一种RNA检测与定量的方法与流程

dfhbi(3，5-difluoro-4-hvdroxybenzyli-dene imidazolinone)为筛选靶标，获得了称为“spinach”的核酸适配体。spinach与dfhbi结合后，可显著增强dfhbi的荧光信号。利用spinach-dfhbi复合物，他们首次实现了在哺乳动物细胞内对靶标rna的示踪 (paige et al.science.2011.333：642-646)。该课题组将“spinach”中的一个茎环结构换成可以特异性结合细胞代谢物的核酸适配体，开发了基于spinach-dfhbi复合物的可以检测细胞代谢物的工具(paige et al.science.2012.335：1194)。到目前为止，该方法已被成功用于细菌、酵母和哺乳动物细胞中的rna动态变化的监测及分析。之后，该课题组对核酸适配体分子及荧光团分别做了优化，获得了spinach2-dfhbi-1t，新复合物性质得到进一步提升。2014年，该课题组将selex与流式细胞分析术结合并筛选获得了 broccoli(filonov et al.journal oftheamerican chemical society.2014.136：16299-16308)， broccoli-dfhbi-1t相比于之前的spinach-dfhbi和spinach2-dfhbi-1t，在荧光强度、稳定性等各方面均有显著的提升。但是broccoli-dfhbi-1t依旧存在着镁离子依赖严重、光稳定性差的问题。2020年，该课题组对dfhbi-1t进一步优化，得到新的荧光团bi，最终获得新的复合物broccoli-bi(li et al.angewandte chemie international edition inenglish.2020.59：4511-4518)。2017年，该课题组还开发了corn-dfho复合物用于检测哺乳动物细胞rna聚合酶iii启动子的活性检测(song et al.nature chemical biology. 2017.13：1187-1194)。
6.2019年，来自中国的杨弋教授与朱麟勇教授构成的联合攻关团队在荧光rna领域取得了突破性进展。他们基于全新的分子设计理念设计合成了全新的荧光团分子hbc，并筛选得到了与之高度亲和的核酸适配体pepper。同时，在hbc基础上进行化学修饰，得到一系列衍生物，与pepper结合后的复合物光谱涵盖青色、绿色、橙色和红色。 pepper-hbc620复合物可以发出明亮的红色荧光，且有着较好的光稳定性，可以实现sim 超分辨成像。
7.综上所述，目前使用的rna标记技术都存在各自的缺点。mcp-fps标记技术存在着非特异性结合造成的本底荧光强，信噪比低。基于适配体-荧光团-猝灭剂构成的复合物的rna标记技术目前只在细菌中实现对rna的标记，还没有实现在哺乳动物细胞中标记rna。基于单荧光团-核酸适配体的rna标记技术看起来是非常完美的rna标记技术，然而受限于目前可供选择的可以生物正交的荧光rna种类少，且大多数复合物位于绿色波段，存在较强镁离子依赖性，光稳定差等，因而该技术也没有被广泛使用。因此，科研界和产业界一直都需要更加有效的荧光团-核酸适配体复合物，能克服此前荧光团-核酸适配体复合物的缺点，用于活细胞中的rna或dna的实时标记。
8.发明的简述
9.本发明提供了一种核酸适配体分子，编码该核酸适配体分子的dna分子，一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，以及该复合物的用途。
10.本发明提供的技术方案如下：
11.1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：
12.(a)核苷酸序列为：n1uguaguan
9-n
10-n
11
ggaagaauugaucucggn
29
，其中n1、n9、n
10
、n
11
和n
29
代表长度≥1个的核苷酸片段，并且n1和n
29
核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对，n9和nu核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对；
13.(b)与(a)限定的核苷酸序列具有至少58％同一性的核苷酸序列；
14.(c)在(a)限定的核苷酸序列中不包括n1、n9、n
10
、n
11
和n
29
的位置，经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或添加，且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。
15.2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中与(a)所述的paprika结构核苷酸序列具有至少58％，63％，67％，71％，75％，79％，83％，94％，96％，98％或100％同一性的序列。
16.3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的paprika结构核苷酸序列中不包括n1、n9、n
10
、n
11
和n
29
的位置，经过10个、9 个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。
17.4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括n1、n9、n
10
、n
11
和n
29
的位置，经过7个、6个、5个、4 个、3个、2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。
18.5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的 n1与n
29
互补配对时，n1核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，n
29
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
； n9与n
11
互补配对时，n9核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，n
11
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
。
19.6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子，其中当n1与n
29
中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则n1与n
29
核苷酸序列中至少有两对核苷酸碱基形成互补配对；当n9与n
11
中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则n9与n
11
核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对。
20.7.根据权利要求1-6任一项所述的核酸适配体分子，其中对通式paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：u2a、u2c、u2g、g3a、g3u、g3c、u4a、u4c、u4g、 a5u、a5c、a5g、g6a、g6u、g6c、u7a、u7c、u7g、a8u、a8c、a8g、g12a、 g12u、g12c、g13a、g13u、g13c、a14u、a14c、a14g、a15u、a15c、a15g、 g16a、g16u、g16c、a17u、a17c、a17g、a18u、a18c、a18g、u19a、u19c、 u19g、u20a、u20c、u20g、g21a、g21u、g21c、a22u、a22c、a22g、u23a、 u23c、u23g、c24a、c24u、c24g、u25a、u25c、u25g、c26a、c26u、c26g、 g27a、g27u、g27c、g28a、g28u、g28c、a5u/u25a、a5c/u25g、a5g/u25c、 g6a/c24u、g6u/c24a、g6c/c24g、u4a/g12a、u4a/g13u、u4a/g16a、u4a/u20c、 u4a/a22c、g12a/g13u、g12a/g16a、g12a/u20c、g12a/a22c、g13u/g16a、 g13u/u20c、g13u/a22c、g16a/u20c、g16a/a22c、u20c/a22c、u4a/g12a/g13u、 u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/a22c、g12a/g13u/g16a、 g12a/g13u/u20c、g12a/g13u/a22c、g13u/g16a/u20c、g13u/g16a/a22c、 g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g13u/g16a/u20c、u4a/g12a/g13u/g16a/a22c、 u4a/g13u/g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g16a/u20c/a22c、 u4a/g12a/g13u/u20c/a22c、a5u/u25a/u4a/g12a/g13u、a5u/u25a/u4a/g12a/g16a、a5u/u25a//u4a/g12a/g16a、 g6a/c24u/u4a/g12a/a22c、g6a/c24u/g12a/g13u/g16a、 g6a/c24u/g12a/g13u/u20c、g6a/c24u/g12a/g13u/a22c。
21.8.根据权利要求7所述的核酸适配体分子，其中对通式paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：u2a、u2c、u2g、u4a、u4c、u4g、a5c、a5g、g6u、u7a、 u7c、u7g、a8u、a8c、a8g、g12a、g12u、g12c、g13a、g13u、g13c、a14u、 a14c、a14g、a15u、a15c、a15g、g16a、g16u、g16c、a17u、a17c、a17g、 a18u、a18c、u19a、u19c、u19g、u20a、u20c、u20g、g21a、g21u、a22u、 a22c、a22g、u23a、u23c、u23g、c24a、c24u、c24g、u25a、u25c、c26a、 c26u、g27a、g27u、g27c、g28a、g28u、g28c、a5u/u25a、a5c/u25g、a5g/u25c、 g6a/c24u、g6u/c24a、g6c/c24g、u4a/
g12a、u4a/g13u、u4a/g16a、u4a/u20c、 u4a/a22c、g12a/g13u、g12a/g16a、g12a/u20c、g12a/a22c、g13u/g16a、 g13u/u20c、g13u/a22c、g16a/u20c、g16a/a22c、u20c/a22c、u4a/g12a/g13u、 u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/a22c、g12a/g13u/g16a、 g12a/g13u/u20c、g12a/g13u/a22c、g13u/g16a/u20c、g13u/g16a/a22c、 g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g13u/g16a/u20c、u4a/g12a/g13u/g16a/a22c、 u4a/g13u/g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g16a/u20c/a22c、 u4a/g12a/g13u/u20c/a22c、a5u/u25a/u4a/g 12a/g13u、 a5u/u25a/u4a/g12a/g16a、a5u/u25a//u4a/g12a/g16a、 g6a/c24u/u4a/g12a/a22c、g6a/c24u/g12a/g13u/g16a、 g6a/c24u/g12a/g13u/u20c、g6a/c24u/g12a/g13u/a22c。
22.9.根据权利要求8所述的核酸适配体分子，其中对通式paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：u2a、u2c、u2g、u4a、u4c、u4g、a5c、a5g、g6u、u7c、 u7g、a8u、a8c、a8g、g12a、g12u、g12c、g13a、g13u、g13c、a14u、a14c、 a14g、a15u、a15c、a15g、g16a、g16u、g16c、a17u、a17c、a17g、u19a、 u19c、u20a、u20c、u20g、g21u、a22u、a22c、a22g、u23a、u23c、u23g、 c24a、c24g、u25c、c26u、g27a、g27u、g27c、g28a、g28u、g28c、a5u/u25a、 a5c/u25g、a5g/u25c、g6a/c24u、g6u/c24a、g6c/c24g、u4a/g12a、u4a/g13u、 u4a/g16a、u4a/u20c、u4a/a22c、g12a/g13u、g12a/g16a、g12a/u20c、g12a/a22c、g13u/g16a、g13u/u20c、g13u/a22c、g16a/u20c、g16a/a22c、u20c/a22c、 u4a/g12a/g13u、u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/a22c、 g12a/g13u/g16a、g12a/g13u/u20c、g12a/g13u/a22c、g13u/g16a/u20c、 g13u/g16a/a22c、g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g13u/g16a/u20c、 u4a/g12a/g13u/g16a/a22c、u4a/g13u/g16a/u20c/a22c、 u4a/g12a/g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g13u/u20c/a22c、 a5u/u25a/u4a/g12a/g13u、a5u/u25a/u4a/g12a/g16a、 a5u/u25a//u4a/g12a/g16a、g6a/c24u/u4a/g12a/a22c、 g6a/c24u/g12a/g13u/g16a、g6a/c24u/g12a/g13u/u20c、 g6a/c24u/g12a/g13u/a22c。
23.10.根据权利要求1-9所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的n1与 n
29
处的核苷酸序列为f30或trna脚手架rna序列。
24.11.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是rna分子或经碱基修饰的rna分子。
25.12.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是dna-rna杂交分子或经碱基修饰的dna-rna分子。
26.13.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，所述的适配体功能是指核酸适配体能提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度至少2倍，至少5-10倍，至少20-50倍，至少100-200倍，至少200-1000倍或者至少1000-5000倍。
27.14.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中还可包含可以结合多个荧光团分子串联体，所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起，个数可以是2、3、4、5、6、 7、8或者更多。所述串联体的核苷酸可选自但不限于序列seq id no：1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13和14。
28.15.一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，其中所述的核酸适配体分子为权利要求1-14任一项所述核酸适配体分子，所述的荧光团分子具有下述式(i)所述的结构：
[0029][0030]
电子供体部分-d为-nx1-x2，x1选自氢、烷基、或改性烷基，x2选自氢、烷基、或改性烷基，x1，x2任选相互连接，与n原子一起形成脂杂环；
[0031]
共轭体系e为选自双键、叁键、芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成，其中所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、羟基、氨基、伯氨基、仲氨基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成脂环或脂杂环；
