在异常临床体征或测试物品有关的体重变化。
[0285]
与研究前相比，在评估的时间间隔(第57天)，不存在血液学或血清化学参数中有意义的变化。
[0286]
在用测试物品给药之后，抗aav中和抗体的滴度在所有测试样品中都是增加的。结果显示于图34中。在8周或10周的过程中，确定了脑脊液(csf)和血浆中的颗粒蛋白前体表达的倍数变化。如图34中所示，在时间过程中，颗粒蛋白前体表达在csf中增加，但在血浆中没有增加。与动物002a相比，动物001a发展更快/更高的应答，尤其是在csf中。添加第10周时间点，以确认csf颗粒蛋白前体水平的下降。
[0287]
尽管本发明已通过说明和实例的方式略微详细地进行描述，用于清楚理解的目的，但应当理解，可以在所附权利要求的范围内实践某些变化和修改。对于基因疗法、分子生物学和/或相关领域的技术人员而言，鉴于前述公开内容将理解或者用本发明的常规实践或实施变得显而易见的，用于执行本发明的上述模式的修改预期在下述权利要求的范围内。
[0288]
本说明书中提到的所有出版物(例如，非专利文献)、专利、专利申请公开和专利申请都指示了本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有此类出版物(例如，非专利文献)、专利、专利申请公开和专利申请都通过引用并入本文，其程度与每个个别出版物、专利、专利申请公开或专利申请被特异性地且个别地指示通过引用并入相同。
[0289]
虽然前述发明已与该优选实施方案结合进行描述，但它不限于此，而是仅受下述权利要求的范围限制。
再多了解一些
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