特异性结合VEGF和PPK的双特异性结合分子及其用途的制作方法

al.vegf is a secreted angiogenic mitogen.science,1989,246:1306～1309)，能够在体内诱导血管生成。vegf受体是血管内皮生长因子的受体。vegf受体有三种主要的亚型，分别为vegfr-1、vegfr-2、vegfr-3。vegf受体具有由7个免疫球蛋白样结构域(如细胞外结构域1-7)，单个跨膜跨越区域和包含分裂的酪氨酸激酶结构域的细胞内部分组成的细胞外部分。进一步研究证明血管内皮细胞生长因子是调节血管新生的最重要的因子(ferrara n.vegf and the quest for tumor angiogenesis factor.nat.rev.cancer,2002,2(10):795-803)。vegf参与调节正常及非正常的肿瘤和眼内病症的血管新生，例如眼部的许多疾病都涉及血管发生，包括年龄相关性黄斑变性(amd)、视网膜静脉阻塞(rvo)、糖尿病视网膜病变(dr)和病理性近视等。由于vegf信号传递对血管新生的重要性，阻断vegf或vegf受体从而达到抑制血管新生，对包括癌症、视网膜血管病变等与血管新生相关的疾病有着重要的治疗作用。在过去的十多年，诞生了一些用于治疗眼部新生血管性眼病的抗vegf药物，如哌加他尼(macugen)、贝伐单抗(avastin)、雷珠单抗(lucentis)、阿柏西普(eylea)、brolucizumab等。
7.贝伐单抗是一种在肿瘤治疗中使用的抗vegf人源化单克隆抗体(wo98/45331)。雷珠单抗是一种与贝伐单抗自同一亲本鼠抗体衍生的单克隆抗体片段。但它比亲本分子更小，并且已经经过亲和力成熟，从而能够提供更强的对vegf-a的结合能力(wo98/45331)。自2006年被fda批准用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性以来，目前已在多个适应症，例如糖尿病性黄斑水肿(dme)、视网膜中央静脉阻塞(crvo)、视网膜分枝静脉阻塞(brvo))、脉络膜新生血管疾病(cnv)、糖尿病视网膜病变(dr)等。
8.虽然对于肿瘤或眼部疾病的单克隆抗体的开发方面已经取得了显著的成效，但是对于进一步的改进仍然存在需求。双特异性抗体对于提高的活性或降低的副作用提供了一种新的选择。目前还没有能够同时结合ppk和vegf的研究报道。


技术实现要素：

9.发明简述
10.本发明第一方面是提供一种特异性结合人血管内皮生长因子(vegf)和人血浆前激肽释放酶(ppk)双特异性结合分子，其包含特异性结合人vegf的抗原结合位点和特异性结合人ppk的抗原结合位点。
11.在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的双特异性结合分子，其特征在于：
12.所述特异性结合人vegf的抗原结合位点在重链可变结构域包含seq id no：1-3的cdr1-3区，并且轻链可变结构域包含seq id no：8-10的cdr1-3区；
13.所述特异性结合人ppk的抗原结合位点在重链可变结构域包含seq id no：15-17的cdr1-3区，并且轻链可变结构域包含seq id no：22-24的cdr1-3区。
14.在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的双特异性结合分子，其特征在于所述特异性结合人vegf的抗原结合位点包含seq id no：4所述的重链可变结构域和seq id no：11所述的轻链可变结构域；
15.所述特异性结合人ppk的抗原结合位点包含seq id no：18、seq id no：29、seq id no：37或seq id no：71所述的重链可变结构域，和seq id no：25、seq id no：33、seq id no：41或seq id no：45所述的轻链可变结构域。
16.在某些具体的实施方案中，根据本发明所述的双特异性结合分子，其特征在于所述特异性结合人vegf的抗原结合位点包含seq id no：4所述的重链可变结构域，和seq id no：11所述的轻链可变结构域；
17.所述特异性结合人ppk的抗原结合位点包含seq id no：18所述的重链可变结构域，和seq seq id no：25所述的轻链可变结构域；或seq id no：29所述的重链可变结构域，和seq seq id no：33所述的轻链可变结构域；或seq id no：37所述的重链可变结构域，和seq seq id no：41所述的轻链可变结构域；或seq id no：37所述的重链可变结构域，和seq seq id no：45所述的轻链可变结构域；或seq id no：71所述的重链可变结构域，和seq seq id no：41所述的轻链可变结构域。
18.在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的双特异性结合分子，其特征在于所述特异性结合人vegf的抗原结合位点包含seq id no：6、seq id no：67或seq id no：69所述的重链，和seq id no：13所述的轻链；
19.所述特异性结合人ppk的抗原结合位点包含seq id no：20、seq id no：31、seq id no：39、seq id no：73或seq id no：75所述的重链，和seq id no：27、seq id no：35、seq id no：43或seq id no：47所述的轻链。