[0032]
x1，x2，独立地与共轭结构e连接成脂杂环；
[0033]
电子受体a部分如下式(i-1-a)的环状结构：
[0034][0035]
ra独立地选自氢、卤原子、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基； rb独立地选自氢、卤原子、羟基、羧基、氨基、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基或者为双键与芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成的基团；
[0036]
各个y1独立地选自-o-、-s-、-(s＝o)-和-(nri)-，其中ri选自氢、氨基、烷基或改性烷基；
[0037]
各个y2独立地选自＝o、＝s、＝s＝o和＝nri，其中ri选自氢、烷基或改性烷基；
[0038]
各个y3独立地选自＝o、＝s、＝s＝o和＝nri，其中ri选自氢、烷基或改性烷基；
[0039]
或者，各个y3独立地为＝c(re)(cn)；其中re选自氢、酯基、酰胺基、磺酸基、磺酰胺基、磺酸酯基；
[0040]
其中，
[0041]
所述“烷基”为c
1-c
30
的直链或支链的烷基；优选地，为c
1-c
10
直链或支链烷基；优选地，为c
1-c7直链或支链烷基；优选地，为c
1-c5直链或支链烷基；优选地，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基，1-甲基丁基、 2-甲基丁基、3-甲基丁基、异戊基、1-乙基丙基、新戊基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、异己基、1，1-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1，2
‑ꢀ
二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、正庚基、2-甲基己基、3
‑ꢀ
甲基己基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、3-乙基戊基或2，2，3-三甲基丁基；
[0042]
所述“改性烷基”为烷基的任意碳原子被选自卤原子、-o-、-oh、-co-、-cs-、-no2、
ꢀ‑
cn、-s-、-so
2-、-(s＝o)-、苯基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环环烃基、联芳杂环、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1～30个碳原子，其碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳叁键置换；
[0043]
所述的碳原子被置换，是指碳原子或碳原子与其上的氢原子一起被相应的基团置换；
[0044]
所述“脂环”为饱和或不饱和的4～10元单环或多环脂环；
[0045]
所述“脂杂环”为环上含有选自n、o、s或si中的至少一种杂原子的饱和或不饱和的4～10元单环或多环脂杂环，所述脂杂环上含有s原子时，其为-s-、-so-或-so
2-；所述脂杂环任选被卤原子、硝基、烷基、芳基、亲水性基团和改性烷基取代；
[0046]
所述“芳基或芳香环”为5～10元单环或稠合双环芳香基团；
[0047]
所述“杂芳基或芳香杂环”为环上含有选自n、o、s或si中的至少一种杂原子的5～10 元单环或稠合双环杂芳香基团；
[0048]
所述“卤原子”各自独立地选自f、cl、br、i；
[0049]
所述“亲水性基团”为羟基、磺酸基、羧基、亚磷酸酯基、伯氨基、仲氨基或叔氨基；
[0050]
所述“桥联脂杂环”为环上含有选自n、o、或s中的至少一种杂原子的5～20元桥联脂杂环；
[0051]
所述“酯基”为r(c＝o)or’基团；
[0052]
所述“亚磷酸酯基”rp(＝o)(oh)2基团；
[0053]
所述“磺酸基”为rso3h基团；
[0054]
所述“磺酸酯基”为rso
3 r’基团；
[0055]
所述“磺酸胺基”为rso2nr’r”基团；
[0056]
所述“伯氨基”为rnh2基团；
[0057]
所述“仲氨基”为rnhr’基团；
[0058]
所述“叔氨基”为rnr’r”基团；
[0059]
所述“季铵盐基”r r’r”r
”’
n 基团；
[0060]
各个r、r’、r”、r
”’
各自独立地为单键、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基，所述改性烷基或改性亚烷基为cl-c10(优选为c1-c6)烷基或亚烷基的任意碳原子被选自-o-、-oh、-co-、-cs-、-(s＝o)-中一种基团置换所得的基团；
[0061]
可选地，所述改性烷基或改性亚烷基各自独立地为含有选自-oh、-o-、乙二醇单元 (-(ch2ch2o)n-)、c1～c8烷基、c1～c8烷氧基、c1～c8酰基氧基、c1～c8卤代烷基、单糖基团、二糖基团、多糖基团、-o-co-、-nh-co-、-(-nh-chr
””‑
co-)n-、-so
2-o-、
ꢀ‑
so-、-so
2-nh-、-s-s-、-ch＝ch-、、卤原子、氰基、硝基、邻硝基苯基、苯甲酰甲基、磷酸酯基中至少一种基团的基团，其中，n为1～100，优选为1～50，更优选为1～30，更优选为1～10；r
””
为h或α氨基酸的残基；所述“磷酸酯基”具有如上所述定义；
[0062]
所述“单糖单元”为不能再被简单地水解为更小的糖分子的糖类单元；
[0063]
所述“二糖单元”为两个单糖失水而成的糖类单元；
[0064]
所述“多糖单元”为十个以上单糖失水而成的糖类单元；
[0065]
可选地，所述c1～c8烷基为甲基、乙基、丙基、异丙基，所述c1～c8烷氧基为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基，所述c1～c8酰基氧基为乙酰氧基、乙基、丙基、异丙基，所述c1～c8卤代烷基为三氟甲基、氯甲基、溴甲基；
[0066]
可选地，所述脂杂环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉、硫代吗啉。
[0067]
可选地，所述共轭体系e选自下式(i-2-1)～(i-2-39)中的结构：
[0068][0069][0070]
可选地，所述共轭体系e与-nx
1-x2形成如下(i-3-1)(i-3-5)所示的脂杂环：
[0071][0072]
或者，所述共轭体系e与-nx
1-x2形成如下(i-3-6)所示的结构：
[0073]
[0074]
可选地，所述电子受体部分为选自下式(i-4-1)～(i-4-42)中的一种：
[0075][0076][0077]
16.可选地，上述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针式(i)选自下式化合物：
[0078]
[0079]
[0080]
[0081][0082]
17.根据权利要求16所述的复合物，其中的荧光团分子选自i-5-1、i-5-2、i-5-3、 i-5-4、i-5-5、i-5-6、i-5-7、i-5-8、i-5-9、i-5-10、i-5-11、i-5-12、i-5-13、 i-5-14、i-5-15、i-5-16、i-5-17、i-5-18、i-5-19、i-5-20、i-5-21、i-5-22、i-5-23、i-5-24、i-5-25、i-5-26、i-5-27、i-5-28、i-5-29、i-5-30、i-5-31、 i-5-32、i-5-33、i-5-34、i-5-35、i-5-36、i-5-37、i-5-38、i-5-39、i-5-40、 i-5-41、i-5-42、i-5-43、i-5-44、i-5-45、i-5-46、i-5-47、
i-5-48、i-5-49、 i-5-50、i-5-51、i-5-52、i-5-53、i-5-54、i-5-55、i-5-56、i-5-57、i-5-58、 i-5-59、i-5-60、i-5-61、i-5-62、i-5-63、i-5-64、i-5-65、i-5-66、i-5-67、 i-5-68、i-5-69、i-5-70、i-5-71、i-5-72、i-5-73、i-5-74、i-5-75、i-5-76、 i-5-77、i-5-78、i-5-79、i-5-80、i-5-81、i-5-82、i-5-83、i-5-84。
[0083]
18.根据权利要求15-17任一项所述的复合物，其中复合物中的适配体分子包含核苷酸序列seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
[0084]
19.一种权利要求15-18任一项所述的复合物用于体外或体内目标核酸分子的检测或标记。
[0085]
20.一种dna分子，其转录权利要求1-14任一项所述的核酸适配体分子。
[0086]
21.一种表达载体，其包含权利要求20所述的dna分子。
[0087]
22.一种宿主细胞，其包含权利要求21所述的表达系统。
[0088]
23.一种试剂盒，包含权利要求1-14任一项所述的核酸适配体分子和/或权利要求 21所述的表达载体和/或权利要求22所述的宿主细胞和/或权利要求15-18任一项所述的复合物。
[0089]
24.一种检测靶标分子的方法，包括步骤：
[0090]
a)在包含靶标分子的溶液中加入权利要求15-18任一项所述的复合物；
[0091]
b)用合适波长的光激发复合物；
[0092]
c)检测复合物的荧光。
[0093]
25.一种提取与纯化rna的方法，包含利用权利要求15-18任一项所述复合物提取与纯化rna。
[0094]
本发明人设计了全新的核酸适配体分子，组成全新的荧光团-核酸适配体复合物，适配体分子结合荧光团分子之后可以显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度，它们克服了此前荧光团-核酸适配体复合物的缺点，能有效用于活细胞中的 rna/dna实时标记。本发明的核酸适配体对荧光团分子具有很强的亲和力，并展现出了很好的光稳定性与温度稳定性。这些核酸适配体-荧光团分子复合物可以对原核和真核细胞中rna/dna进行实时标记与成像，检测蛋白质-rna相互作用，探究细胞中mrna含量与蛋白质间的关系，或用于rna的提取与纯化的标签等作用。
附图说明
[0095]
图1.核酸适配体分子的二级结构预测。(a)预测的paprika的通用结构，包括可以形成茎结构的n1和n
29
，可以形成茎环结构的n9、n
10
和n
11
。(b)预测的paprika-1 的结构，n1和n
29
的碱基序列如图中茎1所对应的虚线框所示，n9、n
10
和n
11
的碱基序列如“茎环”所对应的虚线框所示。
[0096]
图2.paprika-1的二级结构预测。(a)f30-paprika-1的二级结构预测；(b) trna-paprika-1的二级结构预测。
[0097]
图3.paprika-1-i-5-57复合物光谱性质鉴定。(a)paprika-1-i-5-57复合物在核磁管中的成像；(b)paprika-1-i-5-57复合物的荧光激发光谱和发射光谱；(c) paprika-1-i-5-57复合物和荧光团分子i-5-57的吸收光谱；(d)paprika-1与 i-5-57结合的解离常数测定。
[0098]
图4.paprika-1-i-5-57复合物稳定性性质鉴定。(a)paprika-1-i-5-57复合物的ph稳定性测定；(b)paprika-1-i-5-57复合物对mg
2
的依赖性测定；(c) paprika-1-i-5-57复合物温度稳定性测定(额外补充5mm mg
2
)；(d) paprika-1-i-5-57复合物对k

的依赖性测定。
[0099]
图5.在paprika-1序列上含不同修饰的paprika-2和paprika-3对i-5-57的激活效果。(a) 含脱氧核糖核苷酸(图中浅色颜色标注)的paprika-2适配体的二级结构示意图； (b)含2’f修饰(图中浅色颜色标注)的paprika-3适配体的二级结构示意图； (c)定量分析paprika-2和paprika-3对i-5-57的激活效果。“对照”是利用缓冲液替换paprika-2或paprika-3适配体。
[0100]
图6.不同paprika-1串联体对i-5-57的激活效果。(a)paprika-1按照“串联1”方式获得paprika-4串联体；(b)paprika-1按照“串联2”方式获得paprika-5串联体；(c) 按照“串联3”方式获得paprika-4串联体；(d)不同按照“串联1”方式获得paprika-4 串联体对i-5-57的激活效果；(e)不同按照“串联2”方式获得paprika-5串联体对 i-5-57的激活效果；(f)不同按照“串联3”方式获得paprika-4串联体对i-5-57 的激活效果。
[0101]
图7.f30-paprika-1-i-5-57复合物用于细菌中rna的标记效果(比例尺：10μm)。
[0102]
图8.circular-paprika-1与i-5-57复合物在哺乳动物细胞中表达(比例尺：50μm)。
[0103]
图9.f30-paprika-1与i-5-57复合物在哺乳动物细胞中表达(比例尺：50μm)。
[0104]
图10.paprika-1-i-5-57复合物用于标记u6剪接体rna定位(比例尺：10μm)。
[0105]
图11.paprika-1-i-5-57复合物用于标记纤维状肌动蛋白actb的mrna定位(比例尺： 10μm)。
[0106]
图12.paprika-1用于rna的提取与纯化的定量结果。
[0107]
发明详述
[0108]
本发明在此通过对使用下述定义和实施例的引用进行详细描述。所有在本文中提及的专利和公开文献的内容，包括在这些专利和公开中披露的所有序列，明确地通过提述并入本文。下文中，“核苷酸”与“核苷酸碱基”互换使用，表示相同意思。
[0109]
以下，关于本技术的一些术语进行详细解释。
[0110]
核酸适配体分子
[0111]
本发明所述的“核酸适配体分子”也称为“适配体分子”。该核酸适配体分子包含(a) 核苷酸序列为：
[0112]
n1uguaguan
9-n
10-n
11
ggaagaauugaucucggn
29
(对应于图1a的通式 paprika结构)；或(b)与(a)所述的核苷酸序列具有至少58％同一性的序列；其中 n1与n
29
核苷酸序列中至少有一对碱基形成反向互补配对，即n1核苷酸序列的方向为 5
’‑3’
，n
29
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
。当n1与n
29
至少一条核苷酸碱基长度≤4时，需要至少一对碱基形成互补配对；当n1与n
29
至少一条核苷酸碱基长度≥5时，需要至少两对碱基形成互补配对。其中n9与n
11
核苷酸序列中至少有一对碱基形成反向互补配对，即n9核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，n
11
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
。当n9与n
11
至少一条核苷酸碱基长度≤4时，需要至少一对碱基形成互补配对；当n9与n
11
至少一条核苷酸碱基长度≥5时，需要至少两对碱基形成互补配对。其中n
10
为任意长度任意组成的核苷酸碱基；或(c)在所述的核苷酸序列(a)的任一位置经过1-10个核苷酸
的取代、缺失和/或增加。
[0113]
核酸适配体分子包含对通式paprika结构的核苷酸的取代，该取代选自下组中的一种：u2a、u2c、u2g、g3a、g3u、g3c、u4a、u4c、u4g、a5u、a5c、a5g、 g6a、g6u、g6c、u7a、u7c、u7g、a8u、a8c、a8g、g12a、g12u、g12c、g13a、g13u、g13c、a14u、a14c、a14g、a15u、a15c、a15g、g16a、g16u、g16c、 a17u、a17c、a17g、a18u、a18c、a18g、u19a、u19c、u19g、u20a、u20c、 u20g、g21a、g21u、g21c、a22u、a22c、a22g、u23a、u23c、u23g、c24a、 c24u、c24g、u25a、u25c、u25g、c26a、c26u、c26g、g27a、g27u、g27c、 g28a、g28u、g28c、a5u/u25a、a5c/u25g、a5g/u25c、g6a/c24u、g6u/c24a、 g6c/c24g、u4a/g12a、u4a/g13u、u4a/g16a、u4a/u20c、u4a/a22c、g12a/g13u、 g12a/g16a、g12a/u20c、g12a/a22c、g13u/g16a、g13u/u20c、g13u/a22c、 g16a/u20c、g16a/a22c、u20c/a22c、u4a/g12a/g13u、u4a/g12a/g16a、 u4a/g12a/g16a、u4a/g12a/a22c、g12a/g13u/g16a、g12a/g13u/u20c、 g12a/g13u/a22c、g13u/g16a/u20c、g13u/g16a/a22c、g16a/u20c/a22c、 u4a/g12a/g13u/g16a/u20c、u4a/g12a/g13u/g16a/a22c、 u4a/g13u/g16a/u20c/a22c、u4a/g12a/g16a/u20c/a22c、 u4a/g12a/g13u/u20c/a22c、a5u/u25a/u4a/g12a/g13u、 a5u/u25a/u4a/g12a/g16a、a5u/u25a//u4a/g12a/g16a、 g6a/c24u/u4a/g12a/a22c、g6a/c24u/g12a/g13u/g16a、 g6a/c24u/g12a/g13u/u20c、g6a/c24u/g12a/g13u/a22c。(即表1中的适配体分子结构)。这些突变体能特异性结合荧光团分子，并在结合之后可以显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度。其中核苷酸的位置序列对应于图1a中的位置。
