用金属纳米颗粒使纤维素载体功能化的方法和包括功能化纤维素载体的电分析传感器与流程

用金属纳米颗粒使纤维素载体功能化的方法和包括功能化纤维素载体的电分析传感器
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年3月2日提交的102020000002017号意大利专利申请的优先权，其全部公开内容通过引用并入文中。
技术领域
3.本发明涉及一种用于用金属纳米颗粒使纤维素载体功能化的方法、一种用于制造包括所述功能化纤维素载体的电分析传感器的方法、一种用于制造电分析传感器的方法以及一种涉及使用所述传感器的用于检测生物流体中的至少一种标志物的方法。


背景技术：

4.在分析化学领域，在不需要实验人员或专业人员的情况下以简单且经济的方式检测诸如血液、汗液、唾液或尿液的生物流体中的特定标志物的可能性变得越来越重要。
5.从这个意义上说，在纤维素载体(特别是纸)上制成的电化学传感器已经开发出来，同时代表了一种成本效益好的生态解决方案。
6.cinti s等(2018)，talanta 179:186-192描述了一种用于检测血清和汗液中的氯离子的办公用纸上的电化学传感器。
7.cinti s等(2017)，sensors and actuators b 253:1199-1206描述了一种用于检测血清和汗液中的锌离子的办公用纸上的电化学传感器。
8.cinti s等(2018)，talanta 187:59-64描述了用于检测血液样本中的葡萄糖的滤纸上的电化学传感器。在这篇文章中，普鲁士蓝纳米颗粒用于催化过氧化氢的还原，过氧化氢是由葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖产生的。为了形成普鲁士蓝纳米颗粒，必须使用不仅包含纳米颗粒的不同前体而且还包含还原剂的溶液。
9.上述传感器在效率方面仍然存在限制，并且纤维素(特别是纸)的使用存在问题，特别是在检测诸如金属的分析物方面，这是因为金属在载体的多孔结构上的非特异性吸附会防止分析物在工作电极上积聚。如果要在非常低的浓度下检测金属(例如，生理浓度低于20ppb的游离铜)，那么这个问题更加重要。
10.cn105675597和wo2010/073260描述了用分别使用各自的前体和还原物质(species)获得的铂纳米颗粒和银纳米颗粒对纤维素基底的功能化。
11.显然，如何为创新的电化学传感器的制造开发功能性和有效的载体(其解决当前遇到的问题，特别是目前在专业实验室之外无法测量的诸如金属的一些特定的标志物方面)是未来以及最新一代电分析传感器的可持续性和适用性的关键组成部分。


技术实现要素：

12.因此，本发明的一个目的是提供一种用金属纳米颗粒使纤维素载体功能化的方法，特别是通过赋予电催化性能和浓缩分析物的能力，这允许以简单且有效的方式解决上
述问题并且其工业规模的制造通过已经用于制造印刷电化学传感器的工艺和机械是完全可行的。
13.该目的通过本发明实现，因为它涉及如权利要求1中所限定的方法。
14.本发明的另一目的是提供一种通过如权利要求2和权利要求3中所定义的原位形成的金属纳米颗粒功能化的纤维素载体。
15.本发明的又一目的是提供一种如权利要求5中所限定的用于制造电分析传感器的方法。
16.最后，本发明的目的是提供一种如权利要求7中所限定的电分析传感器和一种如权利要求10中所限定的用于检测生物流体中的标志物的方法。
附图说明
17.图1示出参考优选实施方式的根据本发明的传感器的示意图。
18.图2示出参考根据图1的优选实施方式的传感器的制造和使用的根据本发明的方法的步骤。
19.图3示出了关于用于使根据图1的优选实施方式的传感器功能化的haucl4溶液的浓度和体积优化实验的传感器的曲线图和图像。