20.在某些具体的实施方案中，根据本发明所述的双特异性结合分子，其特征在于所述特异性结合人vegf的抗原结合位点包含seq id no：6所述的重链和seq id no：13所述的轻链，或seq id no：67所述的重链和seq id no：13所述的轻链，或seq id no：69所述的重链和seq id no：13所述的轻链；
21.所述特异性结合人ppk的抗原结合位点包含seq id no：20所述的重链和seq id no：27所述的轻链；或seq id no：31所述的重链和seq id no：35所述的轻链；seq id no：39所述的重链和seq id no：43所述的轻链；seq id no：37所述的重链和seq id no：47所述的轻链，或seq id no：73所述的重链，和seq id no：43所述的轻链，或seq id no：75所述的重链和seq id no：43所述的轻链。
22.本发明所述的双特异性结合分子至少是二价的，并且可以是三价、四价或多价，优选的，本发明所述的双特异性结合分子为二价、三价或者四价结合分子，优选二价结合分子。
23.本发明另一方面在于提供一种分离的核酸，其编码本发明所述的双特异性结合分子。
24.本发明的另一方面还在于提供包含本发明所述核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。其能够在原核或真核宿主细胞表达所述核酸。
25.本发明的另一方面还在于提供包含本发明所述核酸或载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
26.本发明的另一方面还在于提供一种药物组合物，其包含本发明所述的结合分子，和药学上可接受的赋形剂。
27.本发明的另一方面还在于提供本发明所述的结合分子在制备用于预防或治疗血管疾病的药物中的用途。
28.本发明的另一方面还在于提供一种预防或治疗受试者中血管疾病的方法，包括给予本发明所述的结合分子。
29.在某些具体的实施方式中，本发明所述血管疾病为水肿、类风湿性关节炎、痛风、肠道疾病、口腔粘膜炎、神经性疼痛、炎性疼痛、椎管狭窄-退行性脊柱疾病、糖尿病、动脉或静脉血栓形成、主动脉瘤、骨关节炎、脉管炎、肺栓塞、中风、败血病、系统性红斑狼疮性肾炎和烧伤、眼部疾病。
30.优选的，在某些实施例中，本发明所述水肿优选自遗传性血管性水肿、脑水肿或头部外伤。
31.优选的，在某些实施例中，本发明所述眼部疾病优选自糖尿病性黄斑水肿，视网膜静脉阻塞，年龄相关性黄斑变性，继发于视网膜静脉阻塞的黄斑水肿，葡萄膜炎、眼内炎或息肉状脉络膜血管病变。
32.发明详述
33.本发明的一个实施方案是特异性结合人血管内皮生长因子(vegf)和人血浆前激肽释放酶(ppk)双特异性结合分子，其包含特异性结合人vegf的抗原结合位点和特异性结合人ppk的抗原结合位点。
34.在一种实施方式中，本发明所述的双特异性结合分子为双特异性抗体，即所述抗原结合位点每个包含一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。
35.所述特异性结合人vegf的抗原结合位点在重链可变结构域包含seq id no：1-3的cdr1-3区，seq id no：49-51的cdr1-3区，或seq id no：59-61的cdr1-3区，并且轻链可变结构域包含seq id no：8-10的cdr1-3区，seq id no：54-56的cdr1-3区，或seq id no：63-65的cdr1-3区；
36.所述特异性结合人ppk的抗原结合位点在重链可变结构域包含seq id no：15-17的cdr1-3区，并且轻链可变结构域包含seq id no：22-24的cdr1-3区。
37.在某些实施方案中，根据本发明所述的双特异性抗体，其特征在于所述特异性结合人vegf的抗原结合位点在重链可变结构域包含seq id no：1-3的cdr1-3区，并且轻链可变结构域包含seq id no：8-10的cdr1-3区；或
38.所述特异性结合人vegf的抗原结合位点在重链可变结构域包含seq id no：49-51的cdr1-3区，并且轻链可变结构域包含seq id no：54-56的cdr1-3区；或
39.所述特异性结合人vegf的抗原结合位点在重链可变结构域包含seq id no：59-61的cdr1-3区，并且轻链可变结构域包含seq id no：63-65的cdr1-3区；
40.所述特异性结合人ppk的抗原结合位点在重链可变结构域包含seq id no：15-17的cdr1-3区，并且轻链可变结构域包含seq id no：22-24的cdr1-3区。
41.在某些实施方案中，根据本发明所述的双特异性抗体，其特征在于所述特异性结合人vegf的抗原结合位点包含seq id no：4、seq id no：52或seq id no：62所述的重链可变结构域，和seq id no：11、seq id no：57或seq id no：66所述的轻链可变结构域；
42.所述特异性结合人ppk的抗原结合位点包含seq id no：18、seq id no：29、seq id no：37或seq id no：71所述的重链可变结构域，和seq id no：25、seq id no：33、seq id no：41或seq id no：45所述的轻链可变结构域。