[0114]
上述的突变表示在通式paprika结构的适配体核苷酸序列的相应位点发生核苷酸替换，如u2a表示paprika的第2位尿嘧啶核苷酸u被取代为腺嘌呤核苷酸a，也即表1 中的paprika-u2a；paprika-a5u/u25a表示paprika第5位腺嘌呤核苷酸a被取代为尿嘧啶核苷酸u，同时paprika的第25位尿嘧啶核苷酸u被取代为腺嘌呤核苷酸a，也即表1中的paprika-a5u/u25a。
[0115]
表1：paprika通式结构经过5个、4个、3个、2个或1个核苷酸取代的适配体结构
[0116]
[0117]
[0118]
[0119][0120]
适配体分子是单链核酸分子，它们有着一个或多个碱基配对区域(茎)以及一个或多个非配对的区域(环)构成的二级结构(图1a)。本发明所述的核酸适配体分子包含一个如图1a所预测的二级结构。该二级结构含有2个茎结构、2个环结构和1个茎
‑ꢀ
环结构，其中茎1是起到稳定整个核酸适配体分子结构的作用，可以被替换成其他可以形成茎结构的任意长n11
ggaagaauugaucucggn
29
，对它们同一性比对的时候，按照本发明的定义，应不包含n1、n
9-n
10-nh和n
29
的核苷酸碱基，因此它们的序列同一性比对结果为96％(相差1个核苷酸)。
[0129]
荧光团分子
[0130]
本发明所述的“荧光团分子”也称为“荧光团”或“荧光分子”。“荧光团分子”在本发明中是一类可被条件性激活的荧光团分子。它们在没有核酸适配体的情况下显示出较低的量子产率。在具体的实施方式中，当没有与特定适配体结合时，荧光团的量子产率低于 0.1，更优的低于0.01，最优的低于0.001；当荧光团被特定适配体结合后，荧光团的量子产率提高2倍以上，更优的提高10倍以上，最优的提高100倍以上。荧光团分子优选水溶性的，对细胞无毒且易穿透膜的。本发明的荧光团优选能够通过主动运输或者被动扩散通过细胞膜或细胞壁进入细胞浆或细胞周质。在本发明的实施方式中，荧光团可以透过革兰氏阴性菌的外膜和内膜，植物细胞的细胞壁和细胞膜，真菌和细胞壁和细胞膜，动物细胞的细胞膜，以及活体动物的gi和内皮细胞膜。
[0131]
本发明所述的核酸适配体分子可以特异性结合一种荧光团，显著增加其在特定波长激发下的荧光值。所述荧光团分子选自结构(i)：
[0132][0133]
电子供体部分-d为-nx1-x2，x1选自氢、烷基、或改性烷基，x2选自氢、烷基、或改性烷基，x1，x2任选相互连接，与n原子一起形成脂杂环；
[0134]
共轭体系e为选自双键、叁键、芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成，其中所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、羟基、氨基、伯氨基、仲氨基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成脂环或脂杂环；
[0135]
x1，x2，独立地与共轭结构e连接成脂杂环；
[0136]
电子受体a部分如下式(i-1-a)的环状结构：
[0137][0138]
ra独立地选自氢、卤原子、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基； rb独立地选自氢、卤原子、羟基、羧基、氨基、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基或者为双键与芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成的基团；
[0139]
各个y1独立地选自-o-、-s-、-(s＝o)-和-(nri)-，其中ri选自氢、氨基、烷基或改性烷基；
[0140]
各个y2独立地选自＝o、＝s、＝s＝o和＝nri，其中ri选自氢、烷基或改性烷基；
[0141]
各个y3独立地选自＝o、＝s、＝s＝o和＝nri，其中ri选自氢、烷基或改性烷基；
[0142]
或者，各个y3独立地为＝c(re)(cn)；其中re选自氢、酯基、酰胺基、磺酸基、磺酰胺
基、磺酸酯基；
[0143]
其中，
[0144]
所述“烷基”为c
1-c
30
的直链或支链的烷基；优选地，为c
1-c
10
直链或支链烷基；优选地，为c
1-c7直链或支链烷基；优选地，为c
1-c5直链或支链烷基；优选地，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基，1-甲基丁基、 2-甲基丁基、3-甲基丁基、异戊基、1-乙基丙基、新戊基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、异己基、1，1-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1，2
‑ꢀ
二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、正庚基、2-甲基己基、3
‑ꢀ
甲基己基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、3-乙基戊基或2，2，3-三甲基丁基；
[0145]
所述“改性烷基”为烷基的任意碳原子被选自卤原子、-o-、-oh、-co-、-cs-、-no2、
ꢀ‑
cn、-s-、-so
2-、-(s＝o)-、苯基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环环烃基、联芳杂环、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1～30个碳原子，其碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳叁键置换；
[0146]
所述的碳原子被置换，是指碳原子或碳原子与其上的氢原子一起被相应的基团置换；
[0147]
所述“脂环”为饱和或不饱和的4～10元单环或多环脂环；
[0148]
所述“脂杂环”为环上含有选自n、o、s或si中的至少一种杂原子的饱和或不饱和的4～10元单环或多环脂杂环，所述脂杂环上含有s原子时，其为-s-、-so-或-so
2-；所述脂杂环任选被卤原子、硝基、烷基、芳基、亲水性基团和改性烷基取代；
[0149]
所述“芳基或芳香环”为5～10元单环或稠合双环芳香基团；
[0150]
所述“杂芳基或芳香杂环”为环上含有选自n、o、s或si中的至少一种杂原子的5～10 元单环或稠合双环杂芳香基团；
[0151]
所述“卤原子”各自独立地选自f、cl、br、i；
[0152]
所述“亲水性基团”为羟基、磺酸基、羧基、亚磷酸酯基、伯氨基、仲氨基或叔氨基；
[0153]
所述“桥联脂杂环”为环上含有选自n、o、或s中的至少一种杂原子的5～20元桥联脂杂环；
[0154]
所述“酯基”为r(c＝o)or’基团；
[0155]
所述“亚磷酸酯基”rp(＝o)(oh)2基团；
[0156]
所述“磺酸基”为rso3h基团；
[0157]
所述“磺酸酯基”为rso
3 r’基团；
[0158]
所述“磺酸胺基”为rso2nr’r”基团；
[0159]
所述“伯氨基”为rnh2基团；
[0160]
所述“仲氨基”为rnhr’基团；
[0161]
所述“叔氨基”为rnr’r”基团；
[0162]
所述“季铵盐基”r r’r”r
”’
n 基团；
[0163]
各个r、r’、r”、r
”’
各自独立地为单键、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基，所述改性烷基或改性亚烷基为c1-c10(优选为c1-c6)烷基或亚烷基的任意碳原子被选自-o-、-oh、-co-、-cs-、-(s＝o)-中一种基团置换所得的基团；
[0164]
可选地，所述改性烷基或改性亚烷基各自独立地为含有选自-oh、-o-、乙二醇单元 (-(ch2ch2o)n-)、c1～c8烷基、c1～c8烷氧基、c1～c8酰基氧基、c1～c8卤代烷基、单糖基团、二糖基团、多糖基团、-o-co-、-nh-co-、-(-nh-chr
””‑
co-)n-、-so
2-o-、
ꢀ‑
so-、-so
2-nh-、-s-s-、-ch＝ch-、、卤原子、氰基、硝基、邻硝基苯基、苯甲酰甲基、磷酸酯基中至少一种基团的基团，其中，n为1～100，优选为1～50，更优选为1～30，更优选为1～10；r
””
为h或α氨基酸的残基；所述“磷酸酯基”具有如上所述定义；
[0165]
所述“单糖单元”为不能再被简单地水解为更小的糖分子的糖类单元；
[0166]
所述“二糖单元”为两个单糖失水而成的糖类单元；
[0167]
所述“多糖单元”为十个以上单糖失水而成的糖类单元；
[0168]
可选地，所述c1～c8烷基为甲基、乙基、丙基、异丙基，所述c1～c8烷氧基为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基，所述c1～c8酰基氧基为乙酰氧基、乙基、丙基、异丙基，所述c1～c8卤代烷基为三氟甲基、氯甲基、溴甲基；
[0169]
可选地，所述脂杂环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉、硫代吗啉。
[0170]
可选地，所述共轭体系e选自下式(i-2-1)～(i-2-39)中的结构：
[0171]
[0172][0173]
可选地，所述共轭体系e与-nx
1-x2形成如下(i-3-1)(i-3-5)所示的脂杂环：
[0174][0175]
或者，所述共轭体系e与-nx
1-x2形成如下(i-3-6)所示的结构：
[0176][0177]
可选地，所述电子受体部分为选自下式(i-4-1)～(i-4-42)中的一种：
[0178]
[0179][0180]
可选地，上述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针式(i)选自下式化合物：
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185][0186]
本发明优选的实施方案中，所述荧光团分子包含i-5-1、i-5-2、i-5-3、i-5-4、 i-5-5、i-5-6、i-5-7、i-5-8、i-5-9、i-5-10、i-5-11、i-5-12、i-5-13、i-5-14、 i-5-15、i-5-16、i-5-17、i-5-18、i-5-19、i-5-20、i-5-21、i-5-22、i-5-23、 i-5-24、i-5-25、i-5-26、i-5-27、i-5-28、i-5-29、i-5-30、i-5-31、i-5-32、 i-5-33、i-5-34、i-5-35、i-5-36、i-5-37、i-5-38、i-5-39、i-5-40、i-5-41、 i-5-42、i-5-43、i-5-44、i-5-45、i-5-46、i-5-47、i-5-48、i-5-49、i-5-50、 i-5-51、i-5-52、i-5-53、i-5-54、i-5-55、i-5-56、i-5-57、i-5-58、i-5-59、 i-5-60、i-5-61、i-5-62、i-5-63、i-5-64、i-5-65、i-5-66、i-5-67、i-5-68、 i-5-69、i-5-70、i-5-71、i-5-72、i-5-73、i-5-74、i-5-75、i-5-76、i-5-77、 i-5-78、i-5-79、i-5-80、i-5-81、i-5-82、i-5-83、i-5-84。“提高荧光信号”、“荧光增加”、“提高荧光强度”、“增加荧光强度”在本发明中指合适波长激发光照射下荧光团量子产率的提高，或者荧光信号最大发射峰的迁移(相对乙醇或者水溶液中荧光团本身的发射峰)，或者摩尔消光系数的增加，或者以上的两种或更多。在本发明一优选实施方式中，量子产率的增加至少是2倍；在本发明另一优选实施方式中，量子产率的增加至少是5-10倍；在本发明另一更优选实施方式中，量子产率的增加至少是20-50倍；在本发明另一更优选实施方式中，量子产率的增加至少是100-200倍；在本发明另一更优选实施方式中，量子产率的增加至少是500-1000倍；在本发明另一更优选实施方式中，量子产率的增加至少是1000-10000倍；在本发明另一更优选实施方式中，量子产率的增加大于10000倍；用于激发荧光团产生荧光信号的光源可以是任意合适的光照设备，如包括led灯、白炽灯、荧光灯、激光；激发光既可以是直接从这些设备中发出，也可以间接通过其他荧光团获取，如fret的供体荧光团，或bret的供体发光团。
[0187]
靶标分子
[0188]
本发明所述的靶标分子可以是任意的生物材料或者小分子，包括但不限于：蛋白质，核酸(rna或者dna)，脂质分子，碳水化合物，激素，细胞因子，趋化因子，代谢物金属离子等。靶标分子可以是与疾病或者病原菌感染相关的分子。
[0189]
通过在本发明所述的适配体分子，如图1b所示的结构中，该插入的核苷酸序列替换了图1a中的n9、n
10
、n
11
的茎-环结构，该核苷酸序列可以特异性识别/结合靶标分子。当靶标分子不存在时，适配体分子与荧光团分子不结合或结合能力弱，不能显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光；当靶标分子存在时，靶标分子与所述核苷酸序列的结合会促进适配体分子与荧光团分子的结合，显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光，
实现对靶标分子的检测、成像和定量分析。
[0190]
靶标分子也可以是整个细胞或表达在整个细胞表面的分子。典型的细胞包括但不限于癌症细胞、细菌细胞，真菌细胞以及正常动物细胞。靶标分子也可以是病毒颗粒。目前很多的上述靶标分子的适配体被鉴定出来，它们可以被整合本发明中的多价核酸适配体中。目前已报道的可以结合靶标分子的rna适配体包括但不限于：t4 rna聚合酶适配体，hiv逆转录酶适配体，噬菌体r17衣壳蛋白适配体。
[0191]
目标核酸分子
[0192]“目标核酸分子”又称“靶标核酸分子”是指待检测的核酸分子，可以是细胞内的，也可以是细胞外的；包括目标rna分子和目标dna分子。本发明通过将目标核酸分子与所述核酸适配体分子连接，通过荧光团分子与核酸适配体分子结合，显著提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光值，进而实现检测目标核酸分子的含量与分布的目的。
[0193]“目标rna分子”在本发明中包括任意的rna分子，包括但不限于pre-mrna，编码细胞本身或外源表达产物的mrna，pre-rrna，rrna，trna，hnrna，snrna， mirna，sirna，shrna，sgrna，crrna，长链非编码rna，噬菌体衣壳蛋白mcp 识别结合序列ms2 rna、噬菌体衣壳蛋白pcp识别结合序列pp7 rna，λ噬菌体转录终止蛋白n识别结合序列boxb rna等。靶标rna可以融合在本发明rna适配体分子的5’端或3’端或n
25-n
26-n
27
的位置。
[0194]“sgrna”在本发明中指crispr/cas9系统中将tracrrna和crrna经改造后形成的单一的引导rna(single guide rna，sgrna)，其5’端20nt左右的序列通过碱基对互补来靶向dna位点，促使cas9蛋白在该位点诱发dna双链断裂。
[0195]
核酸适配体的串联体
[0196]
本发明所述的核酸适配体分子进一步还可包含可以结合多个荧光团分子的串联体。所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起，串联的paprika-1结构的个数可以是2， 3，4，5，6，7，8，9，10或者更多。串联体的形式可以有多种，在本发明一优选的实施方案中，串联的形式为“串联1”，如图6a所示，优选的核苷酸序列为seq id no：6 和7；其中的2paprika-4表示具有2个paprika-4结构的串联体1；在本发明另一优选的实施方案中，串联的形式为“串联2”，如图6b所示，优选的核苷酸序列为seq id no： 8和9；其中的2x paprika-5表示具有2个paprika-5结构的串联体2；在本发明另一优选的实施方案中，串联的形式为“串联3”，如图6c所示，优选的核苷酸序列为seq id no： 10和11；其中的2x2 paprika-4表示具有2个2paprika-4结构的串联体3；无论何种形式，串联体之间的间隔序列可以进行更换。