20.图4示出了关于根据图1的优选实施方式的具有用aunp功能化的纸的传感器和具有非功能化的纸的相似传感器的电化学性能的比较的曲线图。
21.图5示出了根据图1的优选实施方式的传感器的沉积电位、沉积时间、扫描速率和调节电位的优化的图。
22.图6示出了使用包含增加浓度的铜离子的样本，比较具有aunp功能化的纸的传感器与非功能化的传感器的性能的曲线图。在方框中示出了相关的校准曲线。
23.图7示出了关于使用两种不同浓度的铜离子(200ppb和300ppb)的根据图1的优选实施方式的传感器的测试的曲线图。
24.图8示出了说明与其中aunp预先构成并沉积在纸上的相似传感器相比其中aunp已被原位功能化的根据图1的优选实施方式的传感器的性能的曲线图。
25.图9示出了显示与非功能化的纸载体相比在用金属纳米颗粒使纸功能化的情况下使用-0.3v至-0.5v的还原电位可通过免疫酶促传感器检测的h2o2(过氧化氢)的测定的不同准确度的曲线图，h2o2(过氧化氢)是多种酶反应的经典产物。
26.图10示出了显示原位形成的金属纳米颗粒如何分布的扫描电子显微镜(sem)图像。图10a和图10b与功能化的纸有关，而图10c与非功能化的纸有关。
27.图11示出了通过动态光散射(dls)分析检测到的原位形成的金属纳米颗粒的尺寸的分布图。
28.图12示出了比较在用aunp功能化的(修饰)的纸上的免疫酶促传感器的性能和在非功能化的纸上的免疫酶促传感器的性能的图。
具体实施方式
29.根据本发明的用金属纳米颗粒使纤维素载体功能化的方法包括以下步骤：在纤维素载体上沉积浓度为1mm至6mm的酸或盐形式的金属前体的单一水溶液；并且将纤维素载体
在65℃至80℃的温度放置10分钟至40分钟。
30.对于金属纳米颗粒的功能化，不需要添加还原化合物。相反，溶液仅在于(consist in)金属前体。
31.优选地，金属前体的水溶液是四氯金酸(haucl4)的溶液，优选浓度为约2.5mm。可替选地，可以使用以下溶液：银盐的溶液，银盐优选地硝酸银(agno3)和乙酸银(agch3coo)；铋盐的溶液，铋盐优选地硝酸铋(bi(no3)3)；钴盐的溶液，钴盐优选地乙酸钴(co(ch3coo)2)和硫酸钴(coso4)；亚硒酸(selenious acid,h2so3)的溶液；铜盐的溶液，铜盐优选地硫酸铜(cuso4)和乙酸铜(cu(ch3coo)2)；六氯铂酸(h2ptcl6)和铂盐的溶液，铂盐优选地四氯铂酸钾(k2ptcl4)；钯盐的溶液，钯盐优选地二氯化钯(pdcl2)和四氯钯酸钠(na2pdcl4)；镍盐的溶液，镍盐优选地氯化镍(nicl2)和硝酸镍(ni(no3)2)，从而分别获得银纳米颗粒、铋纳米颗粒、钴纳米颗粒、硒纳米颗粒、铜纳米颗粒、铂纳米颗粒、钯纳米颗粒和镍纳米颗粒。
32.可以考虑使用诸如控制气氛的特殊预防措施，以避免纳米颗粒的氧化。
33.纤维素载体优选为纸，更优选为滤纸。
34.沉积表面小于0.6cm2。优选地，沉积表面为0.2cm2至0.6cm2。
35.纤维素载体优选在约70℃的温度放置约30分钟。
36.通过上述方法，获得了用金属纳米颗粒功能化的纤维素载体。根据上述方法的特定处理和前体溶液允许获得插入纤维素结构中的纳米颗粒的特定结构特征，这赋予功能化载体电催化功能或分析物的集中(concentration)功能。
37.如下面在实施例11(图10)中所示，金属纳米颗粒在纤维素载体上形成聚集体，定义为热点(hot spot)，这与先前形成的且然后在稍后时间沉积在载体上的纳米颗粒形成的聚集体非常不同，并且相对于由使用金属前体溶液且随后使用具有还原化合物的溶液形成的纳米颗粒而形成的聚集体也非常不同。如在实施例12(图11)中进一步所示，金属纳米颗粒的平均尺寸等于196.2
±
20.7nm，多分散性指数等于0.13。
