制备水凝胶微球的方法和系统与流程

1.本发明公开内容属于流体学和聚合物化学领域，并且涉及制备微球的方法。特别地，本发明涉及制备水凝胶微球的方法和系统。本发明还包括水凝胶微球在分子生物学和生物化学技术中的用途。


背景技术：

2.亲水性聚合物，尤其是其交联形式(被称为水凝胶)，是一类生物已经显示出用于生物和医学应用的巨大潜力的材料。特别地，水凝胶由于其可调节的化学和三维物理结构、高水含量、良好的机械性质和生物相容性而吸引了广泛的研究兴趣(peppas等，2003,adv.mater.18:1345-1360)。
3.微球是通过使生物聚合物胶凝化而形成基质型结构而获得的生物聚合物微珠。通常，微球通过挤出/滴制法或通过乳液方法制备。可以应用挤出或乳化技术来制备直径范围为0.3至3mm的球形聚合物珠粒(krasaekoopt等，2003,int.dairy j.,13:3-13)。
4.两种技术中的第一步是将生物材料与聚合物溶液混合以产生悬浮液，然后将其通过毛细管挤出以产生液滴，所述液滴收集在发生胶凝(离子性或热性)的浴槽中，或分散在连续相中，从而施加混合以形成稳定的w/o乳液。
5.brandenberger等(journal of electrostatics 45(1999),monodisperse particle production:a method to prevent,drop coalescence using electrostatic forces)教导了一种开发用于在无菌条件下将细胞固定在聚合物珠粒中的系统。由于液滴聚并而产生的错误颗粒受到抑制。
6.schneider等(journal of applied physics volume 38,number 6may 1967)教导了根据喷射参数和施加的频率对液滴尺寸、半径和间距的理论表达，并且他们通过实验验证了这一点。
7.挤出是用水胶体制备胶囊的最常用方法，并且可以通过简单地将水性溶液滴入胶凝浴槽中来实现。挤出珠粒制备技术(如静电、同轴气流、振动、雾化或喷射式切割机)是基于施加额外的力以产生比通过简单滴制法制备的那些更小的球。颗粒的尺寸可以通过选择针直径和操纵出口与聚合溶液之间的距离和电参数来调节。尽管它们很普遍，但上述常规方法存在一些局限性，例如主要由于悬浮液滴的聚并和/或破裂问题而产生表现出大粒度分布的珠粒。此外，使用已知方法制备均匀尺寸的聚合物珠粒通常不适合大规模生产。对于具有小颗粒尺寸(例如《300μm)的珠粒，目前的喷射方法还具有高成本和低产量的缺点。此外，这些系统中的一些需要非常复杂的设备和复杂的方法来形成聚合物，这在一些情况下对于小规模应用是有限的，而不能很好地适合于工业放大。
8.此外，当使用水凝胶珠粒包埋生物材料时，这种珠粒在无菌条件下的生产是昂贵的，并且可能限制它们在工业规模上的使用。在这种情况下，具有挑战性的方面是为包埋的活性分子提供合适的保护，以防止在水凝胶珠粒的加工和储存过程中的生物降解。
9.因此，期望提供一种有效且高生产率的方法用于制备具有均匀尺寸分布(通常直
径为1μm至500μm)的水凝胶珠粒，其中可以避免与常规方法相关的限制。


技术实现要素：

10.考虑到影响水凝胶珠粒制备中的当前方法的上述限制，本发明的目的是提供用于制备包埋或共聚感兴趣的生物材料的水凝胶微球的有效方法以及用于实施本文所公开的方法的系统。
11.因此，本发明的第一方面涉及用于制备水凝胶微球的方法，所述方法包括以下步骤：
12.a.通过毛细管在气相中产生第一流体的受控尺寸的液滴，
13.b.将所述第一流体的液滴分散到包含第二流体的接收器中，其中所述第一流体与所述第二流体不混溶，并且其中所述第二流体的密度低于所述第一流体的密度，