43.在某些具体的实施方案中，根据本发明所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合人vegf的抗原结合位点包含seq id no：4所述的重链可变结构域和seq id no：11所述的轻链可变结构域，或所述特异性结合人vegf的抗原结合位点包含seq id no：52所述
的重链可变结构域和seq id no：57所述的轻链可变结构域，或所述特异性结合人vegf的抗原结合位点包含seq id no：62所述的重链可变结构域和seq id no：66所述的轻链可变结构域；
44.所述特异性结合人ppk的抗原结合位点包含seq id no：18所述的重链可变结构域和seq seq id no：25所述的轻链可变结构域，或seq id no：29所述的重链可变结构域和seq seq id no：33所述的轻链可变结构域，或seq id no：37所述的重链可变结构域和seq seq id no：41所述的轻链可变结构域，或seq id no：37所述的重链可变结构域和seq seq id no：45所述的轻链可变结构域，或seq id no：71所述的重链可变结构域和seq seq id no：41所述的轻链可变结构域。
45.在某些方案中，本发明的双特异性抗体抗体进一步包含人免疫球蛋白fc片段。优选的，所述人免疫球蛋白fc片段选自如下片段之一：igg1fc、igg2fc、igg3fc和igg4fc或他们的突变体。更优选的，人免疫球蛋白fc为igg1fc或其突变体。
46.在某些实施方案中，根据本发明所述的双特异性抗体，其特征在于所述特异性结合人vegf的抗原结合位点包含seq id no：6、seq id no：53、seq id no：67或seq id no：69所述的重链，和seq id no：13或seq id no：58所述的轻链；
47.所述特异性结合人ppk的抗原结合位点包含seq id no：20、seq id no：31、seq id no：39、seq id no：73或seq id no：75所述的重链，和seq id no：27、seq id no：35、seq id no：43或seq id no：47所述的轻链。
48.在某些具体的实施方案中，根据本发明所述的双特异性抗体，其特征在于所述特异性结合人vegf的抗原结合位点包含seq id no：6所述的重链和seq id no：13所述的轻链，或seq id no：53所述的重链和seq id no：58所述的轻链，或seq id no：67所述的重链和seq id no：13所述的轻链，或seq id no：69所述的重链和seq id no：13所述的轻链；
49.所述特异性结合人ppk的抗原结合位点包含seq id no：20所述的重链和seq id no：27所述的轻链；或seq id no：31所述的重链和seq id no：35所述的轻链；或seq id no：39所述的重链和seq id no：43所述的轻链；或seq id no：39所述的重链和seq id no：47所述的轻链，或seq id no：73所述的重链和seq id no：43所述的轻链，或seq id no：75所述的重链和seq id no：43所述的轻链。
50.本发明所述“双特异性结合分子”是指包含一个第一抗原结合分子和至少一个第二抗原结合分子的分子。双特异性结合分子可包含多余一个第一抗原结合分子和/或多于一个第二抗原结合分子。本发明的“双特异性”并不解释为从双特异性结合分子中排除对第一抗原和第二抗原以外的分子具有结合特异性的其他结合组分，示例性地如结合血清白蛋白的结合组分。通常来说，本发明的第一抗原不同于第二抗原。在本发明的一些具体实施例中，本发明的第一抗原为vegf，第二抗原为ppk；或者第一抗原为ppk，第二抗原为vegf。
51.本发明所述“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，抗体与抗原(如人vegf或人ppk)的表位进行结合。结合的亲和力由kd(结合速率)或kd(解离常数)进行表征。结合或特异性结合kd在10-8
mol/l以下，优选10-9
mol/l到10-13
mol/l。
52.本发明所述“表位”意指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分(moiety)(诸如氨基酸或多糖侧链)的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团构成，并且可以具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连
续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。