38.当用于电化学传感器时，根据本发明获得的较大尺寸的纳米颗粒允许更好的传导。结果是传感器的灵敏度提高，因此传感器能够用于检测诸如血清的生物流体中的金属。
39.如上所述的功能化的纤维素载体实际上可以用于制造单个电分析传感器或插入多传感器平台中以检测生物流体中的一种或多种标志物(分析物)。
40.根据本发明的用于检测生物流体中的标志物的电分析传感器的制造方法包括以下步骤。
41.提供纤维素载体。优选地，所述载体由纸形成，纸优选地滤纸或办公用纸，更优选地滤纸，特别是重量在60-85g/m2之间的滤纸，更优选地67g/m2，可以使用科尔代农斯(cordenons)，意大利(italy)或沃特曼(whatman)纤维素滤纸。
42.然后通过在天然亲水的纤维素载体上沉积疏水材料来划定亲水工作区。疏水材料可以是蜡并印刷在基底上。
43.如此划定的亲水工作区是金属前体的沉积区；优选地它小于0.6cm2，更优选地它对应于从0.2cm2到0.6cm2的范围。然后将浓度为从1mm至6mm的金属的酸或盐的形式的金属前体的单一水溶液沉积在纤维素载体的亲水工作区上。如上面已经描述的，仅包含金属前体的溶液优选为四氯金酸(haucl4)溶液，并且金属的酸性水溶液的浓度优选为约2.5mm。
44.然后将纤维素载体置于65℃至80℃(优选地70℃)的温度10分钟至40分钟，优选约
30分钟，从而在纤维素载体上形成金属纳米颗粒。
45.在纤维素载体的亲水工作区上，通过连续沉积导电油墨通过丝网印刷来印刷至少一个工作电极、一个参比电极和一个对电极。
46.优选地，金基油墨用于工作电极，银基/氯化银基油墨用于参比电极，石墨基油墨用于对电极。能够用具有过滤或屏障功能的材料涂覆工作电极以降低生物污染的风险并进一步提高传感器的性能。参照图1，工作电极相对于参比电极和对电极优选地印刷在中心位置。工作电极的面积可为约7mm2。
47.因此，根据本发明的用于检测生物流体中的标志物的电分析传感器包括用原位形成的金属纳米颗粒功能化的纤维素载体，在该纤维素载体上疏水区划定亲水工作区，所述亲水工作区包括通过丝网印刷印刷的至少一个工作电极、一个参比电极和一个对电极。
48.原位合成的纳米颗粒是金属的。金属优选为au、ag、bi、co、se、cu、pt、pd、ni。更优选地，金属纳米颗粒由au制成。
49.沉积表面小于0.6cm2。优选地，沉积表面为0.2cm2至0.6cm2。
50.生物流体优选为血液、血清、尿液或汗液或唾液或泪液或滑液(synovial fluid)，更优选为血液。
51.标志物优选为选自于由cu、fe、zn、pb、hg、cd和as组成的组的金属。更优选地，金属是cu。
52.在优选的实施方式中，工作电极是金，参比电极是银/氯化银，对电极是石墨。
53.在优选的实施方式中，传感器是免疫酶促的(immunoenzymatic)并且利用抗原-抗体相互作用来结合感兴趣的分子，然后通过酶促反应产生待测量的信号。具体地，传感器能够检测血清蛋白、转铁蛋白、铁蛋白、血红蛋白、维生素、抗体、细胞因子。免疫酶促传感器的标志物优选为h2o2、抗坏血酸、硝基苯酚、对苯二酚。
54.根据本发明的用于检测生物流体中的至少一种标志物的方法包括以下步骤：提供如前所述的传感器；向所述传感器添加1μl至80μl、优选20μl至40μl、更优选30μl的量的生物流体，其中所述生物流体可选地经过稀释或浓缩预处理；优选地，溶液的沉积发生在纸载体的单面上，因此发生在正面(在其上印刷电极的一面)或背面；更优选地它发生在正面上；在一个或多个通道中在传感器电极之间施加电位差，将标志物集中在工作电极上；和，通过恒电位仪检测与生物流体中的标志物的量成比例的电流信号。
55.优选地，施加允许分析物氧化和由此引起的电流信号的时变电位(time-varying potential)。更优选地，以确定的值施加随时间固定的电位(沉积电位(deposition poteintial))以减少和集中工作电极上的分析物，然后施加第二时变电位以允许分析物的氧化和由此引起的电流信号。