14.c.使所述第一流体的液滴与所述第二流体接触，从而产生水凝胶微球，
15.d.从所述第二流体回收所述水凝胶微球用于储存。
16.本发明的第二方面涉及可通过根据本发明第一方面的方法获得的水凝胶微球。
17.本发明的第三方面包括一种水凝胶微球，其包含：
18.a.固体核心，其包含第一类型的物质，
19.b.任选地，一个或多个外固体壳，
20.其中所述一个或多个外固体壳中的每一个包含第二类型的物质。
21.本发明的第四方面涉及一种用于制备根据第二和第三方面中任一方面的水凝胶微球的系统，所述系统包含：
22.a.毛细管模块，所述毛细管模块在气相中喷射第一流体，从而产生当所述第一流体从所述毛细管模块喷出时获得的第一流体的液滴，
23.b.用于收集第一流体的液滴的接收器，所述接收器包含第二流体，其中所述第二流体的密度低于所述第一流体的密度，
24.c.试剂，所述试剂用于引发所述第一流体的聚合。
附图说明
25.图1示出了执行根据本发明的方法的一种方式。如图1所示，形成射流(3)的毛细管(2)产生第一流体(1)的液滴(4)。液滴(4)在穿过气相(未示出)之后与第二流体形成接触，所述第二流体包含具有不同密度的两个不同子流体(5,7)，它们与第一流体(1)不混溶。子流体(7)的密度高于所述第一流体(1)的密度，而子流体(5)的密度低于第一流体(1)的密度，从而确定液滴(6)的悬浮。液滴(6)被捕获在两个子流体(5,7)之间的界面处。子流体之一(7)包含引发液滴(6)中第一流体(1)的聚合所需的试剂。在第一流体(1)的聚合过程结束时，液滴(6)转化为微球(8)。
26.图2示出了执行根据本发明的方法的另一种方式。如图2所示，形成射流(3)的毛细管(2)产生第一流体(1)的液滴(4)。液滴(4)在穿过气相(未示出)之后与第二流体(9)形成接触，所述第二流体与第一流体(1)不混溶。第二流体(9)的密度低于第一流体(1)的密度。第二流体(9)包含引发液滴(6)中第一流体(1)的聚合所需的试剂。在液滴(6)中第一流体(1)的聚合过程结束时，液滴(6)转化成微球(8)。
27.图3示出了执行根据本发明的方法的另一种方式。如图3所示，形成射流(3)的毛细管(2)产生第一流体(1)的液滴(4)。液滴(4)在穿过气相(未示出)的同时经受由源(10)产生的辐射。辐照引发聚合过程。液滴(4)在穿过气相之后与包含一个子流体(9)或多个子流体(5,7)的第二流体形成接触，所述第二流体与第一流体(1)不混溶。该一个子流体(9)的密度高于第一流体(1)的密度。在存在多个子流体(5,7)的情况下，第一子流体(7)的密度高于第一流体(1)的密度。第二子流体(5)的密度低于第一流体(1)的密度，从而确定液滴(6)的悬浮。子流体(5,7)之一可以包含完成液滴(6)中第一流体(1)的聚合所需的试剂。在第一流体(1)的聚合过程结束时，液滴(6)转化为微球(8)。
28.图4a-c示出了执行根据本发明的方法的另一种方式。如图4a所示，毛细管(2)产生包含两相流体的第一流体(1)的液滴(14)。包括核心(13)和壳(12)的液滴(14)在穿过气相(未示出)之后与包含具有不同密度的两个不同子流体(5,7)的第二流体形成接触，所述子流体与第一流体(1)不混溶。第一子流体(7)的密度高于第一流体(1)的密度。第二子流体(5)的密度低于第一流体(1)的密度，从而确定液滴(6)的悬浮。液滴(14)被捕获在两个子流体(5,7)之间的界面处。子流体(7)之一包含彼此独立地引发核心(13)和/或壳(12)的聚合所需的试剂。