53.本发明的一个实施方案是本发明所述的双特异性结合分子为双特异性抗体。在本技术中使用的术语“抗体”指包含抗原结合位点的结合蛋白。术语“结合位点”或“抗原结合位点”指配体实际上结合的抗体分子的区域。术语“抗原结合位点”包含抗体重链可变结构域(vh)和/或抗体轻链可变结构域(vl)或vh/vl对，并可源自完整的抗体或抗体片段如单链fv、vh结构域和/或vl结构域、fab或(fab)2。在本发明的一个实施方案中，每个抗原结合位点包含抗体重链可变结构域(vh)和/或抗体轻链可变结构域(vl)，和优选地由抗体轻链可变结构域(vl)和抗体重链可变结构域(vh)对组成。在本发明的一个具体实施方案中，本发明所述的双特异性结合分子为特异性结合人血管内皮生长因子(vegf)和人血浆激肽释放酶(ppk)的双特异性抗体，其中特异性结合vegf或ppk的抗原结合位点包含抗体重链可变结构域(vh)和/或抗体轻链可变结构域(vl)，优选地包含由抗体轻链可变结构域(vl)和抗体重链可变结构域(vh)对。本发明所述的抗体重链可变结构域(vh)和/或抗体轻链可变结构域(vl)可来自于已知抗体，例如本发明的所述的特异性结合vegf的抗体重链可变结构域(vh)和抗体轻链可变结构域(vl)可来自于贝伐单抗、雷珠单抗、brolucizumab等，本发明所述的抗体重链可变结构域(vh)和/或抗体轻链可变结构域(vl)还可通过本领域所熟知的方法(例如杂交瘤筛选技术、噬菌体展示筛选技术等)获得。
54.本发明的术语“价”指抗原结合位点在双特异性结合分子上存在的具体梳理。例如，术语“二价”、“四价”、“六价”指在抗体分子上分别存在两个、四个和六个抗原结合位点。本发明所述的双特异性结合分子是至少“二价的”，并且可以是“三价”、“四价”或更多价。优选地、本发明所述的双特异性结合分子是二价、三价或四价。在一个实施方案中，所述双特异性结合分子是二价的。在一个实施方案中，所述双特异性结合分子是三价的。在一个实施方案中，所述双特异性结合分子是四价的。随着基因工程技术的进步，以及噬菌体展示、蛋白质工程、转基因小鼠等技术的发展，目前已开发出上百种二价或多价的双特异性结合分子或抗体的形式。例如igg样形式双特异性抗体或结合分子quadromas、kihs、crossmab、双可变域ig(dvd-ig)、igg单链fv(igg-scfv)、二合一后双作用fab抗体(daf)和kλ-body等；非igg样形式包括单链抗体、纳米抗体、dock and lock(dnl)方法或其他多价分子，基于单链抗体的形式包括scfvs、sdab、ta-scfv、diabodies、tandabs和dart等。
55.本发明的双特异性结合分子具有两个以上的结合位点，并且是双特异性的。即使是在存在两个以上结合位点(例如三价或多价)，所述双特异性结合分子可以是双特异性的。本发明双特异性结合分子例如包括，多价单链抗体、双链抗体和三链抗体，以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体，另外的抗原结合位点(例如单链fv、vh结构域和/或vl结构域、fab或(fab)2、融合蛋白结构域)通过一个或多个肽接头连接所述全长抗体的恒定结构域结构或可变结构域结构。所述抗体可以是来自单一物种的全长抗体，也可以是嵌合抗体或人源化抗体。
56.本发明的抗体或结合分子的抗原结合位点可包含六个互补性决定区(cdrs)，其中三个重链可变结构域cdrs(cdrh1，cdrh2和cdrh3)和三个轻链可变结构域cdrs(cdrl1，cdrl2和cdrl3)。cdr和框架区(frs)共同组成重链或轻链可变结构域。fr的可变性要低于cdr，fr分子共四个，分别为fr1、fr2、fr3和fr4。在识别抗体时，四个fr分子卷曲使cdr分子
相互靠近。在一些实施方案中，本发明的抗原结合位点还包括包含更少cdrs的功能性抗原结合位点(例如三个、四个或五个cdrs)。在一些实施方案中，抗原结合位点是vh或vl结构域。
57.本发明的术语“可变结构域”(轻链(vl)的可变结构域，重链(vh)的可变区)表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链对。轻链和重链可变结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(fr)区，分别为fr1、fr2、fr3和fr4。所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补性决定区，cdrs)相连接。每条链中的cdr通过框架区以其三维结构保持并与来自另一条链的cdr一起形成抗原结合位点。
58.本发明的术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“cdrs”的氨基酸残基。“构架”或“fr”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从n端到c端包括结构域fr1，cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。各条链上的cdr通过所述框架氨基酸分开。特别地，重链的cdr3是最有助于抗原结合的区域。
59.本发明的术语“fab”指包含抗体重链可变结构域(vh)，抗体恒定结构域1(ch1)，抗体轻链可变结构域(vl)和抗体轻链恒定结构域(cl)的多肽，重链和轻链结构域之间通过二硫键稳定。一个fab可形成一个抗原结合位点，两个“fab”可通过二硫键形成“(fab)2”，因此具有两个抗原结合位点。
60.本发明的术语“scfv”指包含抗体重链可变结构域(vh)、抗体恒定结构域1(ch1)的多肽，重链和轻链结构域之间通过二硫键稳定，scfv是抗原结合的关键区域。