56.具体地，恒电位仪检测与生物流体中的标志物的浓度成比例的电流。
57.上述功能化的纤维素载体上的电分析传感器能够用于微流体平台，该微流体平台与印刷在纤维素或其他材料上的其他传感器结合。
58.实施例1-用于检测铜的传感器的制造
59.参照图2，通过固体油墨打印机(xerox colorqube 8580)在一张滤纸(67g/m2，cordenons，意大利)上印刷疏水蜡图案，这是划定其上将合成金纳米颗粒并印刷电极的区域所必需的。为了创建疏水屏障，将滤纸放在100℃的炉子中2分钟，以允许蜡在滤纸中融
化。
60.为了合成纳米颗粒，通过将载体在70℃放置30分钟将超纯蒸馏水中制备的4μl浓度为2.5mm的haucl4溶液沉积在由疏水屏障划定的区域上。
61.随后，在这个功能化的表面上，使用丝网印刷技术通过连续沉积导电油墨来印刷电极。为此，金基油墨(bq331，dupont，法国)用于工作电极，银/氯化银基油墨(electrodag 477 ss，acheson，意大利)用于参比，石墨基油墨(electrodag 421，acheson，意大利)用于对电极。对于氯化银和石墨油墨，每种油墨需要在70℃在烘箱中分别经过20分钟，而对于金油墨，需要在70℃在烘箱中经过40分钟。
62.相对于参比电极和工作电极在中心位置印刷金工作电极(直径＝7mm2)印刷。
63.将5μl的0.4m hcl沉积在电极的亲水区(半圆形区域)上，并在室温下使其蒸发，从而获得即用型传感器，而无需操作员添加除了样本之外的其他试剂进行分析。
64.铜离子的测量是通过将30μl待分析溶液(汗液样本)直接沉积在功能化区域上，与印刷电极直接接触并通过线性扫描阳极溶出伏安法(linear sweep anodic stripping voltammetry，ls-asv)在-0.5v至0.6v的电位范围内进行分析来进行的。
65.实施例2
66.为了实现实施例1的方法和传感器，优化了haucl4、溶液的体积和浓度、以及纳米颗粒的合成时间。在0.1m kcl中制备的5mm铁/氰亚铁酸盐的存在下，通过循环伏安法以0.05v/s的扫描速率监测优化步骤。
67.结果表示在图3中。图3a示出了沉积在纸上以合成金纳米颗粒(aunp)的haucl4溶液的浓度，图3b示出了沉积在纸上以合成金纳米颗粒(aunp)的haucl4溶液的体积。在0mm到15mm的范围内进行对浓度的研究，而在0μl与15μl之间对体积的研究进行评估。示出的点是在5mm铁/氰亚铁酸盐存在下通过循环伏安法以0.05v/s的扫描速率获得的阳极峰强度。所有实验一式三份重复。关于haucl4浓度的优化，当浓度大于2.5mm时，合成纳米颗粒的颜色如何变化是明显的。aunp的颜色取决于纳米颗粒的尺寸。暗色外观(aspect)表示不稳定的聚集体的形成。通过观察阳极电流强度也突出了这种行为：当haucl4浓度大于已被选为最佳浓度的2.5mm时，记录了较低的电流。
68.在优化浓度后，进行体积效果的评估。体积的影响主要是水溶液在测试区域中扩散的结果。如果体积太小，则液滴不会覆盖整个区域，如果体积太大(high)，则溶解物质会在外围积聚。最佳体积被确定为4μl。从图3b可以明显看出，该结果在aunp的电流强度和颜色/均匀性方面得到了证实。此外，很明显，大于或等于10μl的体积产生溶解在外围的物质的积聚效应。
69.最后一个优化步骤是关于加热时间和纳米颗粒的形成(数据未示出)。在70℃的温度30分钟时发现了理想的折衷方案。
70.实施例3
71.在实施例2中描述的优化之后，比较了具有功能化纸的传感器与具有非功能化纸的传感器的电化学性能。使用未改性的纸(图4a)和用aunp改性的纸(图4b)，在存在5mm铁/氰亚铁酸盐混合物的情况下通过扫描速率从0.02v/s到1v/s变化的循环伏安实验来评估电化学效率。