在第一流体(1)的聚合过程结束时，液滴(14)转化成微球(15)。如图4b所示，毛细管(2)产生包含两相流体的第一流体(1)的液滴(14)。包含核心(13)和壳(12)的液滴(14)在穿过气相(未示出)之后与第二流体(9)形成接触，所述第二流体与第一流体(1)不混溶。第二流体(9)的密度低于第一流体(1)的密度。第二流体(9)包含彼此独立地引发核心(13)和/或壳(12)的聚合所需的试剂。在第一流体(1)的聚合过程结束时，液滴(14)转化成微球(15)。图4c描绘了包含核心(13)和壳(12)的水凝胶微球(14)。
29.图5示出了执行根据本发明的方法的另一种方式。特别地，图5示出了产生液滴的另一种方式。如图5所示，连接到毛细管的泵推动水性流体(例如，非聚合凝胶)的混合物。毛细管穿过连接到交流发电机(ac)的压电材料。压电材料使从毛细管喷射的流体失稳定，并且使得能够产生具有相同尺寸的液滴。然后使用设定为直流电以对液滴充电的圆筒形电极将液滴分散为锥形。然后将带电的液滴分散到含有补充或不补充表面活性剂的十二烷的容器中。最后，水凝胶微球的产生可根据本文所述的任何聚合方法发生。
30.图6在a.中显示使用微流体方法(如实施例1所述)产生的水凝胶微球(hgb 20200930)作为对照。b和c描绘了使用图5中所描述的一般设置、采用根据本发明的方法(如实施例1中所述)制备的水凝胶微球的重复制品(hgb20200513和hgb20200526)。这两个批次(b和c)是在两个不同的日期制备的，并且呈现与左侧对照批次(a)相似的性质。在本发明(b和c)的情况中，如图5和实施例1中所述设置，其中不同的仪器设定为以下值：交流电(ac)：频率40khz，正弦波；直流电(dc)：2.5v，5vpp的放大；注射泵：9ml/h；水性混合物：20ml丙烯酰胺凝胶化学品(参见表1)；凝胶浴槽：用疏水性溶液预处理(参见表2)。用于对照(a)和根据本发明的方法的流速如下：微流体方法(a)：流速为1.4ml/h，本发明(b和c)：流速为9ml/h。
具体实施方式
31.本文提供了一种使用用于滴落聚合物溶液的毛细管和在其中发生聚合物溶液的凝胶化/聚合过程的单独浴槽快速且可靠地制造具有受控尺寸和形状的水凝胶微球的方
法。
32.在第一方面，本发明提供了用于制备水凝胶微球的方法，所述方法包括以下步骤：
33.a.通过毛细管在气相中产生第一流体的受控尺寸的液滴，
34.b.将所述第一流体的液滴分散到包含第二流体的接收器中，其中所述第一流体与所述第二流体不混溶，并且其中所述第二流体的密度低于所述第一流体的密度，
35.c.使所述第一流体的液滴与所述第二流体接触，从而产生水凝胶微球，
36.d.从所述第二流体回收所述水凝胶微球用于储存。
37.在本发明的情况中，术语“微球”是指生物聚合物凝胶网络(水凝胶)的固体颗粒，特别地，尽管不是必然地，是指球形颗粒，其直径为1μm至500μm、优选30至150μm、更优选45至75μm。对于非球形颗粒，所述直径意图指颗粒的最大尺寸。如本文所用，术语“微球”和“珠粒”可互换使用。
38.根据本发明的微球是生物相容的、亲水的和无毒的，并且包含至少一种交联的高吸水性或超吸收性聚合物，例如水凝胶。本文所用的术语“水凝胶”是指水可溶胀的凝胶。
39.在一个实施方案中，所述第一流体包含可在特定条件下聚合的单体。如本文所用，术语“单体”是指可通过暴露于辐射或通过聚合活化剂和/或引发剂试剂聚合的反应性组分。术语“单体”也在jenkins等1996,glossary of basic terms in polymer science,pure appl.chem.68(12):2287-2311中定义。