[0197]
本发明所述的单体形式的适配体是指仅含有1个paprika-1结构的适配体，也就是含2个茎结构，2个环结构和1个茎环结构(图1b)的适配体。
[0198]
多聚体形式的适配体是指含有1个以上paprika-1结构的适配体，包含但不限于图6 所示的几种串联形式构成的适配体。
[0199]
适配体-荧光团复合物
[0200]
本发明的适配体-荧光团复合物包含1个核酸适配体分子以及1个或多个荧光团分子。在本发明的一具体实施方式中，包含1个核酸分子以及1个荧光团分子的分子复合物为f30-paprika-1-i-5-57。
[0201]
在本发明的另一具体实施方式中，串联体的核酸分子与多个荧光团分子的形成复
1acuv5启动子(tac启动子) 或者其他通过重组或合成dna技术得到的大肠杆菌启动子，均可用于转录本发明所述的rna适配体。细菌中本身的一些操作子序列可以与启动子序列结合在一起构成诱导型启动子，此时需要加入特定的诱导物才能诱导dna分子的转录。比如lac操作子需要加入乳糖或者乳糖类似物(iptg)诱导其表达，其他的操作子还有trp，pro等。
[0210]
如上所述，dna分子编码序列的5’端的调控序列是启动子。无论是体外转录获得 rna适配体，还是在培养的细胞或组织中表达适配体，都需要依据启动子的强度选择合适的启动子。由于体内表达适配体可以被遗传操作，另一类型的启动子就是响应特定环境诱导dna转录的诱导型启动子，如表达在特定的组织，特定的时间，特定的发育阶段等。这些不同的启动子可以被rna聚合酶i，ii或iii识别。
[0211]
真核细胞中转录的启动也需要合适的启动子，包括但不限于β-球蛋白启动子，cag 启动子，gapdh启动子，β-肌动蛋白启动子，肌动蛋白启动子，cstf2t启动子，sv40 启动子，pgk启动子，mmtv启动子，腺病毒ela启动子，cmv启动子等。真核细胞中转录的终止依赖于rna序列中特定的切割位点。同样的，rna聚合酶转录基因的不同，其转录终止子也差别很大。然而，筛选合适的3’转录终止子区域是本领域人源日常的实验技能就能实现。
[0212]
表达系统
[0213]
本发明的“表达系统”，也称为“表达载体”，包含整合有表达核酸适配体的dna分子。本发明的表达系统，可以是一个质粒，也可以是病毒颗粒。
[0214]“表达载体”重组病毒可以通过将质粒转染进入感染病毒的细胞中获得。合适的载体包括但不限于病毒载体如λ载体系统gt11，gt wes.tb，charon 4，质粒载体包括pbr322，pbr325，pacyc177，pacyc184，puc8，puc9，puc18，puc19，plg399，pr290， pkc37，pkc101，pbluescript ii sk /-或ks /-(见stratagene克隆系统)，pet28系列， pacycduetl，pcdfduet1，prset系列，pbad系列，pqe，pih821，pgex，piiiex426 rpr等。
[0215]
大量的宿主表达系统可以用于表达本发明所述的dna分子。主要地，载体系统必须要与所用的宿主细胞相容，宿主载体系统包括但不限于：转化的噬菌体dna，或质粒dna，或考斯质粒dna的细菌；包含酵母载体的酵母；感染病毒的哺乳动物细胞(如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒)；感染病毒的昆虫细胞(如杆状病毒)；感染细菌或者通过粒子轰击转化的植物细胞。所述的载体中的表达元件的强度和特性差异很大。根据使用的宿主-载体系统选用任意一种或多种合适的转录元件。
[0216]
一旦构建的dna分子被克隆到载体系统中，很容易将它们转入宿主细胞中。根据不同的载体或宿主细胞系统，方法包括但不限于转化，转导，接合，固定，电转等。
[0217]
在本发明的一具体实施方式中，提供含编码f30-paprika-1 rna的dna分子的表达质粒pet28a-t7-f30-paprika-1、plko.1-f30-paprika-1。在本发明的另一具体实施方式中，提供含编码f30-2xpaprika-1 rna的dna分子的表达质粒plko.1-f30-5x (f30-2xpaprika-1)。在本发明的另一具体实施方式中，提供含编码egfp-f30-5x (f30-2xpaprika-1)和actb-f30-5x(f30-2xpaprika-1)的dna分子的表达质粒 pcdna3.1/hygro( )-egfp-f30-5x(f30-2xpaprika-1)和 pcdna3.1/hygro( )-actb-f30-5x(f30-2xpaprika-1)。在本发明的另一具体实施方式中，提供含编码paprika-1-ms2的dna分子的表达质粒plko.1-paprika-1-ms2。
[0218]
本发明也提供整合了编码核酸适配体dna分子，但目标rna分子编码dna序列空缺的表达载体，目标rna分子的编码dna序列空缺是让用户可以自行选择所需检测的目标rna分子的dna序列，例如gapdh mrna对应的编码dna序列，用标准的重组dna技术将dna序列插入本发明的这种表达载体中，将获得的表达载体导入到 (转染、转化、感染等)宿主细胞，检测目标rna的含量及分布。
[0219]
宿主细胞
[0220]“宿主细胞”在本发明中包括但不限于细菌，酵母，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，斑马鱼细胞，果蝇细胞，线虫细胞。宿主细胞更优选培养的体外细胞或整个体内活体组织。本发明中的宿主细胞，其包含的哺乳动物细胞包括但不限于297t，cos-7，bhk，cho，hek293，hela，h1299，受精卵干细胞，诱导全能干细胞，从哺乳动物组织中直接分离的原代细胞等；其包含的大肠杆菌细胞包括但不限于bl21(de3)、bl21 (de3，star)、top10、mach1、dh5α；其包含的酵母细胞包含但不限于by4741，by4742， ah109。
[0221]
检测阵列
[0222]
本发明所述的检测阵列包含一个或多个本发明的核酸适配体分子，其中核酸适配体分子被锚定在阵列表面的离散位置，阵列表面是由固体支撑物构成，包括但不限于玻璃、金属、陶瓷等。将本发明所述核酸适配体分子锚定到阵列表面可通过但不限于以下方法： (1)利用生物素标记所述核酸适配体分子的5’或3’端，将链霉亲和素包被在阵列表面，通过生物素与链霉亲和素的特异性结合将所述核酸适配体分子进行锚定；(2)将噬菌体衣壳蛋白mcp识别结合序列ms2、噬菌体衣壳蛋白pcp识别结合序列pp7或λ噬菌体转录终止蛋白n识别结合序列boxb rna序列融合在所述核酸适配体分子的5’、3’或茎环结构，将它们识别结合的蛋白mcp、pp7或λn蛋白包被在阵列表面，通过ms2与 mcp蛋白、pp7与pcp蛋白或boxb rna与λn蛋白的特异性作用将所述核酸适配体分子进行锚定；(3)将一段rna或dna序列融合在所述核酸适配体分子的5’或3’端，将与该段rna序列互补配对的rna序列或与该段dna序列互补配对的dna序列锚定在阵列表面，通过分子杂交的原理将所述核酸适配体分子锚定在阵列表面。所述检测阵列可用于检测靶标分子的存在与否以及浓度高低，因此，只有在靶标分子存在下，所述核酸适配体分子才会与荧光团分子结合，显著提高其在合适激发光波长下的荧光强度，且在一定范围内，靶标分子的浓度越高，荧光强度越高。
[0223]
试剂盒
[0224]
本发明的试剂盒，包含本发明所述的核酸适配体分子和/或荧光团分子，及相应的说明书；或者包含表达所述核酸适配体分子的表达系统和/或荧光团分子，及相应的说明书；或者包含表达核酸适配体分子表达系统的宿主细胞和/或荧光团分子，及相应的说明书。试剂盒中的核酸适配体分子与荧光团分子分别存在于单独的溶液中，或者核酸适配体分子与荧光团分子在同一溶液中。
具体实施方式
[0225]
以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简
·
罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》和j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔著，黄培堂等译：《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8
核酸适配体分子与0.5μm荧光团分子在检测缓冲液(40mm hepes，ph 7.4，125mmkcl，5mm mgcl2，5％dmso)中孵育，利用synergy neo2多功能酶标仪检测获取核酸适配体-荧光团分子复合物荧光的最大激发峰和最大发射峰。再利用synergy neo2多功能酶标仪检测核酸适配体-荧光团分子复合物在其最大激发和发射条件下的荧光强度，对照样品(不含核酸适配体的1μm荧光团分子)也在相同的条件进行测定，计算荧光强度的比值。如2.5μm paprika-1核酸适配体与0.5μm i-5-57荧光团分子形成的复合物的荧光最大激发峰为594nm，最大发射峰为658nm。利用synergy neo2多功能酶标仪检测该复合物在594
±
10nm激发、658nm
±
10nm发射条件下的荧光强度为19567，而对照(0.5μm i-5-57荧光团分子)在相同检测条件下的荧光强度为11，那么paprika-1 核酸适配体对i-5-57荧光团分子的激活倍数为1779倍。
[0235]
(三)基于同源重组方法的重组质粒构建
[0236]
1.制备线性化载体：选择合适的克隆位点，并对载体进行线性化，可采用酶切或反向pcr扩增制备线性化载体。
[0237]
2.pcr扩增制备插入片段：通过在插入片段正、反向pcr引物的5’端引入15-25bp (不包括酶切位点)的线性化载体末端同源序列，使得插入片段pcr产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。
[0238]
3.线性化载体与插入片段浓度测定：将线性化载体和插入片段扩增产物做数个等体积稀释梯度，原始产物和稀释后产物各取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，与dna分子量标准(dna marker)比较条带亮度以确定其近似浓度。
[0239]
4.重组反应
[0240]
重组反应体系最适载体使用量为0.03pmol；最适载体与插入片段摩尔比为1∶2-1∶ 3，即最适插入片段使用量为0.06-0.09pmol。
[0241][0242]
x和y分别是根据公式计算得到线性化载体和插入片段用。体系配制完成后，混匀各组分，置于50℃反应20min。当插入片段＞5kb时，可将孵育时间延长至25min。待反应完成后，建议将反应管置于冰上冷却5min。反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
[0243]
(四)细胞培养及转染：
[0244]
本实施例中的293t/17细胞均在co2培养箱中用含10％胎牛血清(fbs)及链霉素和青霉素高糖培养基(rpmi)培养，本实施例中的cos-7细胞均在co2培养箱中用含 10％胎牛血清(fbs)及链霉素和青霉素高糖培养基(dmem)培养，生长达到80-90％汇合度时将细胞传代培养。转染时，用(购自promega)按照说明书进行操作。
[0245]
(五)荧光成像：
[0246]
实施例中主要的成像实验是利用配置了白激光的leica sp8共聚焦激光显微镜进
paprika-1序列中与图1b的paprika-1对应核苷酸位置做的点突变。
[0255]
表3含有多碱基突变的paprika-1突变体对i-5-57的激活效果
[0256]
突变体激活倍数突变体激活倍数paprika-11779u4a/g12a/g13u362a5u/u25a252u4a/g12a/g16a278a5c/u25g168u4a/g12a/g16a298a5g/u25c152u4a/g12a/a22c314g6a/c24u175g12a/g13u/g16a318g6u/c24a121g12a/g13u/u20c308g6c/c24g152g12a/g13u/a22c298u4a/g12a254g13u/g16a/u20c215u4a/g13u396g13u/g16a/a22c198u4a/g16a287g16a/u20c/a22c187u4a/u20c102u4a/g12a/g13u/g16a/u20c102u4a/a22c396u4a/g12a/g13u/g16a/a22c149g12a/g13u176u4a/g13u/g16a/u20c/a22c156g12a/g16a258u4a/g12a/g16a/u20c/a22c97g12a/u20c326u4a/g12a/g13u/u20c/a22c145g12a/a22c317a5u/u25a/u4a/g12a/g13u34g13u/g16a289a5u/u25a/u4a/g12a/g16a67g13u/u20c265a5u/u25a//u4a/g12a/g16a122g13u/a22c382g6a/c24u/u4a/g12a/a22c57g16a/u20c194g6a/c24u/g12a/g13u/g16a201g16a/a22c125g6a/c24u/g12a/g13u/u20c121u20c/a22c389g6a/c24u/g12a/g13u/a22c165
[0257]
实施例3.paprika-1核酸适配体分子的二级结构
[0258]
利用mfold在线rna结构分析软件分析paprika-1(seq id no：1)核酸适配体的二级结构(图1b)。采用f30脚手架rna连接得到的f30-paprika-1(seq id no：2) 核酸适配体的二级结构(图2a)。采用trna脚手架rna连接得到的trna-paprika-1 (seq id no：3)核酸适配体的二级结构(图2b)。
[0259]
实施例4.paprika-1-i-5-57复合物光谱性质鉴定
[0260]
为了检测paprika-1-i-5-57复合物是否可以被紫外光激活，按照常用实验方法(一) 制备paprika-1(seq id no：2)rna。将2μm i-5-57与10μm paprika-1孵育。检测结果显示，单独的i-5-57荧光团分子溶液，加了阴性对照rna的i-5-57荧光团分子混合溶液，或是含有rnase a的paprika-1与i-5-57荧光团分子混合溶液，在紫外光照射下均无明显荧光，而paprika-1与i-5-57荧光团分子结合后的混合溶液，在紫外光照射下发出明亮的红色荧光(图3a)。
[0261]
为了检测paprika-1-i-5-57复合物的光谱性质，按照常用实验方法(一)制备 paprika-1(seq id no：1)rna。将1μm i-5-57与5μm paprika-1孵育。检测结果显示，
paprika-1-i-5-57复合物的最大激发光为594nm，最大发射光为658nm(图3b)。
[0262]
为了检测paprika-1-i-5-57复合物的光吸收与i-5-57荧光团分子自身光吸收的区别，将2μm i-5-57与10μm paprika-1孵育，或者单独的5μm i-5-57，分别检测i-5-57 和paprika-1-i-5-57复合物的光吸收。检测结果显示，i-5-57最大光吸收为539nm，而paprika-1-i-5-57复合物的最大光吸收相对i-5-57自身发生了很大的红移，最大吸收光为588nm(图3c)。
[0263]
为了检测paprika-1与i-5-57结合的结合常数，利用2nm的paprika-1与不同浓度的i-5-57孵育，检测它们的荧光值。检测结果显示paprika-1与i-5-57结合的结合常数为2.2
±
0.2nm(图3d)。
[0264]
实施例5.paprika-1-i-5-57复合物稳定性鉴定
[0265]
为了检测paprika-1-i-5-57复合物在不同ph下的稳定性，将paprika-1-i-5-57复合物置于不同ph环境下60min，检测荧光值。检测结果显示，paprika-1-i-5-57复合物在ph 5-9的范围内均保持很高的荧光信号(图4a)，说明paprika-1-i-5-57复合物有着很好的ph稳定性。
[0266]
为了检测paprika-1-i-5-57复合物对mg
2
离子的依赖性，分别将1μm paprika-1和 5μm i-5-57在含不同镁离子含量的缓冲溶液中孵育。检测结果显示，镁离子浓度对paprika-1-i-5-57复合物的荧光几乎没有影响(图4b)，说明paprika-1-i-5-57复合物有着很好的镁离子稳定性。
[0267]
为了检测paprika-1的温度稳定性，在含有5mm mg
2
的检测缓冲溶液中，将10μmi-5-57与1μm paprika-1孵育，然后置于不同的温度下放置5min，检测荧光值。检测结果显示，paprika-1-i-5-57的tm值为53.6℃(图4c)，说明paprika-1-i-5-57复合物有着很好的温度稳定性。
[0268]
为了检测paprika-1-i-5-57复合物对k

离子的依赖性，分别将10μm i-5-57与1 μm paprika-1在含100mm kcl或100mm licl的缓冲液中孵育，70℃处理5min后置于室温15min以上，检测不同条件下的荧光值。由先前的文献报道可知，g四联体结构的稳定非常依赖于k

