一种高稳定性的慢病毒制剂及其制备方法和其应用与流程

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种高稳定性的慢病毒制剂及其制备方法和其应用。


背景技术：

2.慢病毒由人类免疫缺陷病毒(hiv)去除env、vif、vpr、vpu、nef等毒性基因改造而来，并用作治疗性蛋白/多肽等物质的递送载体。慢病毒能感染大部分处于静止期的造血干细胞(hscs)，用作有效的感染hscs和基因治疗的工具，并用于造血干细胞移植治疗。慢病毒纯化后至施用之间需要保持一定的病毒量和感染性，这就需要慢病毒载体在长期储存过程中保持较高的病毒滴度。但即使将慢病毒存储在非常低的温度(如-80℃)条件下，慢病毒载体也存在滴度明显下降的问题，且存储期间反复冻融也会使病毒滴度明显下降而失去感染力。现有的慢病毒制剂存在下述缺陷：一是需要加入蛋白(如人血清蛋白、白蛋白)或氨基酸，由此产生生物风险，且容易干扰后续检测；二是在低温储存12个月后病毒滴度会显著降低；三是在0℃以上环境下的热稳定性不佳，容易导致慢病毒变性失活。为此，开发稳定性好的慢病毒制剂成为研究热点，以满足临床需求。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种高稳定性的慢病毒制剂，所述慢病毒制剂包括滴度为1
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tu/ml的慢病毒，20-55％(w/v)的糖、0.1-10％(w/v)的金属盐、0.1-10％(w/v)的聚乙二醇peg。
4.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒选自具有感染性的慢病毒病毒体，优选为人免疫缺陷病毒(hiv-1或hiv-2)、猿免疫缺陷病毒(siv)、马传染性脑炎病毒(eiav)、山羊关节炎脑炎病毒(caev)、牛免疫缺陷病毒(biv)、猫免疫缺陷病毒(fiv)中的任一种或其组合，更优选为lv2-car-19慢病毒。
5.本发明的优选技术方案中，所述糖选自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、果聚糖、棉子糖的任一种或其组合。
6.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂中的糖含量为25-50％(w/v)，优选为30-45％(w/v)。
7.本发明的优选技术方案中，所述金属盐选自nacl、kcl、mgcl2、cacl2的任一种或其组合。
8.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂中金属盐的含量为0.2-8％(w/v)，优选为0.3-1.2％(w/v)。
9.本发明优选的技术方案中，所述peg的分子量为1000-10000kda，优选为2000-6000kda，更优选2000-4000kda。
10.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂中peg的含量为0.25-8％(w/v)，优选为0.5-2％(w/v)。
11.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂的ph值为6.5-8.0，优选为7.0-7.5。
12.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂中包含30-45％(w/v)的海藻糖、0.3-1.2％(w/v)的kcl、0.5-2％(w/v)的peg。
13.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂中还包括缓冲液，优选为tris缓冲液、pbs缓冲液中的任一种或其组合。
14.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液与慢病毒生产过程中纯化过滤步骤所用缓冲液相同。
15.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂中缓冲液的浓度为0.01-1m，优选为0.05-0.075m。
16.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液中还含有等渗剂。
17.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液的配置方法为，将0.75-1m的tris缓冲液和1-2m的nacl溶液按体积比1:1混合后再加水稀释。
18.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液为pbs缓冲液，包含2.5％的蔗糖，2mm的氯化镁和10mm的hfpfs。
19.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂是液体制剂或可制成注射用冻干制剂。
20.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂在低温-70℃至-80℃稳定至少3个月，优选6个月，更优选12个月。
21.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂在4℃和-70℃反复冻融条件下储存3个月后，病毒滴度损失≤15％，优选≤10％，更优选≤5％。