40.本发明的单体或单体材料包括但不限于丙烯酸单体、聚丙烯酰胺单体、聚乙酸乙烯酯单体或其共聚物。
41.在一个实施方案中，单体或单体材料基本上是亲水性的。这意味着微球含有至少一种亲水性单体，但是也可以包括疏水性单体或共聚物的存在，只要微球的总体特性基本上是亲水性的而不是疏水性的。
42.在本发明的一个实施方案中，第一流体和/或第二流体包含表面活性剂。第一流体中表面活性剂的存在旨在快速重新定位在分散液滴的表面。第二流体中表面活性剂的存在旨在限制聚并。在本发明的上下文中，术语“表面活性剂”对于第一流体是指离子型表面活性剂，并且对于第二流体是指非离子型表面活性剂，其显示出1至10的亲水亲油平衡(hlb)值。表面活性剂的hlb是根据griffin w.c.1954,calculation of hlb values of non-ionic surfactants,j.soc.cosmet.chem.5(4):249-256中所公开的方法计算的。合适的表面活性剂的非限制性实例是具有低hlb值的脱水山梨糖醇脂肪酸酯(span)，例如span 20、span 40、span 60、span 65、span 80、span 85。合适的表面活性剂的另一个实例是em 90(cetyl peg/ppg-10/1聚二甲基硅氧烷)，一种基于硅氧烷的非离子w/o乳化剂。
43.如本文所用，术语“液滴”是指被另一种流体(例如气态流体或液态流体)包围的第一流体的隔离部分。所述液滴可以是球形、基本上球形或具有其它不规则形状，这取决于外部环境。
44.如本文所用，术语“毛细管”是指能够输送流体的管、通道或其它结构。毛细管的几何形状可以包括具有圆形、矩形或方形横截面的管，并且可以通过多种技术制造。在一些情况下，可以对毛细管的内表面进行化学改性以优化其表面性质。
45.本文所用的毛细管是包括不同模块的系统的一部分。特别地，毛细管(或毛细管模
块)连接到泵模块，所述泵模块迫使包含在毛细管中的流体通过针挤出以产生液滴。
46.在本发明的上下文中，制备和分散液滴的步骤均可由共同的力控制(例如泵)，所述共同的力施加了液滴制备和分散所需的力和流速。或者，制备和分散液滴的步骤可由不同的力控制，例如，压电材料的脉冲产生液滴，而分散步骤由重力控制。如本文所用，术语“重力”是指万有引力，并且涉及由于重力而施加在物体上的力。
47.一旦第一流体的液滴被毛细管挤出(分散步骤)，其在一段确定的飞行时间内穿过气相，然后接触接收器浴槽中所包含的第二流体。在本发明的上下文中，术语“气相”是指气态流体，例如空气、蒸气或任何其它气体。
48.在一个实施方案中，分散步骤包括在第一流体的液滴接触第二流体之前穿过气相的步骤。
49.毛细管的尖端和包含在接收器中的第二流体的表面之间的距离足以允许流体射流与液滴之间的转化。
50.在从毛细管中挤出之后，所述液滴显示出受控的尺寸。如本文所用，术语“受控尺寸”是指喷出的液滴的均匀体积。该值与液滴的形状无关。液滴的尺寸可以例如通过测量液滴的平均直径或其它特征尺寸来确定。液滴群的“平均直径”是指液滴直径的算术平均值。本领域技术人员知道如何确定液滴群的平均直径，例如使用激光散射或其它已知技术。
51.发明人已经发现，通过向第一流体施加电场，可以控制液滴的尺寸。施加在压电材料上的电压使第一流体的射流失稳定，并以高频率赋予喷出的液滴固定的尺寸(regular size)。
52.因此，所要求保护的方法以受控的方式导致更高的生产量。
53.在一个实施方案中，所述方法还包括额外步骤，其中所述第一流体(1)和/或液滴穿越电场。
54.在另一个实施方案中，穿过所述气相的步骤任选地包括使用选自uv、微波和红外线的辐射。