61.本发明的结合分子或抗体还包含一个或多个免疫球蛋白种类的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白种类包括igg，igm，iga，igd，和ige同种型，并且在igg和iga的情形中，包括它们的亚型。在优选的实施方案中，本发明的抗体具有igg型抗体的恒定结构域结构。
62.本发明的术语“恒定区”指除了可变区之外的抗体结构域的总合。恒定区不直接涉及抗原的结合，但是显示不同的效应子功能。根据重链的恒定区的氨基酸序列，抗体被分为下述类别：iga，igd，ige，igg和igm，并且其中igg和iga被进一步细分为如下亚型：igg1，igg2，igg3，和igg4，iga1和iga2。对应于不同种类的抗体的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。所有5种抗体中轻链恒定区被称为κ(kappa)和λ(lambda)。在本发明中来自人来源的恒定区指亚类igg1，igg2，igg3，或igg4的人抗体重链恒定区和/或κ或λ轻链恒定区。
63.根据本发明所述的双特异性结合分子或抗体还包括具有“保守序列修饰”的结合分子或抗体(“变体”)。这意味着不影响或改变上述特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。可以通过本领域已知的技术对核苷酸或氨基酸进行修饰，如位点定向诱变和pcr介导的诱变。在双特异性结合分子或抗体中的非必需氨基酸残基可以优选地被来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基置换。因此，“变体”双特异性结合分子或抗体是指其氨基酸序列与“母体”氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或置换。根据本发明所述的“变体”双特异性结合分子或抗体也包括接头(如果存在)被修饰或被另一个接头替换的情形。因此本发明所述双特异性结合分子或抗体的核苷酸或氨基酸序列均包括具有“保守序列修饰”与母体核苷酸或氨基酸具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或以上同源性的序列。
64.本发明的术语“嵌合抗体”指抗体包括来自一种来源或物种的抗体可变结构域，以及源自另外来源或物种的恒定区的至少一部分，通常通过重组dna技术进行制备。例如，在
一个实施方案中，包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。
65.本发明的术语“人源化抗体”指抗体的恒定区部分(即ch区和cl区)或抗体全部由人类抗体基因编码。人源化抗体可以大大降低异源抗体对人类机体造成的免疫反应。
66.在某些实施方式中，本发明所述的双特异性结合分子是具有两种不同特异性的二价双特异性抗体，其包含一个特异性结合vegf或ppk的抗体或抗体片段和另一个特异性结合vegf或ppk的抗体或抗体片段，例如前述的igg样或非igg样形式双特异性抗体quadromas、kihs、crossmab、双可变域ig(dvd-ig)、igg单链fv(igg-scfv)、二合一后双作用fab抗体(daf)和kλ-body、单链抗体(例如scfvs、sdab、ta-scfv、diabodies、tandabs和dart等)、纳米抗体、dock and lock(dnl)。本发明所述的一种实例是crossmab双特异性二价抗体。通过本领域已知方法，三价、四价或更多价的双特异性抗体可通过二价抗体的任一端通过肽连接头连接一个或多个抗体或抗体片段，和/或通过形成二聚体进行设计及构建。
67.本发明的术语“肽连接头”指具有氨基酸序列的肽，优选地肽连接头通过合成获得。根据本发明所述的肽接头用于连接不同的抗原结合位点和/或最终包含不同的抗原结合位点的抗体片段(例如单链fv，全长抗体，vh或vhh结构域和/或vl结构域，fab，(fab)2，fc部分)或融合蛋白片段，从而一起形成本发明所述的二价、三价、四价或更多价的双特异性结合分子。所述肽接头具有至少5个氨基酸长度，优选地至少10个氨基酸长度，更优选地10-50个氨基酸长度。在一个实施方案中，所述肽接头是(gxs)n，其中g＝甘氨酸，s＝丝氨酸，(x＝3和n＝3，4，5或6)或(x＝4和n＝2，3，4或5)，优选地x＝4和n＝2或3，更优选地x＝4，n＝2((g4s)2)。还可以将另外的g＝甘氨酸，例如gg，或ggg加入所述(gxs)n肽接头。
68.根据本发明所述的抗体由重组方式产生。因此，本发明的一个方面是编码根据本发明所述的双特异性结合分子的核酸，并且另一个方面是包含编码根据本发明所述的双特异性结合分子的核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的并且包括在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达、分离和纯化等。对于前述双特异性结合分子在宿主细胞中的表达，将编码各个蛋白片段(例如抗体重链、轻链、fab、scfv、融合蛋白片段等)的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞如cho细胞，ns0细胞，sp2/0细胞，hek293细胞，cos细胞，per.c6细胞，酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并且将所述结合分子从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收。