22.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂在-70℃冻存条件下储存3个月后，病毒滴度损失≤15％，优选≤10％，更优选≤5％。
23.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂在-70℃冻存条件下储存12个月后，病毒滴度损失失≤15％，优选≤10％，更优选≤5％。
24.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂在-70℃冻存条件下储存12个月后，病毒颗粒数损失≤15％，优选≤10％，更优选≤5％。
25.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂的tm大于45℃，优选大于50℃。
26.本发明的目的在于提供一种高稳定性的慢病毒制剂的制备方法，所述慢病毒制剂包括滴度为1
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tu/ml的慢病毒，20-55％(w/v)的糖、0.1-10％(w/v)的金属盐、0.1-10％(w/v)的peg，所述慢病毒制剂的制备方法包括下述步骤：取慢病毒液，加入到含有糖、金属盐、peg和缓冲液的慢病毒稳定剂中，混合均匀，即得。
27.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒液和慢病毒稳定剂的体积比为1:1-5，优选为1:1-3，更优选为1:1-2。
28.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒选自具有感染性的慢病毒病毒体，优选为人免疫缺陷病毒(hiv-1或hiv-2)、猿免疫缺陷病毒(siv)、马传染性脑炎病毒(eiav)、山羊关节炎脑炎病毒(caev)、牛免疫缺陷病毒(biv)、猫免疫缺陷病毒(fiv)中的任一种或其组合，更优选为lv2-car-19慢病毒载体。
29.本发明的优选技术方案中，所述糖选自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、果聚糖、棉子糖的任一种或其组合。
30.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂中糖的含量为25-50％(w/v)，优选为30-45％(w/v)。
31.本发明的优选技术方案中，所述金属盐选自nacl、kcl、mgcl2、cacl2的任一种或其组合。
32.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂中金属盐的含量为0.2-8％(w/v)，优选为0.3-1.2％(w/v)。
33.本发明优选的技术方案中，所述peg的分子量为1000-10000kda，优选为2000-6000kda，更优选2000-4000kda。
34.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂中peg的含量为0.25-8％(w/v)，优选为0.5-2％(w/v)。
35.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂的ph值为6.5-8.0，优选为7.0-7.5。
36.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂中包含30-45％(w/v)的海藻糖、0.3-1.2％(w/v)的kcl、0.5-2％(w/v)的peg。
37.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂中还包括缓冲液，优选为tris缓冲液、pbs缓冲液中的任一种或其组合。
38.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液与慢病毒生产过程中纯化过滤步骤所用缓冲液相同。
39.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂中缓冲液的浓度为0.01-1m，优选为0.05-0.075m。
40.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液中还含有等渗剂。
41.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液的配置方法为，将0.75-1m的tris缓冲液和1-2m的nacl溶液按体积比1:1混合后再加水稀释。
42.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液为pbs缓冲液，包含2.5％的蔗糖，2mm的氯化镁和10mm的hfpfs。
43.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂是液体制剂或可制成注射用冻干制剂。
44.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂在低温-70℃至-80℃稳定至少3个月，优选6个月，更优选12个月。
45.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂在4℃和-70℃反复冻融条件下储存3个月后，病毒滴度损失≤15％，优选≤10％，更优选≤5％。
46.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂在-70℃冻存条件下储存3个月后，病毒滴度损失≤15％，优选≤10％，更优选≤5％。