55.已经发现，在液滴的飞行时间期间使用辐射可以有利地在液滴接触第二流体之前引发液滴的聚合过程。
56.在第一方面的一个实施方案中，所述第一流体包含至少一种物质，其选自蛋白质、聚乙二醇、多糖及其衍生物。包含在所述第一流体中的物质的非限制性实例是藻酸盐、壳聚糖、琼脂糖、透明质酸、聚乙二醇(peg)衍生物(peg叠氮化物、peg炔烃、peg丙烯酸酯、peg二丙烯酸酯、peg硫醇)、丙烯酰胺、丙烯酰胺衍生物、弹性蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白和明胶。
57.如本文所用，术语“流体”是指能够流动的任何物质，例如液体或乳液。在一些实施方案中，所述流体可以是水基流体、油基流体、油包水乳液或水包油乳液。
58.根据本发明的包含第一流体的液滴经受聚合过程以形成水凝胶微球，其中所述微球含有颗粒、蛋白质、细胞、dna、rna、代谢物、化学化合物或其它合适的物质。如本文所用，术语“聚合”和“凝胶化”可互换使用。
59.在另一个实施方案中，在分散和接触步骤期间，所述液滴任选地包含外部流体层。
60.外部流体层的存在(其可以是永久的或暂时的)旨在在聚合过程中保护液滴并防止聚并效应。
61.在本发明的上下文中，外部流体层例如由藻酸盐形成。藻酸盐的物理性质通过第
二流体中包含的钙浓度控制。
62.用于产生涂覆所挤出液滴的外部流体层的方法是本领域已知的。例如通过将两种或更多种不混溶的流体通过同心喷嘴共挤出或通过空气中包封方法(alessandri等，2013,pnas 110(37):14843-14848；visser等，2018,sci.adv.4(1):eaao1175)，可获得涂覆的液滴。
[0063]“使第一流体的液滴与第二流体接触”的步骤是指将包含第一流体的液滴掺入第二流体中。
[0064]
液滴表面和第二流体之间的界面提供交换的表面，其允许包含在第二流体中的试剂(例如聚合活化剂和/或引发剂试剂)与包含在第一流体中的物质相互作用，从而引发该物质的聚合过程。
[0065]
本发明的水凝胶微球通过使第一流体的液滴在包含第二流体(其与第一流体不混溶)的溶液中聚合而获得，并产生水凝胶在所述第二流体中的悬浮液。
[0066]
然后可通过过滤或离心收集水凝胶微球，并对其进行洗涤和任选地灭菌。由于悬浮聚合从分散的液滴开始，因此在聚合之后将获得球形微球。
[0067]
由于所述第一流体可包含颗粒、蛋白质、细胞、dna、rna、代谢物、化合物或其它合适的物质，水凝胶微球的回收可以是复杂的过程。在大多数情况下，使用选择性溶解或萃取来纯化微球。van hee等2006,biotechnology and bioengineering,94(4):689-709公开了回收生物颗粒的示例性方法。
[0068]
在一个实施方案中，所述第一流体包含至少一种物质，其选自蛋白质、聚乙二醇、多糖、丙烯酰胺及其衍生物。
[0069]
本文所公开的第二流体可包括一个或多个不同的子流体。
[0070]
如本文所用，术语“子流体”是指不与第一流体混溶的任何流体。作为非限制性实例，子流体可以是油或其衍生物。
[0071]
在一个实施方案中，所述第二流体包含一个子流体，其选自天然存在的油、合成油及其混合物。
[0072]
在另一个实施方案中，所述第二流体包含两个子流体，其选自天然存在的油、合成油，其中所述两个子流体具有不同的密度。
[0073]
在一个实施方案中，所述两个子流体是不混溶的。
[0074]
在一个实施方案中，所述接触步骤包括在受控温度下的温育步骤。
[0075]