69.双特异性结合分子氨基酸序列变体(或突变体)通过将适合的核苷酸突变引入dna中，或通过核苷酸合成进行制备。上述突变或修饰不改变双特异性结合分子特征如igg同种型和抗原结合，但是可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或有利于纯化。
70.本发明的术语“宿主细胞”指可以被改造从而产生根据本发明所述的双特异性结合分子的任何细胞系。在一个实施方案中，将hek293细胞和cho细胞用作宿主细胞。在本技术中，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且包括他们的后代。
71.本发明的另一个方面在于提供包含本发明所述的双特异性结合分子的药物组合物，所述药物组合物包含本发明所述的双特异性结合分子和药学上可接受的赋形剂。
72.本发明的术语“药学上可接受的赋形剂”是指能够递送本发明有效量活性分子、不干扰活性分子生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质，包括任何本领域普通技术人员已知的溶剂、分散介质、表面活性剂、抗氧剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑
剂、甜味剂、矫味剂、染料等及其组合。优选地，所述赋形剂适合用于眼内、静脉内、肌内、皮下、肠胃外、关节内等方式给药。
73.本发明本发明的另一个方面在于提供本发明所述的双特异性结合分子在制备用于预防或治疗血管疾病的药物中的用途。
74.本发明本发明的另一个方面在于提供一种预防或治疗受试者中血管疾病的方法，包括给予本发明所述的双特异性结合分子。
75.本发明结合分子可以通过本领域已知的方式施用，例如肠胃外施用，包括但不限于肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、大脑内、眼内、关节内、囊下、脊柱内、硬膜外、胸骨内注射或输注。
76.本发明的“血管疾病”包括水肿、类风湿性关节炎、痛风、肠道疾病、口腔粘膜炎、神经性疼痛、炎性疼痛、椎管狭窄-退行性脊柱疾病、糖尿病、动脉或静脉血栓形成、主动脉瘤、骨关节炎、脉管炎、肺栓塞、中风、败血病、系统性红斑狼疮性肾炎和烧伤、眼部疾病等。在一些优选实施方案中，所述水肿选自遗传性血管性水肿、脑水肿或头部外伤等。在另一些优选实施方案中，所述眼部疾病选自糖尿病性黄斑水肿，视网膜静脉阻塞，年龄相关性黄斑变性，继发于视网膜静脉阻塞的黄斑水肿，葡萄膜炎、眼内炎或息肉状脉络膜血管病变等。
77.本发明示例给出的本发明所述的双特异性结合分子的氨基酸和核苷酸序列对应关系分别见表1和表2：
78.表1部分双特异性结合分子的氨基酸序列
[0079][0080]
其中，vh表示重链可变区，vl表示轻链可变区，h表示重链，l表示轻链。
[0081]
表2部分双特异性结合分子的核苷酸序列
[0082][0083]
其中，vh表示重链可变区，vl表示轻链可变区，h表示重链，l表示轻链。
具体实施方式
[0084]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0085]
实施例一双特异性抗体的制备
[0086]
1、双特异性抗体构建
[0087]
制备和鉴定本发明的双特异性抗体过程中需要用到多种抗体，包括特异性结合vegf的抗体，如雷珠单抗(可参见wo98/45331、wo9845322a中所描述)，和特异性结合ppk的抗体。其中特异性结合ppk的抗体通过杂交瘤筛选、以及进一步通过抗体人源化后获得。双特异性抗体则通过crossmab、knob in holes，以及fc段效应功能(例如：adcc,cdc,adcp等)，抗体半衰期fc段改造(例如改造fcrn结合能力)等技术完成分子设计和构建，通过常规分子生物学技术方法，例如通过基因合成，以及pcr对各抗体片段进行扩增，将pcr产物连接进酶切载体pcdna3.4中，连接产物通过热激转化进感受态dh5
ɑ
细胞，进行菌落pcr鉴定，将阳性克隆进行培养，提取少量质粒送检测和测序验证，酶切和测序正确即构建完成。
[0088]
2、双特异性抗体的表达和纯化
[0089]
将测序正确的轻重链质粒转染expicho或hek293细胞中进行表达，7-10天后，细胞上清利用akta蛋白纯化仪进行亲和纯化(例如protein a填料)，得到双特异抗体蛋白。
[0090]
实施例二、与人vegf结合亲和力测试
[0091]
使用高通量分子互作检测系统(biacore 8k)，选用protein a芯片，先进行抗原抗体浓度摸索，芯片先结合不同浓度(一般3个浓度)抗体，再结合一个浓度抗原，根据ru值选择最适合抗体浓度，并设计合适的抗原浓度(至少6个浓度)；然后开始亲和力检测，芯片先结合适合抗体浓度，结合时间90s，再与不同浓度的抗原进行结合(时间约120s)解离(时间约300s)检测，结果用分析软件进行分析，获得亲和力数据。实验结果如表3。
[0092]
表3双特异性抗体与人vegf结合亲和力参数
[0093][0094]
实施例三、与人ppk结合亲和力测试
[0095]