47.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂在-70℃冻存条件下储存12个月后，病毒滴度损失失≤15％，优选≤10％，更优选≤5％。
48.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂在-70℃冻存条件下储存12个月后，病毒颗粒数损失≤15％，优选≤10％，更优选≤5％。
49.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒制剂的tm大于45℃，优选大于50℃。
50.本发明的目的在于提供一种高稳定性的慢病毒制剂在制备cart19注射液或表达cd19的t细胞注射液中的应用。
45％(w/v)。
72.本发明的优选技术方案中，所述金属盐选自nacl、kcl、mgcl2、cacl2的任一种或其组合。
73.本发明优选的技术方案中，所述稳定剂中的金属盐含量为0.5-8％(w/v)，优选为1-5％(w/v)。
74.本发明优选的技术方案中，所述peg的分子量为1000kda-10000kda，优选为2000kda-8000kda，更优选4000kda-6000kda。
75.本发明优选的技术方案中，所述稳定剂中的peg含量为0.5-8％(w/v)，优选为0.75-1.50％(w/v)。
76.本发明优选的技术方案中，所述稳定剂中包含30-45％(w/v)的海藻糖、0.1-5％(w/v)的kcl、0.1-5％(w/v)的peg。
77.本发明优选的技术方案中，所述稳定剂中包含35-45％(w/v)的海藻糖、0.5-2％(w/v)的kcl、0.75-1.5％(w/v)的peg2000。
78.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液为tris缓冲液、pbs缓冲液中的任一种或其组合。
79.本发明优选的技术方案中，所述稳定剂中的缓冲液的浓度为0.05-1m，优选为0.075-0.1m。
80.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液与慢病毒生产过程中纯化过滤步骤所用缓冲液相同。
81.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液中还含有等渗剂。
82.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液的配置方法为，将0.75-1m的tris缓冲液和1-2m的nacl溶液按体积比1:1混合后再加水稀释。
83.本发明优选的技术方案中，所述缓冲液为pbs缓冲液，包含2.5％的蔗糖，2mm的氯化镁和10mm的hfpfs。
84.本发明优选的技术方案中，所述稳定剂的ph6.5-8.0，优选为ph7.0-7.5。
85.本发明优选的技术方案中，所述稳定剂的ph值调节剂选自1-3m的盐酸溶液。
86.本发明的目的在于提供一种慢病毒稳定剂在制备高稳定性慢病毒制剂中的应用。
87.本发明优选的技术方案中，所述应用为，将慢病毒液和慢病毒稳定剂按体积比为1:1-5混合均匀，得慢病毒制剂，所述慢病毒制剂包括滴度为1
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tu/ml的慢病毒，20-55％(w/v)的糖、0.1-10％(w/v)的金属盐、0.1-10％(w/v)的peg。
88.本发明优选的技术方案中，所述慢病毒液和慢病毒稳定剂的体积比为1:1-3，优选为1:1-2。
89.为了清楚地表述本发明的保护范围，本发明对下述术语作如下界定：
90.1、“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合单独地在本文列出。例如，“a和/或b”涵盖了“a”、“a和b”以及“b”。例如，“a、b和/或c”涵盖“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。
91.2、tris是指氨丁三醇；
92.3、pbs是指磷酸缓冲盐溶液；
93.4、hpsec是指高效凝胶排阻色谱。
94.5、peg是指聚乙二醇。
95.除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
96.除非另有说明，本发明采用如下检测方法：
97.1.采用hpsec及病毒滴度法检测慢病毒。
98.hpsec检测方法包括下述步骤：
99.1)精确称取nah2po4·
2h2o 1.48g，na2hpo4·
12h2o 14.50g，加水溶解后，定容至1l，将配制成ph7.4的50mm pbs溶液。将配制好的流动相用0.1μm的微孔滤膜过滤。
100.2)接通hplc系统电源，依次打开电脑、自动进样器、脱气泵、泵、检测器。
101.3)打开online软件，进入操作界面，用经过滤和脱气的流动相冲洗，打开排气阀开关冲洗5min后关闭排气阀。
102.4)在1ml/min流速下冲洗整个系统至基线平衡。
103.5)将流速改为0.6ml/min，将色谱柱按照色谱柱标注方向连接至系统，用0.60ml/min的流速平衡高效液相系统至基线平衡。
104.6)设置检测方法并保存方法：流速0.6ml/min，上样体积100μl，运行30min，检测波长为280nm及259nm，压力上限20bar。
105.7)将样品加至装有200μl内插管的液相色谱瓶中。
106.8)设置样品的名称、样品瓶顺序、检测方法、保存位置，运行方法进行样品检测。