在该温育步骤期间，在聚合活化剂/引发剂试剂的存在下在约20℃至约90℃范围内的温度下进行聚合过程。温度和温育时间是可变参数并且取决于进行聚合的单体分子。例如，当单体为丙烯酰胺时，聚合温度为65℃。
[0076]
类似地，聚合过程由活化剂和/或引发剂试剂引发，所述活化剂和/或引发剂试剂可以适当地根据进行聚合的单体分子选择。当单体分子是丙烯酰胺时，聚合活化剂和/或引发剂试剂选自temed、核黄素、过硫酸铵(aps)。
[0077]
在一个实施方案中，所述第一流体包含选自temed、核黄素、过硫酸铵(aps)的聚合活化剂和/或引发剂试剂。优选地，聚合活化剂/引发剂试剂有利地选自过硫酸铵(aps)和四甲基乙二胺(temed)。
[0078]
在一个实施方案中，所述第二流体包含选自temed、核黄素、过硫酸铵(aps)的聚合
活化剂和/或引发剂试剂。优选地，聚合活化剂/引发剂试剂有利地选自过硫酸铵(aps)和四甲基乙二胺(temed)。
[0079]
通过在光存在下在水溶液中形成自由基，核黄素是page中公知的光聚合试剂。通常加入催化剂temed或dmapn以加速自由基的形成。自由基将引发丙烯酰胺聚合。
[0080]
当所述第二流体包含两个子流体时，所述第二流体的一个或两个子流体可以包含聚合活化剂和/或引发剂试剂。
[0081]
然后由此获得的水凝胶微球可以通过本领域已知的方法回收(例如倾析和过滤)，并在其储存之前进行洗涤步骤以消除任何污染。
[0082]
在另一个实施方案中，所述第一流体的液滴包含电荷。
[0083]
在本发明的上下文中，术语“电荷”是指放电单元的输出，其经由空气将电流输送到第一流体的表面。电荷可以通过连接到放电单元的电极或其它合适的输送源输送。
[0084]
在一个实施方案中，所述第一流体包含围绕所述第一流体的额外流体(例如第三、第四、第五流体)，所述额外流体相对于毛细管内的第一流体沿相同方向、平行且同心地流动。
[0085]
在另一个实施方案中，每种额外流体包含独立地选自颗粒、蛋白质、细胞、dna、rna、代谢物、化学化合物的单一物质。
[0086]
根据第二方面，本发明提供了可通过根据第一方面的方法获得的水凝胶微球。
[0087]
在其它实施方案中，根据本文所公开的方法制备的水凝胶微球尺寸均匀。
[0088]
通过使用本文所公开的方法获得的水凝胶微球可呈现简单的结构，该结构由包埋单一物质(例如，蛋白质、单细胞、dna、rna、代谢物、化学化合物)的聚合的第一流体表示；以及呈现更复杂的结构，其中包含在额外流体中的不同物质可被包埋在相应的聚合的额外流体中。因此，当一种或多种流体与第一流体一起在毛细管中流动时，从毛细管喷射的所得液滴和相应的水凝胶微球可具有多层结构(例如，核-壳结构)，其中各层包含单一物质。
[0089]
鉴于其独特的结构，本文所公开的水凝胶微球可具有不同的应用。水凝胶微球应用的非限制性实例是美国专利申请no.2018/0304222a1中公开的用于dna/rna测序的方法和/或国际pct申请no.2018/167218a1中公开的用于对单细胞进行基因分型的方法。
[0090]
在本发明的另一方面，所述水凝胶微球包含：
[0091]
a.固体核心，其包含第一类型的物质，
[0092]
b.任选地，一个或多个外固体壳，
[0093]
其中所述一个或多个外固体壳中的每一个包括第二类型的物质。
[0094]
在本发明的上下文中，水凝胶微球可通过本文所公开的方法获得。水凝胶微球可以意指包含第一类型的物质的珠粒。
[0095]
在一些实施方案中，水凝胶微球包含中心部分(固体核心)，其任选地被一个或多个包含第二类型的物质的外固体壳包围。