离子的存在。实验结果显示，paprika-1-i-5-57复合物的荧光不依赖于k

离子的存在(图4d)，推测paprika-1结构中不存在g四联体结构。
[0269]
实施例6.i-5-57类似物的性质鉴定
[0270]
按照常用实验方法(一)制备f30-paprika-1 rna适配体分子，利用其检测i-5-57 类似物与paprika结合的基本性质，包括荧光光谱和荧光激活倍数，检测结果如表4所示，从表中数据可以看出，f30-paprika-1可以不同程度地激活i-5-57类似物的荧光。
[0271]
表4：f30-paprika-1 rna适配体分子与不同荧光分子结合的理化性质测定
[0272]
[0273]
paprika-2(seq id no：4，该序列： gguguaguaugacgttcgcgtcaggaagaauugaucucggcc中带下划线的碱基为脱氧核糖核苷酸碱基)和paprika-3(seq id no：5，该序列： gguguaguaugacguucgcgucaggaagaauugaucucggcc中带下划线的碱基为经2
’‑
f修饰的碱基)(由上海吉玛制药技术有限公司合成)，它们分别含茎-环结构碱基替换为脱氧核糖核苷酸(图5a中阴影部分的碱基)和部分碱基经2
’‑
f修饰(图5b 中阴影部分的碱基)。按照常用实验方法(二)检测这些碱基修饰的paprika-1对i-5-57 荧光团分子的荧光激活效果。检测结果显示，经碱基修饰的paprika-2和paprika-3依然可以显著激活i-5-57荧光团分子的荧光(图5c)。
[0277]
实施例8.paprika-1串联体
[0278]
为了检测paprika-1串联体对i-5-57荧光的激活效果，将paprika-1按照不同的形式进行串联，包含以下三种：
[0279]
(1)“串联1”方式(图6a)，将paprika-1结构上的“头”和“尾”按照“头-尾”连接的方式进行连接，以此获得npaprika-1(其中n为可为任意拷贝的paprika-1)。在本实施例中，分别全基因合成f30-2paprika-4和f30-4paprika-4的编码cdna(编码rna适配体的序列分别为seq id no：6，seq id no：7)，pcr扩增后，按照常用实验方法(一) 制备核酸适配体rna，将0.1μm rna适配体与10μm i-5-57孵育后，按照常用实验方法(二)检测荧光强度。检测结果显示，随着n的增加，npaprika-4-i-5-57的荧光也随之增加，虽然npaprika-4-i-5-57的荧光并不是等倍数增加，但依然比 paprika-1-i-5-57的荧光要高很多(图6d)，说明可以通过“串联1”方式提高 paprika-1-i-5-57复合物的荧光强度。
[0280]
(2)“串联2”方式(图6b)，将paprika-1作为一个结构单元进行串联，以此获得 nxpaprika-1(其中n为可为任意拷贝的paprika-1)。在本实施例中，分别全基因合成 2xpaprika-5和4xpaprika-5的编码cdna(编码rna适配体的序列分别为seq id no： 8，seq id no：9)，按照常用实验方法(一)制备核酸适配体rna，将0.1μm rna 适配体与10μm i-5-57孵育后，按照常用实验方法(二)检测荧光强度。检测结果显示，随着n的增加，nxpaprika-1-i-5-57的荧光也随之增加(图6e)，说明可以通过“串联2”方式提高paprika-1-i-5-57复合物的荧光强度。
[0281]
(3)“串联3”方式(图6c)，是将上述“串联1”与“串联2”结合起来，将“串联1”得到的npaprika-1作为一个结构单元按照“串联2”的方式进行串联，以此获得n1 xn2paprika-1(其中n1和n2为可为任意拷贝的paprika-1)。在本实施例中，分别全基因合成2x2paprika-4和4x2paprika-4的编码cdna(编码rna适配体的序列分别为seq idno：10，seq id no：11)，按照常用实验方法(一)制备核酸适配体rna，将0.1μmrna适配体与20μm i-5-57孵育后，按照常用实验方法(二)检测荧光强度。检测结果显示，这种通过“串联3”方式得到的paprika-1串联体-i-5-57复合物的荧光强度要显著高于paprika-1-i-5-57(图6f)，说明可以通过“串联3”方式提高paprika-1-i-5-57复合物的荧光强度。
[0282]
实施例9.f30-paprika-1-i-5-57复合物用于细菌中rna的标记
[0283]
为了检测f30-paprika-1-i-5-57在细菌中的效果，首先构建表达f30-paprika-1(seqid no：2)的细菌表达质粒。利用引物对实施例2中的f30-paprika-1进行扩增，利用引物对pet28a进行扩增去除了启动子和多克隆位点区，将扩增得到的f30-paprika-1 dna片段与pet28a线性化载体按照实验方法(三)进行连接，得到的重组质粒命名为 pet28a-t7-f30-paprika-1。
[0308]
利用实验方法(三)将这些片段插入到plko.1puro载体中，得到的表达载体命名为plko.1-f30-paprika-1，该质粒表达f30-paprika-1。
[0309]
将plko.1-f30-paprika-1质粒转染293t/17细胞，36h后加入1μm i-5-57对 f30-paprika-1进行标记，以不表达相应适配体的细胞作为对照，利用实验方法(五)检测标记效果。结果显示，f30-paprika-1-i-5-57复合物展现出非常明亮的红色荧光(图9)。
[0310]
实施例12.paprika-1-i-5-57作为标签在活细胞内对u6剪接体rna进行标记
[0311]
为了验证paprika-1与i-5-57作为标签在活细胞内对u6剪接体rna进行标记，构建表达u6-paprika-1(seq id no：13)哺乳动物细胞表达质粒。全基因合成u6-paprika-1 的dna序列基因片段
[0312]
扩增u6-paprika-1片段所用的引物为：
[0313]
上游引物(p12)：5
’‑
gtgctcgcttcggcagcac-3’[0314]
下游引物(p13)：5
’‑
caaaaatatggaacgcttcac-3’[0315]
扩增plko.1puro载体使其线性化所用的引物为：
[0316]
上游引物(p14)：5
’‑ꢀ
cgtgaagcgttccatatttttgtttttttgaattctcgacctcg-3’[0317]
下游引物(p15)：5
’‑ꢀ
gtatatgtgctgccgaagcgagcactctagagtttcgtcctttcc-3’[0318]
利用实验方法(三)将这些片段插入到plko.1puro载体中，得到的表达载体命名为plko.1-u6-paprika-1，该质粒表达u6-paprika-1。将plko.1-u6-paprika-1质粒与 pcdn3.1/hygro( )-sart3-bfp(chen et al.nature biotechnology 2019.37：1287-1293)质粒共同转染293t/17细胞，36h后分别加入0.5μm i-5-57进行标记，利用实验方法(五) 检测标记效果。结果显示，paprika-1与sart3-bfp在卡哈尔体(cajal body)上形成共定位，图中亮点即为卡哈尔体，证明利用paprika-1-i-5-57在u6与sart3-bfp相互作用指示卡哈尔体的功能，与文献报道一致(图10)(chen et al.nature biotechnology 2019. 37：1287-1293)。
[0319]
实施例13.paprika-1-i-5-57作为标签在活细胞内对mrna进行标记
[0320]
为了验证paprika-1与i-5-57作为标签在活细胞内对纤维状肌动蛋白actb mrna 进行标记，构建哺乳动物细胞表达质粒。根据已报道文献(chen et al.nature biotechnology2019.37：1287-1293)，构建pcdna3.1/hygro( )-actb和 pcdna3.1/hygro( )-actb-paprika-1，这些质粒分别表达actb和actb-paprika-1(seqid no：14)。
[0321]
首先构建paprika-1与不同rna融合的嵌合rna的表达质粒。因为paprika-1片段较短，可以引物同源重组的方法将引物搭桥获得的paprika-1基因片段插入到 pcdna3.1/hygro( )载体，得到pcdna3.1/hygro( )-paprika-1重组质粒。
[0322]
扩增pcdna3.1/hygro( )-paprika-1片段所用的引物为：
[0323]
上游引物(p16)：
[0324][0325]
下游引物(p17)：
[0326][0327]
全基因合成actb基因片段(actb rna序列：accession nm_001101)，利用引物对
actb基因片段进行扩增，利用实验方法(三)将片段插入到经引物线性化的 pcdna3.1/hygro( )-paprika-1载体中，获得pcdna3.1/hygro( )-actb-paprika-1重组质粒，编码actb-paprika-1嵌合rna。
[0328]
扩增actb片段所用的引物为：
[0329]
上游引物(p18)：5
’‑
atggatgatgatatcgccgc-3’[0330]
下游引物(p19)：5
’‑
ctagaagcatttgcggtggac-3’[0331]
扩增pcdna3.1/hygro( )-actb-paprika-1载体使其线性化所用的引物为：
[0332]
上游引物(p20)：5
’‑ꢀ
cgtccaccgcaaatgcttctagctcgaggccgcggtgtagtatg-3’[0333]
下游引物(p21)：5
’‑ꢀ
gcggcgatatcatcatccatggatccgagctcggtaccaag-3’[0334]
将pcdna3.1/hygro( )-actb和pcdna3.1/hygro( )-actb-paprika-1质粒分别转染进cos-7细胞，24h后分别加入0.5μm i-5-57进行标记，利用实验方法(五)检测标记效果。结果显示，paprika-1-i-5-57可用于actb mrna标记(图11)。
[0335]
实施例14.paprika-1用于rna的提取与纯化的标签
[0336]
为了检测paprika-1用于rna的提取与纯化，将实施例13中的 pcdna3.1/hygro( )-actb-paprika-1重组质粒转染cos-7细胞，24h后收集细胞，利用 eastep super总rna提取试剂盒(promega)提取细胞的总rna。将提取的总rna溶解在含40mm hepes，ph 7.4，125mm kcl，5mm mgcl2的缓冲液中，70℃孵育10min 后，室温放置30min以上。
[0337]
取500ul activated thiol sepharose 4b(ge healthcare)经500μl pbs清洗两次后，加入含10mm tcep(sigma)的pbs室温孵育1h。利用500μl pbs清洗两次后，加入含马来酰胺的i-5-57荧光团分子(mal-i-5-57)于室温反应30min，利用500μl pbs 清洗三次。将经上述处理的总rna与处理过的微珠室温孵育，30min后4000rpm离心 2min，弃上清，利用40mm hepes，ph 7.4，125mm kcl，5mm mgcl2的缓冲液清洗琼脂糖微珠6次，每次均离心去上清。用depc水重悬微珠，70℃处理10min，4000rpm 离心2min，收集上清。在收集的上清中加入1/10体积的naac，2.5倍体积无水乙醇，
ꢀ‑
80℃冰箱放置20min，4℃条件下14000rpm离心10min，留沉淀，弃上清，利用预冷的70％乙醇溶液清洗沉淀，4℃条件下14000rpm离心10min，留沉淀，弃上清，如此反复一次。将沉淀置于室温下5min，待乙醇挥发完后，加入少量体积的depc水重悬沉淀。
[0338]
分别检测细胞破碎后上清液，以及最终高温洗脱后的洗脱液，分别与荧光团i-5-57 孵育后的荧光，以空白细胞的破碎上清为对照。检测结果显示，洗脱液与i-5-57孵育后的荧光显著高于上样前的破碎后上清液(图12)，说明actb-paprika-1 rna得到很好的富集，表明paprika-1可以作为一个标签用于rna的分离与纯化。
[0339]
实施例15.i-5-57及其类似物的合成
[0340]
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于对本发明进行示例性说明，并不用于限制本发明。
[0341]
化合物1
[0342][0343]
5-溴噻吩-2甲醛(0.5g，2.6mmol)和2-甲氨基乙醇(0.78g，10.4mmol)溶于10 ml水
中，ar保护条件下油浴加热100℃，反应过夜，反应结束，冷却至室温，二氯甲烷萃取3遍，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，旋干有机相，残余物进行柱层析，得到 0.4g化合物1，产率84.0％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ9.40(s，1h)，7.65(d，j＝4.5 hz，1h)，6.12(d，j＝4.5hz，1h)，4.86(t，j＝5.4hz，1h)，3.62(q，j＝5.5hz，2h)，3.47(t，j ＝5.6hz，2h)，3.09(s，3h).
[0344]
(i-5-1)
[0345][0346]
化合物1(0.2g，1.08mmol)和2，4-恶唑烷二酮(0.13g，1.30mmol)溶于50ml 无水乙醇中，加入催化量哌啶，ar保护条件下油浴加热90℃，反应3h，反应结束，冷却至室温，体系有大量固体析出，过滤，滤饼用冷乙醇洗两次，真空烘干，即得黄色化合物(i-5-1)0.2g，产率71.4％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.09(s，1h)，7.81(s， 1h)，7.43(d，j＝4.4hz，1h)，6.15(d，j＝4.4hz，1h)，4.87(t，j＝5.3hz，1h)，3.62(q，j＝ 5.5hz，2h)，3.46(t，j＝5.6hz，2h)，3.09(s，3h).
[0347]
(i-5-2)
[0348][0349]
参照(i-5-1)的合成方法，产率75.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ13.09(s，1h)，7.71(s，1h)，7.43(d，j＝4.4hz，1h)，6.15(d，j＝4.4hz，1h)，4.87(t，j＝5.3hz，1h)，3.62 (q，j＝5.5hz，2h)，3.46(t，j＝5.6hz，2h)，3.34(s，3h).
[0350]
化合物2
[0351][0352]
参照(i-5-1)的合成方法，产率71.6％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ14.09(s，1h)， 7.01(s，1h)，7.43(d，j＝4.4hz，1h)，6.15(d，j＝4.4hz，1h)，4.87(t，j＝5.3hz，1h)，3.62 (q，j＝5.5hz，2h)，3.46(t，j＝5.6hz，2h)，3.09(s，3h).
[0353]
化合物3
[0354][0355]
化合物2(0.5g，1.66mmol)溶于乙腈中，之后加入叠氮化钠(1.08g，16.6mmol)，油浴加热60℃，反应24h，待原料化合物2反应完后，用二氯甲烷和水萃取，合并有机相，旋干得到黄色固体，之后将黄色固体用四氢呋喃和水(10∶1)溶解，加入三苯基膦 (0.52g，1.98mmol)还原，反应4h，待反应完全后，旋干四氢呋喃，用二氯甲烷和水萃取，合并有机相，旋干粗产物，粗产物经硅胶柱层析即得到0.25g化合物3，产率50.3％。 1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ14.09(s，1h)，7.01(s，1h)，7.43(d，j＝4.4hz，1h)，6.15 (d，j＝4.4hz，1h)，4.87(t，j＝5.3hz，1h)，3.62(q，j＝5.5hz，2h)，3.46(t，j＝5.6hz，2h)， 3.09(s，3h).
[0356]
(i-5-3)
[0357][0358]
将化合物3(0.25g，0.84mmol)溶于二氯甲烷，氮气的保护下加入二氯甲烷溶解的甲磺酰氯(0.114g，1.0mmol)，室温反应30min，待化合物3完全反应时，用二氯甲烷和水萃取，合并有机相并旋干即得到粗产物，经硅胶柱层析得到(i-5-3)为黄色固体 0.19g，产率59.4％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ14.09(s，1h)，7.01(s，1h)，7.43(d，j ＝4.4hz，1h)，6.15(d，j＝4.4hz，1h)，4.87(t，j＝5.3hz，1h)，3.62(q，j＝5.5hz，2h)，3.46 (t，j＝5.6hz，2h)，3.09(s，3h)，2.93(s，3h).