使用高通量分子互作检测系统(biacore 8k)，选用protein a芯片，先进行抗原抗体浓度摸索，芯片先结合不同浓度(一般3个浓度)抗体，再结合一个浓度抗原，根据ru值选择最适合抗体浓度，并设计合适的抗原浓度(至少6个浓度)；然后开始亲和力检测，芯片先结合适合抗体浓度，结合时间90s，再与不同浓度的抗原进行结合(时间约120s)解离(时间约300s)检测，结果用分析软件进行分析，获得亲和力数据，结果如表4。
[0096]
表4双特异性抗体与人ppk结合亲和力参数
[0097][0098]
实施例四、血管内皮生长因子(vegf)生物学活性检测
[0099]
将生长良好的人脐带静脉血管内皮细胞(huvec，sciencell公司)接种于96孔培养板中，2
×
103细胞/孔，100μl/孔，37℃，5％co2培养20h；用含2％胎牛血清的ecm培养基(内皮细胞培养基，货号1001，sciencell公司)配制不同摩尔浓度(0.2、2、17.56、26.34、39.51、59.26、88.89、133.33、200、2000ng/ml)的双特异性抗体，分别与40ng/ml的vegf(r&d公司)混匀，孵育2h；再加至接种有huvec细胞的96孔板上，100μl/孔，每组3复孔，5％co2继续孵育96h，加入cck-8试剂(dojindo公司)，以ec50表示本发明的抑制作用。结果如表5所示，本发明的双特异性结合分子均可有效抑制vegf刺激的huvec细胞增殖作用，表明本发明的双特异性抗体具有较好抑制vegf的生物学活性。
[0100]
表5：双特异性抗体抑制vegf诱导huvec细胞增殖作用
[0101]
样品ec50(nm)kh010.58kh020.273kh030.427kh040.463
[0102]
实施例五、人血浆活性检测
[0103]
人血浆中存在ppk、pk等蛋白，但通过检测发现人血浆原液或稀释液中pk并不显现出活性，可能是一个酶活抑制的平衡状态。如果额外加入factor xiia因子将打破平衡，产生具有酶活性的pk蛋白，以此原理检测pk抑制剂的活性。首先是抗体样品准备，用检测缓冲液(20mm tris-hcl，ph＝7.50、150mm nacl、1mm edta、0.1％peg-8000和0.1％triton x-100)将抗体蛋白进行稀释至200μg/ml作为起始浓度，进行4倍梯度稀释，共11个浓度梯度，稀释好后待用。用检测缓冲液将人血浆稀释40倍，factor xiia因子稀释至100ng/ml，底物
肽(h-pro-phe-arg-amc)稀释至1000μm备用。分别吸取50μl检测缓冲液及稀释后的各个浓度梯度抗体蛋白溶液加至96孔不透光酶标板；另取20μl人血浆40倍稀释样至上述96孔板中，37℃孵育30min；再加入浓度为100ng/ml factor xiia 20μl，37℃孵育45min；最后向上述96孔不透光酶标板各孔中加入浓度1000μm底物肽(h-pro-phe-arg-amc)10μl。将准备好的96孔板放入多功能酶标仪(spectra max i3x)进行检测，检测参数：激发光360nm、发射光480nm，每60s读一次，共读10min。将酶反应速率(斜率)进行归一化处理后与浓度(nm)进行四参数曲线拟合，计算出ic50(nm)，具体结果见表6。
[0104]
表6双特异性抗体的人血浆活性检测结果
[0105]
样品ic50(nm)kh012.02kh024.32kh033.85kh043.10
[0106]
实施例六、猴ca-i模型实验
[0107]
1、灵长类动物疾病模型构建
[0108]
在糖尿病视网膜病变病人的玻璃体内，有显著的碳酸酐酶i(ca-i)过量表达。ca-i的表达量增加会引起玻璃体内微环境的改变，从而激发kks信号通路的激活，引起视网膜血管通透性增加，导致病人的视网膜血管渗漏和黄斑水肿(dme)。向恒河猴(4岁，3.50-6.95kg)玻璃体内注射碳酸酐酶量为0.4mg-0.55mg/眼，30min荧光素眼底血管造影(ffa)观察微血管渗漏越严重。
[0109]
2、样品溶液的配制
[0110]
表7受试药物的辅料配方
[0111]
柠檬酸盐10mm精氨酸100mm蔗糖5％吐温800.05％ph7.7
±
0.3
[0112]
含有受试药物的辅料配方见表7，根据上述辅料，将kh03配制成浓度为0.15mg/ml的受试组样品溶液。阴性对照组为上述辅料配制的制剂缓冲液。
[0113]
3、给药方式
[0114]
通过将kh03(15μg/眼)100μl玻璃体注射给药后30min，碳酸酐酶ca-i玻璃体注射造模，造模后30min通过眼底荧光素钠血管造影(ffa)进行第一次检测观测药物分子对ca-i诱导视网膜血管渗漏的抑制作用；12天后再次用ca-i造模，造模后30min进行第二次ffa检测。药物组为3只眼睛，对照组2只眼睛(分别为ca-1对照组和阴性对照组)。
[0115]
4、实验结果
[0116]
评分标准：以视网膜微血管渗漏严重情况从0-10分进行评分，以第二次检测时生理盐水组ffa图片为0分，以只给予ca-i组为8分，透光不完全，眼底模糊不清为9分(9分)，无法透光(动物无光感)为10分。标准见图1。
[0117]
眼底荧光素钠血管造影及评分结果见图2。从图2可以看出，3只猴子左眼第一次和
第二次检测均较ca-1对照组的血管渗漏情况有所改善。
[0118]
实施例七、猴cnv模型药效实验
[0119]
1、食蟹猴动物疾病模型构建
[0120]
实验动物
[0121]
10只雄性食蟹猴，年龄范围约为3.0～4.0岁，体重范围为2.0～4.0千克。