[0096]
如本文所用，术语“核心”和“壳”仅旨在标识所述珠粒的不同部分，其中“核心”被一个或多个“壳”包围。如本文所用，术语“固体壳”和“固体核心”是指聚合材料的一部分。
[0097]
在另一个实施方案中，第一和第二类型物质独立地选自颗粒、蛋白质、细胞、dna、rna、代谢物、化学化合物及其组合。
[0098]
如本文所用，术语“化学化合物”是指旨在于通过外部反应物如聚合诱导剂(例如
引发剂、催化剂)和/或外部影响如uv、温度、声波、压力提供的激活下产生组织为凝胶的网络或凝胶的分子。
[0099]
如本文所用，术语“代谢物”是指从活生物体中生物分子的化学变化获得的化合物。例如，如果生物分子是碳水化合物，代谢物可以是糖类等。
[0100]
根据本发明的水凝胶微球可以由几种物质组成。例如，微球可硬化以形成凝胶，其中所述微球含有颗粒、蛋白质、细胞、dna、rna、代谢物、化学化合物，其它合适的物质或者颗粒、蛋白质、细胞、dna、rna、代谢物、化学化合物或其它合适物质的组合物。
[0101]
包含核/壳结构的水凝胶微球的一个优点在于具有不同性质的多层结构本身。水凝胶微球可暴露于反应物，所述反应物可直接与微球或与颗粒、蛋白质、细胞、dna、rna、代谢物、化学化合物相互作用。例如，颗粒或蛋白质可以经受各种分子的特异性结合。作为一个具体的实例，包含在凝胶颗粒中的dna可以进行连接、聚合酶链式反应(pcr)扩增或任何类型的常见分子生物学反应。在分子生物学反应之后，通过但不限于交联或氢键将分子(通常为dna)添加到水凝胶中。在本发明的一个实施方案中，可以形成具有结合的dna或其它分子的水凝胶微球。另一个实例是蛋白质、颗粒、细胞或任何其它物质之间的相互作用，它们可以与相同类型或不同类型的其它外部物质相互作用。本发明描述了几种方法，其目的是使用毛细管进行混合喷射来制备具有和不具有颗粒、蛋白质、细胞、dna、rna、代谢物、化合物或其它合适物质的微球。
[0102]
如本文所用，术语“颗粒”是指包含凝胶颗粒的微粒，例如水凝胶颗粒、聚合物颗粒、磁性颗粒、可光活化颗粒、可x射线活化颗粒或光可激活颗粒。
[0103]
在另一方面，本发明提供了用于制备本文所公开的水凝胶微球的系统，所述系统包括：
[0104]
a.毛细管模块，所述毛细管模块在气相中喷射第一流体，从而产生在第一流体从所述毛细管模块喷出时获得的第一流体的液滴，
[0105]
b.与所述毛细管模块分离的接收器，以用于收集第一流体的液滴，所述接收器包含第二流体，其中所述第二流体的密度低于所述第一流体的密度，
[0106]
c.试剂，所述试剂用于引发第一流体聚合。
[0107]
在另一个实施方案中，根据本发明的系统进一步包括：
[0108]
a.泵模块，
[0109]
b.储器模块，以及
[0110]
c.检测器模块。
[0111]
所述泵模块提供受控压力以产生第一流体的受控流速。所述泵模块还控制第一流体的喷射和/或抽吸。
[0112]
管道系统将泵模块连接到毛细管模块。管道系统也连接到储器模块。
[0113]
在另一个实施方案中，根据本发明的系统进一步包括：
[0114]
g.并入到毛细管内部的压电材料，
[0115]
h.连接到电压放大器的导电环，
[0116]
i.接收器。
[0117]
放大器通常连接到函数发生器。
[0118]
微球性质的产生由外部模块监测。通常使用显微镜或本领域已知的任何其它传感
器进行检测。
[0119]
如本文所用，术语“接收器”是指旨在容纳第二流体的容器或器皿，其中第一流体的液滴聚合成水凝胶微球在其中发生。因此，接收器还用于收集第一流体的液滴以及水凝胶微球。容器中的温度可以被控制或不被控制。