[0359]
(i-5-4)
[0360][0361]
参照(i-5-1)的合成方法，产率73.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ16.09(s，1h)， 7.91(s，1h)，7.43(d，j＝4.4hz，1h)，6.15(d，j＝4.4hz，1h)，4.87(t，j＝5.3hz，1h)，3.62 (q，j＝5.5hz，2h)，3.46(t，j＝5.6hz，2h)，3.09(s，3h).
[0362]
(i-5-5)
[0363][0364]
参照(i-5-1)的合成方法，产率74.3％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.10(s，1h)， 7.71(s，1h)，7.43(d，j＝4.4hz，1h)，6.15(d，j＝4.4hz，1h)，4.87(t，j＝5.3hz，1h)，4.24(q，2h)，3.62(q，j＝5.5hz，2h)，3.46(t，j＝5.6hz，2h)，3.09(s，3h)，1.20(t，3h).
[0365]
化合物4
[0366][0367]
将5-溴噻吩-2甲醛(0.5g，2.6mmol)溶于二乙醇氨10ml中，ar保护条件下油浴加热100℃，反应过夜，反应结束，冷却至室温，二氯甲烷萃取3遍，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，旋干有机相，残余物进行柱层析，得到0.32g化合物4，产率57.1％。 1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ9.40(s，1h)，7.65(d，j＝4.5hz，1h)，6.12(d，j＝4.5hz， 1h)，4.86(t，j＝5.4hz，1h)，3.62(q，j＝5.5hz，4h)，3.47(t，j＝5.6hz，4h)，3.09(s，3h).
[0368]
(i-5-6)
[0369][0370]
参照(i-5-1)的合成方法，产率70.4％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.10(s，1h)， 11.20(s，1h)，7.51(s，1h)，7.43(d，j＝4.4hz，1h)，6.15(d，j＝4.4hz，1h)，4.87(t，j＝5.3 hz，1h)，3.62(q，j＝5.5hz，4h)，3.46(t，j＝5.6hz，4h)，3.09(s，3h).
[0371]
化合物5
[0372][0373]
参照化合1的合成方法，产率92.5％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.40(s，1h)， 7.65(d，j＝4.5hz，1h)，6.12(d，j＝4.5hz，1h)，3.09(s，6h).
[0374]
(i-5-7)
[0375][0376]
参照(i-5-1)的合成方法，产率89.4％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.09(s，1h)， 7.81(s，1h)，7.43(d，j＝4.4hz，1h)，6.15(d，j＝4.4hz，1h)，3.34(s，3h)，3.09(s，6h).
[0377]
(i-5-8)
[0378][0379]
参照(i-5-1)的合成方法，产率90.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ14.08(s，1h)， 7.51(s，1h)，7.43(d，j＝4.4hz，1h)，6.15(d，j＝4.4hz，1h)，3.09(s，6h).
[0380]
(i-5-9)
[0381][0382]
参照(i-5-1)的合成方法，产率79.5％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ13.01(s，1h)， 7.71(s，1h)，7.43(d，j＝4.4hz，1h)，6.15(d，j＝4.4hz，1h)，3.09(s，6h).
[0383]
(i-5-10)
[0384][0385]
参照(i-5-1)的合成方法，产率80.5％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ15.01(s，1h)， 7.91(s，1h)，7.44(d，j＝4.4hz，1h)，6.17(d，j＝4.4hz，1h)，3.09(s，6h).
[0386]
(i-5-11)
[0387]
[0388]
参照(i-5-1)的合成方法，产率82.7％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.05(s，1h)， 7.56(s，1h)，7.44(d，j＝4.4hz，1h)，6.17(d，j＝4.4hz，1h)，3.09(s，6h).
[0389]
(i-5-12)
[0390][0391]
参照(i-5-1)的合成方法，产率85.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ13.65(s，1h)， 7.66(s，1h)，7.44(d，j＝4.4hz，1h)，6.17(d，j＝4.4hz，1h)，3.09(s，6h).
[0392]
(i-5-13)
[0393][0394][0395]
参照(i-5-1)的合成方法，产率89.1％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.14(s，1h)， 7.59(d，j＝8.6hz，2h)，6.77(d，j＝8.7hz，2h)，6.61(s，1h)，4.74(d，j＝13.1hz，1h)， 4.24(q，2h)，3.56(d，j＝5.9hz，2h)，3.47(t，j＝6.0hz，2h)，3.01(s，3h)，1.20(t，3h).
[0396]
(i-5-14)
[0397][0398]
参照(i-5-1)的合成方法，产率73.6％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)13.14(s，1h)，δ7.67(d，j＝8.6hz，2h)，6.90(s，1h)，6.80(d，j＝8.7hz，2h)，4.75(s，1h)，3.57(d，j＝5.9 hz，2h)，3.51(d，j＝5.7hz，2h)，3.04(s，3h).
[0399]
(i-5-15)
[0400][0401]
参照(i-5-1)的合成方法，产率85.6％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)13.84(s，1h)，δ7.67(d，j＝8.6hz，2h)，6.82(s，1h)，6.80(d，j＝8.7hz，2h)，4.75(s，1h)，3.57(d，j＝5.9 hz，2h)，3.5l(d，j＝5.7hz，2h)，3.04(s，3h).
[0402]
(i-5-16)
[0403][0404][0405]
参照(i-5-1)的合成方法，产率86.7％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)19.94(s，1h)，δ7.67(d，j＝8.6hz，2h)，6.96(s，1h)，6.80(d，j＝8.7hz，2h)，4.75(s，1h)，3.57(d，j＝5.9 hz，2h)，3.51(d，j＝5.7hz，2h)，3.04(s，3h).
[0406]
(i-5-17)
[0407][0408]
参照(i-5-1)的合成方法，产率83.8％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)12.11(s，1h)，δ7.67(d，j＝8.6hz，2h)，7.23(s，1h)，6.80(d，j＝8.7hz，2h)，4.75(s，1h)，3.57(d，j＝5.9 hz，2h)，3.51(d，j＝5.7hz，2h)，3.04(s，3h).
[0409]
(i-5-18)
[0410][0411]
参照(i-5-1)的合成方法，产率84.8％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)12.12(s，1h)，δ7.67(d，j＝8.6hz，2h)，6.93(s，1h)，6.80(d，j＝8.7hz，2h)，4.75(s，1h)，3.57(d，j＝5.9 hz，2h)，3.51(d，j＝5.7hz，2h)，3.04(s，3h).
[0412]
(i-5-19)
[0413][0414][0415]
参照(i-5-1)的合成方法，产率81.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.57(s，1h)， 7.63(s，1h)，7.48-7.35(m，2h)，6.91-6.79(m，2h)，3.04(s，6h).
[0416]
(i-5-20)
[0417][0418]
参照(i-5-1)的合成方法，产率83.4％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ13.87(s，1h)， 7.49(s，1h)，7.45-7.35(m，2h)，6.9l-6.59(m，2h)，4.24(t，j＝5.28，2h)，3.04(s，6h)，2.63 (t，j＝5.28，2h).
[0419]
(i-5-21)
[0420][0421]
参照(i-5-1)的合成方法，产率74.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ14.07(s，1h)， 7.89(s，1h)，7.55-7.25(m，2h)，6.71-6.39(m，2h)，3.06(s，6h).
[0422]
(i-5-22)
[0423][0424]
参照(i-5-1)的合成方法，产率90.8％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ16.27(s，1h)， 7.90(s，1h)，7.65-7.45(m，2h)，6.81-6.41(m，2h)，3.05(s，6h).
[0425]
(i-5-23)
[0426][0427]
参照(i-5-1)的合成方法，产率88.4％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.57(s，1h)， 7.74(s，1h)，7.65-7.45(m，2h)，6.81-6.41(m，2h)，3.05(s，6h).
[0428]
(i-5-24)
[0429][0430]
参照(i-5-1)的合成方法，产率83.1％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.87(s，1h)， 7.94(s，1h)，7.65-7.32(m，2h)，6.78-6.41(m，2h)，3.04(s，6h).
[0431]
化合物6
[0432][0433]
4-溴-2-氟苯甲醛(0.5g，2.5mmol)溶于15ml n-甲基-n-羟乙基胺，加入铜粉(6.4 mg，0.01mmol)，碘化亚铜(19mg，0.01mmol)，磷酸钾(0.63g，2.96mmol)，ar保护条件下80℃油浴加热过夜，反应完毕，冷却至室温，体系倒入50ml水中，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离得0.35g黄色产物化合物6，产率77.8％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)10.21(s，1h)，δ7.67(d，j＝8.6hz，2h)，6.93(s， 1h)，4.55(s，1h)，3.57(d，j＝5.9hz，2h)，3.51(d，j＝5.7hz，2h)，3.02(s，3h).
[0434]
(i-5-25)
[0435][0436]
参照(i-5-1)的合成方法，产率85.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.07(s，1h)， 7.72(s，1h)，δ7.67(d，j＝8.6hz，2h)，6.93(s，1h)，4.55(s，1h)，3.57(d，j＝5.9hz，2h)， 3.51(d，j＝5.7hz，2h)，3.02(s，3h).
[0437]
化合物7
[0438][0439]
参照化合物6的合成方法，产率79.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.21(s， 1h)，δ7.67(d，j＝8.6hz，2h)，6.93(s，1h)，4.55(s，1h)，3.57(d，j＝5.9hz，2h)，3.51(d，j ＝5.7hz，2h)，3.02(s，3h).
[0440]
化合物8
3.51(d，j＝5.7hz，2h)，3.02(s，3h)，2.43(s，3h).
[0452]
化合物11
[0453][0454]
化合物11参照化合物3的合成方法，产率56.3％。1h nmr(400mhz，dmso-d6) δ13.16(s，1h)，7.73(s，1h)，δ7.67(d，j＝8.6hz，2h)，6.93(s，1h)，4.55(s，1h)，3.57(d，j＝ 5.9hz，2h)，3.51(d，j＝5.7hz，2h)，3.02(s，3h)，2.43(s，3h).
[0455]
(i-5-27)
[0456][0457]
参照化合物(i-5-26)的合成方法合成，产率38.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6) δ13.16(s，1h)，7.73(s，1h)，δ7.67(d，j＝8.6hz，2h)，6.93(s，1h)，4.55(s，1h)，3.70(m，2h)， 3.57(d，j＝5.9hz，2h)，3.51(d，j＝5.7hz，2h)，3.48(m，6h)，3.02(s，3h)，2.43(s，3h)，2.35 (m，2h).
[0458]
(i-5-28)
[0459][0460]
参照(i-5-1)的合成方法，产率98.1％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ15.86(s，1h)，7.83(s，1h)，δ7.79(d，j＝8.6hz，2h)，7.03(s，1h)，4.55(s，1h)，3.57(d，j＝5.9hz，2h)， 3.51(d，j＝5.7hz，2h)，3.02(s，3h)，2.43(s，3h).
[0461]
(i-5-29)
[0462][0463]
参照(i-5-1)的合成方法，产率89.3％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.26(s，1h)，
7.63(s，1h)，δ7.59(d，j＝8.6hz，1h)，7.03(d，j＝8.6hz，1h)，6.68(s，1h)，3.61(t，j＝5.3 hz，2h)，2.98(t，j＝5.3hz，2h)，2.75(s，3h).
[0464]
(i-5-30)
[0465][0466]
参照(i-5-1)的合成方法，产率78.5％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.26(s，1h)， 7.63(s，1h)，δ7.59(s，1h)，6.68(s，1h)，3.61(t，j＝5.3hz，2h)，2.98(t，j＝5.3hz，2h)，2.75 (s，3h).
[0467]
化合物12
[0468][0469]
3，4-二氢-2h-苯并[b][1，4]噻嗪(0.30g，2mmol)溶于20ml dmf，加入碳酸铯(0.78 g，2.4mmol)，碘甲烷(0.31g，2.2mmol)，ar保护条件下65℃油浴加热，反应4h，反应完毕，冷却至室温，体系倒入50ml水中，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离得产物0.29g，产率90.6％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ6.98
ꢀ‑
6.94(m，1h)，6.94-6.88(m，1h)，6.67(dd，j＝8.1，1.2hz，1h)，6.57(td，j＝7.5，1.2hz， 1h)，3.57-3.42(m，2h)，3.13-3.00(m，2h)，2.87(s，3h).
[0470]
化合物13
[0471][0472]
三口烧瓶中加入10ml dmf置于冰浴中冷却5min，滴加0.2ml三氯氧磷，冰浴条件下搅拌1 h，化合物4溶于dmf中，滴加到体系中，ar保护和冰浴条件下搅拌0.5h，体系缓慢升至室温，继续搅拌5h，反应完毕，加入饱和碳酸钠溶液调ph＝10.0，室温条件下搅拌过夜，次日分出有机相，水相用二氯甲烷50ml萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤两次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得黄色固体0.25g，产率75.3％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.11(s，1h)，6.98-6.94(m， 1h)，6.94-6.88(m，1h)，6.57(td，j＝7.5，1.2hz，1h)，3.57-3.42(m，2h)，3.13-3.00(m， 2h)，2.87(s，3h).
[0473]
(i-5-31)
[0474][0475]
参照(i-5-1)的合成方法，产率89.8％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ13.61(s，1h)， 7.46(s，1h)，7.28-7.15(m，2h)，6.82(d，j＝8.7hz，1h)，3.76-3.57(m，5h)，3.13-3.05 (m，2h)，3.03(s，3h).
[0476]
(i-5-32)
[0477][0478]
参照(i-5-1)的合成方法，产率69.5％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ14.21(s，1h)， 7.58(s，1h)，7.38-7.15(m，2h)，6.82(d，j＝8.7hz，1h)，3.76-3.57(m，2h)，3.13-3.05 (m，2h)，3.53(s，3h)，3.03(s，3h).
[0479]
(i-5-33)
[0480][0481]
参照(i-5-1)的合成方法，产率85.8％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.75(s，1h)， 7.42(s，1h)，7.38-7.15(m，2h)，6.82(d，j＝8.7hz，1h)，3.76-3.57(m，2h)，3.13-3.05 (m，2h)，3.03(s，3h).
[0482]
(i-5-34)
[0483][0484]
参照(i-5-1)的合成方法，产率99.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ16.05(s，1h)，7.51(s，1h)，7.38-7.15(m，2h)，6.82(d，j＝8.7hz，1h)，3.76-3.57(m，2h)，3.13-3.05 (m，2h)，3.03(s，3h).
[0485]
(i-5-35)
[0486][0487]
参照(i-5-1)的合成方法，产率75.3％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.17(s，1h)， 7.46(s，1h)，7.38-7.15(m，2h)，6.82(d，j＝8.7hz，1h)，4.07(q，j＝5.5hz，3h)，3.76
‑ꢀ
3.57(m，2h)，3.13-3.05(m，2h)，3.03(s，3h)，1.20(t，j＝5.5hz，3h).