[0122]
造模过程
[0123]
第一天对每只动物的双眼进行激光光凝。造模程序如下：
[0124]
1)散瞳：造模前，对所有动物使用阿托品或其它合适散瞳剂散瞳。day 1造模前，若发现需造模动物瞳孔未散开，及时对动物进行充分散瞳，确定瞳孔充分散开。
[0125]
2)麻醉：肌肉或腹腔注射氯胺酮(10-30mg/kg)和塞拉嗪(0.5～1mg/kg)麻醉动物。根据动物反应决定是否需要使用0.4％丙美卡因进行局部麻醉。将动物面向安装激光的裂隙灯放置。
[0126]
3)激光光凝：在角膜表面放置一个眼底镜，调整裂隙灯显微镜直至眼底清晰，选择2-4个位点进行激光光凝，避开血管。光凝参数为：能量450-550mw，光斑直径50μm，曝光时间0.1-0.2s。光凝结束后，动物眼球滴抗生素滴眼液或涂抗生素眼膏。
[0127]
动物分组
[0128]
试验第16天，将激光光凝后的动物分为三个组，分别为阴性对照组(2只动物)、受试组(6只动物)和阳性对照组2只动物。
[0129]
2、样品溶液的配制
[0130]
表8受试药物的辅料配方
[0131]
柠檬酸盐10mm精氨酸100mm蔗糖5％吐温800.05％ph7.7
±
0.3
[0132]
含有受试药物的辅料配方见表8，根据上述辅料，将kh03配制成浓度为0.15mg/ml和1.5mg/ml的受试组样品溶液。
[0133]
阴性对照组为上述辅料配制的制剂缓冲液。
[0134]
阳性对照组为朗沐(规格为10mg/ml的康柏西普玻璃体内注射液，康弘生物自制)。
[0135]
3、给药方式
[0136]
试验第16天，对3组动物分别单次玻璃体腔注射给予对照品或受试品，给药体积为100μl/眼。其中受试组给予kh03 15μg/眼、150μg/眼，各三只眼。阳性对照组给予朗沐500μg/眼，两只眼。阴性对照组给予制剂缓冲液，两只眼。
[0137]
玻璃体腔注射给药方法：
[0138]
用合适浓度散瞳剂滴眼1-2次进行散瞳，然后肌肉注射氯胺酮(10～30mg/kg)和噻拉嗪(0.5～1mg/kg)麻醉动物。将动物放在手术台置于立体显微镜下，用聚维酮碘冲洗结膜囊，再用无菌生理盐水冲洗，用聚维酮碘消毒眼角膜缘、睫毛、眼周皮肤和毛发，用无菌布覆盖动物身体，暴露眼球。必要时，在角膜表面放置一块平凹镜，调整立体显微镜直至眼底清晰。在距角膜缘3～5mm处进针，至针头在玻璃体腔中清晰可见，然后注入对照品或受试品。
注射针在玻璃体内停留至少30秒钟后缓慢拔出。立即用棉签按压注射点至少1分钟。给药后，将动物放在毯子上保暖，待其可以自主活动后放回笼内。给予抗生素滴眼液/眼膏，每日3次，连续3天。
[0139]
4、观察
[0140]
光学相干断层扫描(oct)
[0141]
所有动物激光造模后立即进行一次光学相干断层扫描(oct)检查，激光造模后2周(所有动物)以及给药后1周和2周(入组动物)分别进行一次光学相干断层扫描(oct)检查。确保扫描所有激光损伤并测量光斑高度。
[0142]
眼底照相及眼底荧光造影(fp&ffa)
[0143]
所有动物造模后立即进行眼底拍照(fp)，激光造模后2周(所有动物)以及给药后1周和2周(入组动物)分别进行一次眼底拍照(fp)和眼底荧光造影(ffa)检查。造影检查时，应当在造影剂荧光素纳(10～15mg/kg,100mg/ml)静脉注射后立即进行拍摄。尽量保持恒定的曝光强度。
[0144]
荧光造影结果的评价：
[0145]
比较荧光素纳注射后早期(0～3分钟)和荧光素纳注射后后期(至少5分钟以后)的ffa图像。对激光光凝斑进行评分。计算4级光斑率和4级激光斑面积。光斑评分标准：1分，没有高荧光；2分，有高荧光但未有渗漏；3分，早期有高荧光，后期在光斑区域内轻度渗漏；4分，早期有高荧光，后期严重渗漏并超出光斑区域。
[0146]
5、实验结果
[0147]
光斑与bruch膜之间的平均肿胀厚度通过oct检测进行计算，结果如图3所示。从图3可以看出，阴性对照组在给药后7天和给药后14天，光斑处肿胀厚度无显著变化。而kh0315μg/眼或150μg/眼给药组，在给药后7天和给药后14天，光斑处肿胀厚度均有显著下降。阳性对照组(朗沐)，在给药后7天和给药后14天，光斑处肿胀厚度也有显著下降。
[0148]
4级光斑的比例以及4级光斑平均渗漏面积通过ffa进行造影和计算，结果分别如图4、5所示。4级光斑的较高比例及较大面积表示较大的cnv渗漏。从图4可以看出，阴性对照组在给药后7天和给药后14天，4级光斑比例无显著变化。而kh03 15μg/眼或150μg/眼给药组，在给药后7天和给药后14天，4级光斑比率有显著下降，并且随剂量增加而降低。阳性对照组(朗沐)，在给药后7天和给药后14天，4级光斑已完全消失。同样，从图5可以看出，阴性对照组在给药后7天和给药后14天，4级光斑平均渗漏面积无显著变化。而kh0315μg/眼或150μg/眼给药组，在给药后7天和给药后14天，4级渗漏面积有显著下降，尤其是150μg/眼给药组，几乎和阳性对照组(朗沐)效果相当。
[0149]
此外，光斑的消退情况还可以从图6的荧光素眼底血管造影术(ffa)图进行观察，此图是选取的实验各组具有代表性的ffa图。阴性对照组在给药当天、给药后7天和给药后14天，4级光斑未减少(7个)。而kh03 150μg/眼给药组，给药当天有6个4级光斑，7天后减少为2个，14天后，4级光斑已经消退。阳性对照组(朗沐)给药当天有6个4级光斑，在给药后7天和给药后14天未观察到4级光斑。