[0120]
根据本发明的方法获得的水凝胶微球具有广泛的应用。本文所公开的水凝胶微球的应用的非限制性实例为用于进行生物反应的微流体装置。
[0121]
实施例
[0122]
实施例1
[0123]
凝胶混合组合物：
[0124]
表1：丙烯酰胺凝胶化学品
[0125]
试剂终浓度10mm tris-hcl[ph7.6]10mm1mm edta1mm15mm nacl15mm丙烯酰胺6.20％(v/v)双-丙烯酰胺0.18％(w/v)过硫酸铵20％**0.30％链霉亲和素丙烯酰胺*2mg/ml
[0126]
*链霉亲和素丙烯酰胺旨在为凝胶提供特定功能。可以改变该试剂以适应该功能，并用dna、具有化学基团的修饰dna、化学功能、蛋白质(但不限于此)代替链霉亲和素。该试剂在丙烯酰胺凝胶中共聚或可简单地捕获在凝胶内。
[0127]
胶凝浴槽中的油混合组合物：
[0128]-烃油(密度低于凝胶混合组合物，通常为十二烷，密度为750kg/m3；水为997kg/m3)
[0129]-表面活性剂＝》span 85或agil em 90，从0,01至20％
[0130]-temed＝》0.004％至2％，优选0.04％
[0131]
**aps可被核黄素代替,在微球生成期间作为光引发剂。
[0132]
胶凝浴槽
[0133]
将形成的微球收集在含有补充表面活性剂(例如span85)的十二烷的收集器中。
[0134]
引起液滴与两种反应物(包含在液滴中的过硫酸铵(aps)和分散在十二烷中的四甲基乙二胺(temed))发生聚合。temed在液滴内自然扩散。将胶凝浴槽保持在65℃以引发聚合或可在液滴生成结束时移动以允许温度控制的温育。
[0135]
表2：胶凝浴槽：疏水溶液预处理
[0136]
试剂终浓度十二烷(稀释剂)-span 83-表面活性剂1％temed0.20％
[0137]
系统设置
[0138]
制备凝胶混合物，并使用控制通过毛细管的流速的泵来通过该系统喷射。然后将流速应用于系统内连续流动的液体。然后接通压电以在液滴产生步骤期间调节频率和液滴
尺寸。
[0139]
然后在油性浴槽和压电材料之间施加电场，以在增加形成锥体的液滴的分散，并冲击或进入收集浴槽之前限制聚并(例如，参见图5)。
[0140]
在本实施例中，使用了根据图5的液滴产生工作流程，其中不同的仪器已设置为以下值：
[0141]-交流电(ac)：频率40khz，正弦波
[0142]-直流电(dc)：2.5v，具有5vpp的放大
[0143]-注射泵：9ml/h
[0144]-水性混合物：20ml丙烯酰胺凝胶化学品
[0145]
在执行根据本发明的方法的本实施例中，使用9ml/h的流速执行上述工作流程。
[0146]
作为对照，使用微流体方法，施加1.4ml/h的流速。
[0147]
使用该工作流程获得的结果列于表3和图6中。
[0148]
表3：利用对照微流体方法产生的批次(hgb 20200930)与根据实施例1和图5中所描绘的总体设置使用本发明产生的水凝胶微球的两个重复制品(hgb 20200513和hgb 20200526)的比较。结果也示于图6中。
[0149][0150]
实施例2
[0151]
下文公开并参考图5的实验提供了产生根据本发明的水凝胶微球的替代方式。
[0152]
液滴产生模式：
[0153]
连续模式：利用泵采用连续水性相推动产生射流。射流在喷嘴处形成并通过压电材料使其失稳定，目的是促进和稳定液滴产生。
[0154]
按需滴落：压电材料可用于推出液滴，通过所施加的脉冲来介导。于是，液滴的产生并非由射流触发，而是仅由压电材料的定期接通/断开触发。