[0488]
化合物14
[0489][0490]
化合14参照化合物13的合成方法，产率58.5％。1h nmr(400mhz，dmso-d6) δ10.26(s，1h)，6.98-6.94(m，1h)，6.94-6.88(m，1h)，6.57(td，j＝7.5，1.2hz，1h)，3.38
‑ꢀ
3.32(m，2h)，3.05-2.80(m，2h)，2.69(s，3h).
[0491]
(i-5-36)
[0492][0493]
参照(i-5-1)的合成方法，产率69.3％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ14.52(s，1h)， 7.44(s，1h)，7.38-7.15(m，2h)，6.82(d，j＝8.7hz，1h)，3.56-3.47(m，2h)，3.23-3.05 (m，2h)，3.03(s，3h).
[0494]
(i-5-37)
[0495][0496]
参照(i-5-1)的合成方法，产率89.9％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ13.42(s，1h)， 7.46(s，1h)，7.38-7.15(m，2h)，6.82(d，j＝8.7hz，1h)，3.56-3.47(m，2h)，3.23-3.05 (m，2h)，3.03(s，3h).
[0497]
(i-5-38)
[0498][0499]
参照(i-5-1)的合成方法，产率80.1％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ16.72(s，1h)，7.56(s，1h)，7.48-7.15(m，2h)，6.82(d，j＝8.7hz，1h)，4.40(t，j＝5.1hz，2h)，3.56-3.47 (m，2h)，3.23-3.05(m，2h)，3.03(s，3h)，2.61(t，j＝5.1hz，2h).
[0500]
(i-5-39)
[0501][0502]
参照(i-5-1)的合成方法，产率85.8％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.54(s，1h)， 7.26(s，1h)，7.24-7.15(m，2h)，6.82(d，j＝8.7hz，1h)，3.56-3.47(m，2h)，3.23-3.05 (m，2h)，3.03(s，3h)，2.79(m，2h).
[0503]
(i-5-40)
[0504][0505]
参照(i-5-1)的合成方法，产率76.1％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.78(s，1h)， 7.26(s，1h)，7.24-7.15(m，2h)，6.82(d，j＝8.7hz，1h)，3.59(s，3h)，3.56-3.47(m，2h)， 3.23-3.05(m，2h)，3.03(s，3h)，2.79(m，2h).
[0506]
化合物15
[0507][0508]
化合15参照化合物13的合成方法，产率69.7％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ 10.21(s，1h)，7.33(dd，j＝8.8，2.2hz，1h)，7.15(d，j＝2.2hz，1h)，6.63(d，j＝8.8hz，1h)， 5.47(d，j＝1.5hz，1h)，2.87(s，3h)，1.96(d，j＝1.4hz，3h)，1.34(s，6h).
[0509]
(i-5-41)
[0510][0511]
参照(i-5-1)的合成方法，产率95.1％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ13.57(s，1h)， 7.51(s，1h)，7.33(dd，j＝8.8，2.2hz，1h)，7.15(d，j＝2.2hz，1h)，6.63(d，j＝8.8hz，1h)， 5.47(d，j＝1.5hz，1h)，2.87(s，3h)，1.96(d，j＝1.4hz，3h)，1.34(s，6h).
[0512]
(i-5-42)
[0513][0514]
参照(i-5-1)的合成方法，产率74.6％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ13.86(s，1h)， 7.41(s，1h)，7.33(dd，j＝8.8，2.2hz，1h)，7.15(d，j＝2.2hz，1h)，6.63(d，j＝8.8hz，1h)，5.47(d，j＝1.5hz，1h)，2.87(s，3h)，1.96(d，j＝1.4hz，3h)，1.34(s，6h).
[0515]
(i-5-43)
[0516][0517]
参照(i-5-1)的合成方法，产率93.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ15.72(s，1h)， 7.65(s，1h)，7.33(dd，j＝8.8，2.2hz，1h)，7.15(d，j＝2.2hz，1h)，6.63(d，j＝8.8hz，1h)， 5.47(d，j＝1.5hz，1h)，2.87(s，3h)，1.96(d，j＝1.4hz，3h)，1.34(s，6h).
[0518]
(i-5-44)
[0519][0520]
参照(i-5-1)的合成方法，产率75.9％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.02(s，1h)， 7.35(s，1h)，7.33(dd，j＝8.8，2.2hz，1h)，7.15(d，j＝2.2hz，1h)，6.63(d，j＝8.8hz，1h)， 5.47(d，j＝1.5hz，1h)，4.07(q，j＝5.4hz，2h)，2.87(s，3h)，1.96(d，j＝1.4hz，3h)，1.34(s， 6h)1.20(t，j＝5.4hz，2h).
[0521]
(i-5-45)
[0522][0523]
参照(i-5-1)的合成方法，产率78.9％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ15.72(s，1h)， 7.48(s，1h)，7.33(dd，j＝8.8，2.2hz，1h)，7.15(d，j＝2.2hz，1h)，6.63(d，j＝8.8hz，1h)， 5.47(d，j＝1.5hz，1h)，2.87(s，3h)，1.96(d，j＝1.4hz，3h)，1.34(s，6h).
[0524]
化合物16
[0525][0526]
参照化合物13的合成方法，产率89.4％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.25(s， 1h)，6.95(s，2h)，3.25(dd，j＝6.6，4.9hz，4h)，2.68(t，j＝6.3hz，4h)，2.05-1.57(m，4h). (i-5-46)
[0527][0528]
参照(i-5-1)的合成方法，产率72.7％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.74(s，1h)， 7.61(s，1h)，6.95(s，2h)，3.59(s，3h)，3.25(dd，j＝6.6，4.9hz，4h)，2.68(t，j＝6.3hz，4h)， 2.05-1.57(m，4h).
[0529]
(i-5-47)
[0530][0531]
参照(i-5-1)的合成方法，产率86.7％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.58(s，1h)， 7.46(s，1h)，6.95(s，2h)，3.25(dd，j＝6.6，4.9hz，4h)，2.68(t，j＝6.3hz，4h)，2.05-1.57 (m，4h).
[0532]
(i-5-48)
[0533][0534]
参照(i-5-1)的合成方法，产率92.3％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ15.79(s，1h)， 7.38(s，1h)，6.95(s，2h)，3.25(dd，j＝6.6，4.9hz，4h)，2.68(t，j＝6.3hz，4h)，2.05-1.57 (m，4h).
[0535]
(i-5-49)
[0536][0537]
参照(i-5-1)的合成方法，产率78.3％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.23(s，1h)， 7.35(s，1h)，6.95(s，2h)，3.25(dd，j＝6.6，4.9hz，4h)，2.68(t，j＝6.3hz，4h)，2.05-1.57 (m，4h).
[0538]
(i-5-50)
[0539][0540]
参照(i-5-1)的合成方法，产率71.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.21(s，1h)， 7.31(s，1h)，6.95(s，2h)，3.25(dd，j＝6.6，4.9hz，4h)，2.68(t，j＝6.3hz，4h)，2.05-1.57 (m，4h).
[0541][0542]
噻吩并[3，2-b]噻吩(10g，71.31mmol)加入到250ml三口烧瓶中，加入120ml无水四氢呋喃溶解，置于-78℃下冷却，1.6m的正丁基锂49ml滴加到体系中，保持-78℃2h，关闭制冷，缓慢回到室温，搅拌过夜，反应完后，冰浴下加入40ml水淬灭反应，体系倒入200ml二氯甲烷中，萃取，水相用二氯甲烷萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，残余物柱色谱分离得化合物10.7g。产率90％。1h nmr(400mhz，chloroform-d) δ9.97(s，1h)，7.94(s，1h)，7.70(d，j＝5.3hz，1h)，7.33(d，j＝5.3hz，1h).
[0543]
化合物18
[0544]
化合物9(10g.59.5mmol)溶于120ml干燥的dmf和乙酸(1∶1)的混合溶剂中，加入nbs(11.66g，65.5mmol)，ar保护下油浴加热120℃回流过夜，反应完成后，乙酸乙酯和水萃取三遍，有机相合并干燥，旋干溶剂，剩余物柱层析得到11.2g产物，产率 78％。1h nmr(400mhz，chloroform-d)δ10.01(s，1h)，7.70(d，j＝5.3hz，1h)，7.33(d，j ＝5.3hz，1h).
[0545]
化合物19
[0546]
参照化合1的合成方法，产率85％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ10.15(s，1h)，7.87(s，1h)，6.39(s，1h)，3.09(s，6h).
[0547]
(i-5-51)
[0548][0549]
参照(i-5-1)的合成方法，产率90.2％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ12.25(s，1h)， 8.017(s，1h)，87(s，1h)，6.39(s，1h)，3.09(s，6h).
[0550]
(i-5-52)
[0551][0552]
参照(i-5-1)的合成方法，产率96.1％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ15.35(s，1h)， 7.91(s，1h)，7.87(s，1h)，6.59(s，1h)，3.09(s，6h).
[0553]
(i-5-53)
[0554][0555]
参照(i-5-1)的合成方法，产率71.3％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.35(s，1h)， 7.96(s，1h)，7.57(s，1h)，6.59(s，1h)，3.09(s，6h).
[0556]
(i-5-54)
[0557]
[0558]
参照(i-5-1)的合成方法，产率78.5％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ11.35(s，1h)， 7.64(s，1h)，7.57(s，1h)，6.59(s，1h)，3.09(s，6h).
[0559][0560]
2-溴并二噻吩(0.438g，2mmol)溶于15mln-甲基-n-羟乙基胺，加入铜粉(6.4mg， 0.01 mmo1)，碘化亚铜(19mg，0.01 mmo1)，磷酸三钾(0.850g，4mmol)，ar保护条件下80℃油浴加热过夜，反应完毕，冷却至室温，体系倒入50ml水中，二氯甲烷萃取3次
×
50ml，合并有机相，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离得黄色产物0.362g，产率85％。 1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝7.92(s，1h)，7.63(d，1h，j＝5.2hz)，7.31(d， 1h，j＝5.2hz)，3.85(t，2h，j＝5.6hz)，3.60(t，2h，j＝5.6hz)，3.10(s，3h)。
[0561]
化合物21
[0562]
化合物20(0.426g，2mmol)溶于50ml无水二氯甲烷中，加入1 ml三乙胺，冰浴条件下缓慢滴加醋酸酐(0.3ml，3mmol)，滴加完毕，体系缓慢升至室温，搅拌3h，反应完毕，加水100ml，分出有机相，水相用二氯甲烷50ml二氯甲烷萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物无需进一步纯化，直接用于下一步。
[0563]
上述残余物溶于50ml二氯甲烷中，加入二甲基甲酰胺5ml，冰浴条件下加入三氯氧磷2ml，ar保护条件下搅拌0.5h，体系缓慢升至室温，继续搅拌5h，反应完毕，加入饱和碳酸钠溶液调ph＝10.0，室温条件下搅拌过夜，次日分出有机相，水相用二氯甲烷50ml萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤两次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得黄色固体0.285g，产率59％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝10.01(s，1h)，7.92(s，1h)，7.63(s，1h)3.85(t，2h，j＝5.6hz)， 3.60(t，2h，j＝5.6hz)，3.10(s，3h)。
[0564]
(i-5-55)
[0565][0566]
参照(i-5-1)的合成方法，产率58.1％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝12.31(s， 1h)，7.92(s，1h)，7.63(s，1h)，6.96(s，1h)，3.85(t，2h，j＝5.6hz)，3.60(t，2h， j＝5.6hz)，3.10(s，3h)。
[0567]
(i-5-56)
[0568][0569]
参照(i-5-1)的合成方法，产率70.1％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝13.56(s， 1h)，7.92(s，1h)，7.63(s，1h)，6.96(s，1h)，3.85(t，2h，j＝5.6hz)，3.60(t，2h， j＝5.6hz)，3.10(s，3h)。
[0570]
(i-5-57)
[0571][0572]
参照(i-5-1)的合成方法，产率86.1％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝13.45(s， 1h)，7.92(s，1h)，7.63(s，1h)，6.91(s，1h)，3.85(t，2h，j＝5.6hz)，3.60(t，2h， j＝5.6hz)，3.10(s，3h)。
[0573]
(i-5-58)
[0574][0575]
参照(i-5-1)的合成方法，产率96.8％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝17.23(s， 1h)，7.92(s，1h)，7.63(s，1h)，6.91(s，1h)，3.85(t，2h，j＝5.6hz)，3.60(t，2h， j＝5.6hz)，3.10(s，3h)。
[0576][0577]
化合物22的合成方法参照化合物21的合成方法合成，产率52.1％。1h-nmr(400 mhz，cdcl3)：δ＝10.01(s，1h)，7.92(s，1h)，7.63(s，1h)3.85(t，j＝5.6hz， 4h)，3.60(t，j＝5.6hz，4h)。
[0578]
(i-5-59)
[0579][0580][0581]
参照(i-5-1)的合成方法，产率86.1％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝7.92(s， 1h)，7.63(s，1h)，6.91(s，1h)，3.85(t，j＝5.6hz，4h)，3.60(t，j＝5.6hz，4h)，3.59(s， 3h)。
[0582]
(i-5-60)
[0583][0584]
参照(i-5-1)的合成方法，产率88.6％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝7.92(s， 1h)，7.63(s，1h)，6.65(s，1h)，3.85(t，j＝5.6hz，4h)，3.60(t，j＝5.6hz，4h)，3.45 (s，3h)。
[0585]
化合物23
[0586][0587]
化合物23的合成方法参照化合物19的方法合成，产率82.3％。。1h-nmr(400mhz， cdcl3)：δ＝9.81(s，1h)，7.68(d，1h，j＝7.88hz)，7.55(d，1h，j＝7.88hz)，7.25(d， 2h，j＝8.00hz)，6.78(d，2h，j＝8.00hz)，3.86(t，2h，j＝4.80hz)，3.56(t，2h，j＝4.80 hz)，3.06(s，3h)。
[0588]
(i-5-61)
[0589][0590]