72.两个传感器均遵循randles-sevcik方程(i
p
＝(2.69
×
105)n
1.5
acd
0.5v0.5
)，电流与
扫描速率平方根之间的线性相关性证实了分析物的传质扩散。此外，这种行为与工作电极上不存在分析物捕获现象是一致的。
73.从图(图4a和图4b)中可以明显看出，滤纸中aunp的存在导致电流强度的增加(大约两倍)和电子到溶液/电极界面的转移的动力学的增加(当存在aunp纳米颗粒时，峰间间距(peak to peak separation)(δe)以20mv/s从210mv降低到140mv)。
74.实施例4
75.为了开发实施例1中描述的方法和传感器，优化了与阳极再溶解伏安法相关的用于检测铜的电化学参数。具体地，如图5中所示，评估了沉积电位、沉积时间、扫描速率和调节电位。已优化的第一参数(沉积电位)的初始条件为：t沉积(t dep)＝200s；扫描速率＝0.8v/s；e调节(e cond)＝0v。所有实验均在200ppb cu(ii)(在0.1m hcl溶液中制备)的存在下进行。
76.实施例5
77.由于铜离子的检测通常在高度酸性环境中进行，因此对其中aunp功能化的传感器首先用hcl浸渍然后干燥且然后施加铜离子溶液的过程和其中相同的传感器没有被浸渍而是施加包含hcl的铜离子溶液的过程进行了比较。在这两种情况下，获得了相同的灵敏度，这表明可以预先将hcl溶液应用于传感器，然后提供传感器以备使用，而无需操作员添加除了待分析的样本之外的其他试剂。
78.实施例6
79.如图6中所示，通过分析具有已知浓度的铜离子的蒸馏水获得校准曲线。将通过由aunp功能化的纸构成的传感器获得的结果与使用非功能化的传感器获得的结果进行比较。具体地，测试了从10μg/l到400μg/l的铜离子浓度。
80.功能化的纸的结果在图6中用实线表示，而非功能化的纸的结果用虚线表示。所有测量均通过使用实施例4中使用的参数用20μl双蒸水中的铜离子溶液浸渍工作区来进行。图6的内框示出了通过非功能化的纸和功能化的纸获得的校准曲线之间的比较。
81.功能化的纸的使用通过以下等式突出了电流强度(源自减去在不存在分析物的情况下获得的信号，y)与铜离子浓度(以μg/l，x表示)之间的线性相关性：y＝0.011x 0.252，r2＝0.995。检测限(3σb/方法灵敏度)计算为在不存在分析物时获得的信号的标准偏差(σb)的3倍与方法灵敏度之间的比值，定义为校准曲线的线性部分的斜率，结果为3μg/l，定量限等于10ppb。响应在10μg/l到400μg/l的范围内是线性的。从图6的内框可以看出，很明显，正是aunp的存在才允许检测铜离子。
82.实施例7
83.测试具有功能化的纸的传感器的性能，以检测汗液样本中的铜离子。将从用不同浓度的铜(200μg/l和300μg/l)进行体育活动的志愿者获得的20μl汗液沉积在传感器的工作区。如图7中所示，通过添加已知浓度的铜离子(200μg/l和300μg/l)并使用标准添加方法，能够量化汗液样本中铜离子的存在。
84.实施例8
85.通过执行两级回收率研究或验证结果(将结果与使用原子吸收光谱(aas)获得的结果进行比较)，成功评估了该方法的准确性，如下表1中所示。
86.表1
[0087][0088][0089]
未经处理的汗液中检测到的铜离子的水平符合生理值(25-2100μg/l)，与用于检测铜离子的参考方法(aas)的比较在实验的不确定度范围内提供了良好的相关性。
[0090]
实施例9
[0091]
在本实施例(图9)中，成功地证明了用金属纳米颗粒对纸进行功能化提高了免疫酶促型电化学传感器的产品的检测灵敏度。具体地，证明了使用aunp功能化的纸和通过施加优选在-0.3v与-0.5v之间的还原电位准确检测免疫酶促传感器标志物h2o2(过氧化氢)的能力增加。