参照(i-5-1)的合成方法，产率84.1％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝13.21(s， 1h)，7.68(d，1h，j＝7.88hz)，7.55(d，1h，j＝7.88hz)，7.25(d，2h，j＝8.00hz)，6.80 (s，1h)，6.78(d，2h，j＝8.00hz)，3.86(t，2h，j＝4.80hz)，3.56(t，2h，j＝4.80hz)， 3.06(s，3h)。
[0591][0592]
化合物24的合成方法参照化合物19的合成方法合成，产率59.3％。1h-nmr(400 mhz，cdcl3)：δ＝10.01(s，1h)，7.68(d，1h，j＝7.88hz)，7.55(d，1h，j＝7.88hz)， 7.25(d，1h，j＝7.65hz)，6.78(d，1h，j＝7.65hz)，3.86(t，2h，j＝4.80hz)，3.56(t，2h， j＝4.80hz)，3.06(s，3h)。
[0593]
(i-5-62)
[0594][0595]
参照(i-5-1)的合成方法，产率78.3％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝11.21(s， 1h)，7.68(d，1h，j＝7.88hz)，7.55(d，1h，j＝7.88hz)，7.25(d，1h，j＝7.65hz)，6.82 (s，1h)，6.78(d，1h，j＝7.65hz)，3.86(t，2h，j＝4.80hz)，3.56(t，2h，j＝4.80hz)， 3.06(s，3h)。
[0596]
化合物25
[0597][0598]
化合物25的合成方法参照化合物19的合成方法合成，产率58.9％。。1h-nmr(400 mhz，cdcl3)：δ＝10.35(s，1h)，7.68(d，1h，j＝7.88hz)，7.55(d，1h，j＝7.88hz)， 7.25(d，2h，j＝8.23hz)，6.78(d，2h，j＝8.23hz)，3.86(t，2h，j＝5.02hz)，3.56(t，2h，j＝5.02hz)，3.06(s，3h)。
[0599]
(i-5-63)
[0600][0601]
参照(i-5-1)的合成方法，产率74.7％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝7.68(d， 1h，j＝7.88hz)，7.55(d，1h，j＝7.88hz)，7.25(d，2h，j＝8.23hz)，6.82(s，1h)，6.78(d， 2h，j＝8.23hz)，3.86(t，2h，j＝5.02hz)，3.56(t，2h，j＝5.02hz)，3.52(s，3h)，3.06 (s，3h)。
[0602]
化合物26
[0603][0604]
化合物的合成参照化合物21的合成方法合成，产率49.6％。1h-nmr(400mhz， cdcl3)：δ＝9.92(s，1h)，7.81(s，1h)，7.68(d，j＝9.0hz，1h)，6.92(s，1h)，6.82(d， j＝9.1，2.3hz，1h)，3.61(t，j＝8.0hz，2h)，3.34(t，j＝8.0hz，2h)，3.10(s，3h)。
[0605]
(i-5-64)
[0606][0607]
参照(i-5-1)的合成方法，产率90.1％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝12.56(s， 1h)，7.81(s，1h)，7.68(d，j＝9.0hz，1h)，6.92(s，1h)，6.85(s，1h)，6.82(d，j＝9.1 hz，1h)，3.61(t，j＝8.0hz，2h)，3.34(t，j＝8.0hz，2h)，3.10(s，3h)。
[0608]
(i-5-65)
[0609][0610]
参照(i-5-1)的合成方法，产率72.3％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝11.01(s， 1h)，7.81(s，1h)，7.68(d，j＝9.0hz，1h)，6.92(s，1h)，6.85(s，1h)，6.82(d，j＝9.1 hz，1h)，3.61(t，j＝8.0hz，2h)，3.34(t，j＝8.0hz，2h)，3.01(s，3h)。
[0611]
(i-5-66)
[0612][0613]
参照(i-5-1)的合成方法，产率95.3％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝16.01(s， 1h)，7.81(s，1h)，7.68(d，j＝9.0hz，1h)，6.92(s，1h)，6.82(d，j＝9.1hz，1h)， 6.65(s，
1h)，3.61(t，j＝8.0hz，2h)，3.34(t，j＝8.0hz，2h)，3.01(s，3h)。
[0614]
化合物27
[0615][0616]
化合物的合成参照化合物21的合成方法合成，产率60.3％。1h-nmr(400mhz， cdcl3)：δ＝9.92(s，1h)，7.81(s，1h)，7.68(d，j＝9.0hz，1h)，6.92(d，j＝2.0hz，1h)，6.82(d，j＝9.1，2.3hz，1h)，3.05(s，6h)。
[0617]
(i-5-67)
[0618][0619]
参照(i-5-1)的合成方法，产率75.5％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝12.06(s， 1h)，7.81(s，1h)，7.68(d，j＝9.0hz，1h)，6.92(d，j＝2.0hz，1h)，6.85(s，1h)，6.82 (d，j＝9.1，2.3hz，1h)，3.05(s，6h)。
[0620]
化合物28
[0621][0622]
化合物28的合成方法参照化合物21的合成方法合成，产率50.6％。1h-nmr(400 mhz，cdcl3)：δ＝10.02(s，1h)，7.81(s，1h)，7.68(d，j＝9.0hz，1h)，6.92(d，j＝ 2.0hz，1h)，6.82(d，j＝9.1，2.3hz，1h)，3.61(t，j＝8.0hz，4h)，3.34(t，j＝8.0hz， 4h)。
[0623]
(i-5-68)
[0624][0625]
参照(i-5-1)的合成方法，产率88.3％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝7.81(s，1h)，7.68(d，j＝9.0hz，1h)，6.92(d，j＝2.0hz，1h)，6.85(s，1h)，6.82(d，j＝9.1， 2.3hz，1h)，3.61(t，j＝8.0hz，4h)，3.52(s，3h)，3.34(t，j＝8.0hz，4h)。
[0626]
化合物29
[0627][0628]
化合物29的合成方法参照化合物21的合成方法合成，产率49.9％。1h-nmr(400 mhz，cdcl3)：δ＝9.92(s，1h)，7.68(d，j＝9.0hz，1h)，6.92(s，1h)，6.82(d，j＝9.1， 2.3hz，1h)，3.61(t，j＝8.0hz，2h)，3.34(t，j＝8.0hz，2h)，3.10(s，3h)。
[0629]
(i-5-69)
[0630][0631]
参照(i-5-1)的合成方法，产率75.3％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝12.31(s， 1h)，7.68(d，j＝9.0hz，1h)，6.92(s，1h)，6.85(s，1h)，6.82(d，j＝9.1，2.3hz， 1h)，3.61(t，j＝8.0hz，2h)，3.34(t，j＝8.0hz，2h)，3.10(s，3h)。
[0632]
(i-5-70)
[0633][0634]
参照(i-5-1)的合成方法，产率48.8％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝7.68(d， j＝9.0hz，1h)，6.92(s，1h)，6.85(s，1h)，6.82(d，j＝9.1，2.3hz，1h)，4.24(t，j ＝5.2hz，2h)，3.61(t，j＝8.0hz，2h)，3.34(t，j＝8.0hz，2h)，3.10(s，3h)，2.63(t， j＝5.2hz，2h)。
[0635]
(i-5-71)
[0636][0637]
参照(i-5-1)的合成方法，产率78.9％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝7.68(d， j＝
9.0hz，1h)，6.92(s，1h)，6.85(s，1h)，6.82(d，j＝9.1，2.3hz，1h)，3.61(t，j ＝8.0hz，2h)，3.52(s，3h)，3.34(t，j＝8.0hz，2h)，3.10(s，3h)。
[0638]
(i-5-72)
[0639][0640]
参照(i-5-1)的合成方法，产率98.4％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝7.68(d， j＝9.0hz，1h)，6.92(s，1h)，6.85(s，1h)，6.82(d，j＝9.1，2.3hz，1h)。
[0641]
化合物30
[0642][0643]
化合物30的合成方法参照化合物19的合成方法合成，产率42.5％。1h-nmr(400 mhz，cdcl3)：δ＝9.92(s，1h)，7.82(s，1h)，7.71(m，1h)，7.60(m，2h)，6.78 (m，2h)，3.82(t，4h，j＝5.6hz)，3.54(t，4h，j＝5.6hz)，1.42(s，6h).
[0644]
(i-5-73)
[0645][0646]
参照(i-5-1)的合成方法，产率88.9％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝12.31(s， 1h)，7.82(s，1h)，7.71(m，lh)，7.60(m，2h)，6.85(s，1h)，6.78(m，2h)， 3.82(t，4h，j＝5.6hz)，3.54(t，4h，j＝5.6hz)，1.42(s，6h).
[0647]
化合物31
[0648][0649]
化合物31的合成方法参照化合物19的合成方法合成，产率82.7％。1h-nmr(400 mhz，cdcl3)：δ＝9.92(s，lh)，7.82(s，1h)，7.7l(m，1h)，7.60(m，2h)，6.78 (m，2h)，3.62(s，6h)，1.42(s，6h).
[0650]
(i-5-74)
[0651][0652]
参照(i-5-1)的合成方法，产率78.3％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝11.23 (s，1h)，7.82(s，1h)，7.71(m，1h)，7.60(m，2h)，6.85(s，1h)，6.78(m， 2h)，3.62(s，6h)，1.42(s，6h).
[0653]
化合物32
[0654][0655]
化合物32的合成方法参照化合物19的合成方法合成，产率63.0％。1h-nmr(400 mhz，cdcl3)：δ＝9.92(s，lh)，7.82(s，1h)，7.7l(m，1h)，7.60(m，2h)，6.78 (m，2h)，3.82(t，j＝5.6hz，2h)，3.54(t，j＝5.6hz，2h)，3.05(s，3h)，1.42 (s，6h).
[0656]
(i-5-75)
[0657][0658]
参照(i-5-1)的合成方法，产率98.3％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝14.89 (s，1h)，7.82(s，1h)，7.71(m，1h)，7.60(m，2h)，6.85(s，1h)，6.78(m， 2h)，3.82(t，j＝5.6hz，2h)，3.54(t，j＝5.6hz，2h)，3.05(s，3h)，1.42(s，6h). (i-5-76)
[0659][0660]
参照(i-5-1)的合成方法，产率72.8％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝12.03 (s，1h)，7.82(s，1h)，7.71(m，lh)，7.60(m，2h)，6.82(s，1h)，6.78(m， 2h)，3.82(t，j＝5.6hz，2h)，3.54(t，j＝5.6hz，2h)，3.05(s，3h)，1.42(s，6h). 化合物33
[0661][0662]
化合物33的合成方法参照化合物19的合成方法合成，产率68.1％。1h-nmr(400 mhz，cdcl3)：δ＝9.92(s，1h)，7.82(s，1h)，7.71(m，1h)，7.60(m，2h)，3.82 (t，j＝5.6hz，2h)，3.54(t，j＝5.6hz，2h)，3.05(s，3h)，1.42(s，6h).
[0663]
(i-5-77)
[0664][0665]
参照(i-5-1)的合成方法，产率70.1％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝12.05(s， 1h)，7.82(s，1h)，7.71(m，lh)，7.60(m，2h)，6.82(s，1h)，3.82(t，j＝5.6 hz，2h)，3.54(t，j＝5.6hz，2h)，3.05(s，3h)，1.42(s，6h)。
[0666]
(i-5-78)
[0667][0668]
参照(i-5-1)的合成方法，产率70.2％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝11.25(s， 1h)，7.82(s，1h)，7.71(m，1h)，7.60(m，2h)，6.82(s，1h)，3.82(t，j＝5.6 hz，2h)，3.54(t，j＝5.6hz，2h)，3.05(s，3h)，1.42(s，6h)。
[0669]
(i-5-79)
[0670][0671]
参照(i-5-1)的合成方法，产率80.6％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝13.01(s， 1h)，7.82(s，1h)，7.71(m，1h)，7.60(m，2h)，6.82(s，1h)，3.82(t，j＝5.6 hz，2h)，3.54(t，j＝5.6hz，2h)，3.05(s，3h)，1.42(s，6h)。
[0672]
化合物34
[0673][0674]
化合物34的合成方法参照化合物19的合成方法合成，产率58.9％。1h-nmr(400 mhz，cdcl3)：δ＝9.92(s，1h)，7.82(s，1h)，7.71(m，1h)，7.60(m，2h)，3.82 (t，j＝5.6hz，4h)，3.54(t，j＝5.6hz，4h)，3.05(s，3h)，1.42(s，6h).
[0675]
(i-5-80)
[0676][0677]
参照(i-5-1)的合成方法，产率90.6％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝7.82(s， 1h)，7.71(m，1h)，7.60(m，2h)，3.82(t，j＝5.6hz，4h)，3.54(t，j＝5.6hz，4 h)，3.55(s，3h)，1.42(s，6h).
[0678]
化合物35
[0679][0680]
化合物35的合成方法参照化合物19的合成方法合成，产率59.7％。1h-nmr(400 mhz，cdcl3)：δ＝10.02(s，1h)，7.82(s，1h)，7.71(s，1h)，3.82(t，j＝5.6hz， 2h)，3.54(t，j＝5.6hz，2h)，3.05(s，3h)，1.42(s，6h).
[0681]
(i-5-81)
[0682][0683]
参照(i-5-1)的合成方法，产率70.2％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝7.82(s， 1h)，7.71(s，1h)，3.82(t，j＝5.6hz，2h)，3.54(t，j＝5.6hz，2h)，3.05(s，3h)， 1.42(s，6h)。
[0684]
(i-5-82)
[0685][0686]
参照(i-5-1)的合成方法，产率95.4％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝14.21(s， 1h)，7.82(s，1h)，7.71(s，1h)，3.82(t，j＝5.6hz，2h)，3.54(t，j＝5.6hz，2h)， 3.05(s，3h)，1.42(s，6h).
[0687]
(i-5-83)
[0688][0689]
参照(i-5-1)的合成方法，产率95.1％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝12.21(s， 1h)，7.82(s，1h)，7.71(s，1h)，3.82(t，j＝5.6hz，2h)，3.54(t，j＝5.6hz，2h)， 3.05(s，3h)，1.42(s，6h).
[0690]
化合物36
[0691][0692]
化合物36的合成方法参照化合物19的合成方法合成，产率63.5％。1h-nmr(400 mhz，cdcl3)：δ＝10.02(s，1h)，7.82(s，1h)，7.71(s，1h)，3.82(t，j＝5.6hz， 4h)，3.54(t，j＝5.6hz，4h)，1.42(s，6h).
[0693]
(i-5-84)
[0694][0695]
参照(i-5-1)的合成方法，产率88.3％。1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ＝7.82(s， 1h)，7.71(s，1h)，3.82(t，j＝5.6hz，4h)，3.54(t，j＝5.6hz，4h)，3.55(s，3h) 1.42(s，6h)。
[0696]
应该理解，本说明书各实施例中的用量、反应条件等除非特别注明均为近似值，可根据实际情况略作改变而获得类似结果。除专门定义外，本文所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所理解的含意相同。本文提及的所有文献都引入本技术作为参考。本说明书中描述的是作为示范用的优选实施方案，本领域技术人员可采用与本文所述相似的
方法及材料实施本发明获得相同或相似的结果，对本发明所作的各种改动或修改仍属于本技术所附权利要求书限定的范围内。