[0092]
实施例10
[0093]
在本实施例中，示出了用预先构成的aunp对滤纸的功能化与或用从其原位产生纳米颗粒的金属前体对滤纸的功能化有很大不同。
[0094]
具体地，直接添加在纸上的预先构成的aunp对纸的功能化并没有产生良好的功能结果，因为纸没有获得电催化剂功能。从使用所提出的用于检测铜离子的传感器进行的测试中明显看出了这一点。如图8中所示，用于检测铜的传感器在印刷在直接用预先构成的aunp功能化的纸上时不起作用(电流峰是平的)。相反，当从金属前体开始对纸进行功能化时，效果更好。
[0095]
一种可能的解释是，纳米颗粒的原位合成允许金属前体插入纤维素网络中，并且从功能的角度来看，原位创建的纳米颗粒与沉积在纸上的纳米颗粒不同。
[0096]
实施例11
[0097]
为了研究aunp功能化的纤维素基底的形态特征，使用sem(扫描电子显微镜)进行更详细的结构分析。图10a-图10b和图10c分别示出了aunp功能化的纸和非功能化的纸的sem图像。详细地，显微镜显示aunp分散并吸附在纸表面上，形成热点(图10a和图10b)。在非功能化的纸上未检测到aunp(图10c)。
[0098]
实施例12
[0099]
为了了解纳米颗粒的尺寸分布，进行了动态光散射(dls)分析。dls测量显示了具有196.2
±
20.7nm的平均直径和0.13的令人满意的多分散性指数(pdi)的单分散aunp悬浮液(图11)。
[0100]
实施例13
[0101]
进行了一项模拟通用免疫传感器(具有与任何其他更具体的免疫传感器相当的活性)和用作标记的碱性磷酸酶的测试，以评估用金纳米颗粒原位功能化的纸是否改变了通过免疫传感器的信号检测。印刷在用原位形成的金纳米颗粒功能化的纸上的传感器的响应比印刷在相同未修饰的纸上的传感器给出的响应要好得多。具体地，将一剂在磷酸盐缓冲液(pbs)中制备的用碱性磷酸酶(1μg/ml)缀合的通用抗体(20μl)放置在印刷在纸上的电化学传感器上。然后加入酶试剂：70μl 1-萘基磷酸盐(5mg/ml，在a
–
mgcl2–
kcl缓冲液ph9.6中制备)。酶促反应2分钟后，以差分脉冲伏安法(dpv)测量源自该反应的电活性产物(1-萘酚)，参数如下：e开始＝-0.2v；e结束＝0.4v；e步长(estep)＝0.016v；e脉冲＝0.05v；t脉冲＝0.06秒；扫描速率＝0.016v/s。对于每个传感器(修饰的传感器或未修饰的传感器)，测量重复三次。结果示出在图12中。
[0102]
优点
[0103]
由于纤维素载体而不是用于电极印刷的油墨被金属纳米颗粒功能化的事实，因此在导电性或分析物向电极的集中方面，特别是在待测分析物是金属的情况下，获得了显著更好的传感器性能。事实上，在没有这种功能化的情况下，在检测生物流体的分析物时，生物流体样本在纸载体的多孔结构内的扩散通常阻止分析物在工作电极上的积聚。反之亦然，用金属纳米颗粒对纤维素载体的功能化使得即使在低浓度(低于20ppb)下也能检测分析物，这用印刷在非功能化的纤维素上的传感器是无法突出显示的。此外，使用功能化的载体比使电极功能化更有利：特别是，通常难以将基于有机物的导电油墨与水溶液中的纳米颗粒混合。相反，在本方法中，金属纳米颗粒直接形成在纸的结构中，而不需要使用额外的还原剂，诸如硼氢化钠、抗坏血酸或柠檬酸盐。同样从功能的角度来看，即使与单个电极的几何形状和构成材料无关，根据所述优化方法原位合成的金属纳米颗粒也具有重要的优势：事实上，使用预构成的金属纳米颗粒并没有获得同样令人满意的性能。
[0104]
此外，使用所提出的方法制造电分析传感器不涉及使用新技术，因此能够使用已经用于印刷电极的工业制造的工艺和机器很容易地实现。最后，根据所述方法用金属纳米颗粒功能化的纤维素载体也能够用于多个传感器的微流体平台。