107.9)检测完毕后，将色谱柱从液相色谱系统上拆解下来，在1ml/min流速下采用超纯水冲洗20min后，用20％甲醇冲洗10min。
108.2.采用颗粒计数分析系统仪检测病毒颗粒数。
109.3.采用差示扫描荧光(dsf)法检测慢病毒载体变性温度tm。dsf测试前，先用去离子水将荧光染料sybr orange稀释25倍后，取2μl加至18μl各样品溶液中，充分混匀后，全部加至96孔板并用光学封板膜封好后，将其放入荧光定量pcr仪，升温速度为1℃/min，升温25℃至95℃。采用仪器软件对数据进行分析，热变性温度tm计算通过对荧光曲线进行一阶求导后获得，每个样品至少检测三次。
110.与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：
111.1.本发明科学筛选包括糖、金属盐和peg的慢病毒制剂，提高了制剂的安全性和稳定性，使得慢病毒在低温(≤-70℃)可储存长达12个月，在反复冻融条件下也可稳定存放3个月，而不损失病毒感染力，便于慢病毒的制备、临床应用、储存、运输，显著降低其成本，保障药物质量，保障临床用药的有效性和安全性。用于制备cart-19注射液，可显著提高药品的稳定性。
112.2、本发明科学筛选慢病毒制剂的组份及配比，避免对慢病毒活性的影响，稳定病毒结构和增强病毒活性，还能全面提升慢病毒纯化时的活性和回收率，提高慢病毒的转导效率；peg为高分子化合物，具有防止细胞或病毒受物理剪切力的作用而受损，促进病毒与细胞结合，增强病毒感染细胞的能力。
113.3.本发明的制备方法具有操作简便、成本更优，适宜工业化生产等优点。
附图说明
114.图1实施例6-7制得的慢病毒制剂在4℃和-70℃条件下的稳定性考察(图a：hpsec峰面积，图b：病毒滴度)
115.图2实施例8-10制得的慢病毒制剂在-70℃条件下储存0、1、2、3个月的稳定性考察(图a：hpsec峰面积，图b：病毒滴度)
116.图3实施例10制得的慢病毒制剂在-70℃条件下储存12个月的稳定性考察
具体实施方式
117.实施例1本发明慢病毒稳定剂的制备
118.慢病毒稳定剂的组成如下：
[0119][0120][0121]
慢病毒稳定剂的制备包括下述步骤：
[0122]
称取所需量的海藻糖、kcl、peg2000，加入缓冲液(2.5ml 1m tris缓冲液与2.5ml 2m nacl溶液混合而成)，搅拌至溶解，用1m盐酸调节ph7.5，再定容至33.3ml，无菌过滤，即得。
[0123]
实施例2本发明慢病毒稳定剂的制备
[0124]
本发明慢病毒稳定剂的组成如下：
[0125][0126]
慢病毒稳定剂的制备包括下述步骤：
[0127]
称取配方量的海藻糖、kcl、peg2000，加入缓冲液(2.5ml 1m tris缓冲液和2.5ml 2m nacl溶液混合配置而成)，加水至溶解，用1m盐酸调节ph至7.5，再定容至33.3ml，无菌过滤，即得。
[0128]
实施例3慢病毒稳定剂的制备
[0129]
慢病毒稳定剂的组成如下：
[0130][0131]
慢病毒稳定剂的制备包括下述步骤：
[0132]
称取配方量的海藻糖、kcl、peg4000，加入缓冲液(3.3ml 0.75m tris缓冲液和3.3ml 2m nacl溶液混合配置而成)，加水至溶解，用1m盐酸调节ph至7.5，再定容至33.3ml，无菌过滤，即得。
[0133]
实施例4慢病毒稳定剂的制备
[0134]
慢病毒稳定剂的组成如下：
[0135][0136]
慢病毒稳定剂的制备包括下述步骤：
[0137]
称取海藻糖、kcl、peg4000，加入缓冲液(3.3ml 0.75m tris缓冲液和3.3ml 2m nacl溶液混合配置而成)，加水至溶解，用1m盐酸调节ph至7.5，再定容至33.3ml，无菌过滤，即得。
[0138]
实施例5慢病毒稳定剂的制备
[0139]
慢病毒稳定剂的组成如下：
[0140][0141]
慢病毒稳定剂的制备包括下述步骤：
[0142]
称取配方量的海藻糖、kcl、peg2000，加入缓冲液(3.3ml 0.75m ph7.5tris缓冲液和3.3ml 2m nacl溶液混合配置而成)，加水至溶解，用1m盐酸调节ph至7.5，再定容至33.3ml，无菌过滤，即得。
[0143]
实施例6慢病毒制剂的制备
[0144]
(1)对含有慢病毒(lv2-car-19慢病毒载体)的细胞培养物进行澄清过滤，去除其
中的细胞、细胞碎片及其大颗粒杂质，获得含有慢病毒的细胞培养上清液；将上清液浓缩得慢病毒液；
[0145]
(2)取1.1ml慢病毒液，加入到2.2ml实施例1制得的慢病毒稳定剂中，混合均匀，即得。
[0146]
实施例7慢病毒制剂的制备
[0147]
(1)对含有慢病毒(lv2-car-19慢病毒载体)的细胞培养物进行澄清过滤，去除其中的细胞、细胞碎片及其大颗粒杂质，获得含有慢病毒的细胞培养上清液；将上清液浓缩得慢病毒液；
[0148]
(2)取1.1ml慢病毒液，加入到2.2ml实施例2制得的慢病毒稳定剂中，混合均匀，即得。
[0149]
实施例8慢病毒制剂的制备
[0150]
(1)对含有慢病毒(lv2-car-19慢病毒载体)的细胞培养物进行澄清过滤，去除其中的细胞、细胞碎片及其大颗粒杂质，获得含有慢病毒的细胞培养上清液；将上清液浓缩得慢病毒液；
[0151]
(2)取1.1ml慢病毒液，加入到2.2ml实施例3制得的慢病毒稳定剂中，混合均匀，即得。
[0152]
实施例9慢病毒制剂的制备
[0153]
(1)对含有慢病毒(lv2-car-19慢病毒载体)的细胞培养物进行澄清过滤，去除其中的细胞、细胞碎片及其大颗粒杂质，获得含有慢病毒的细胞培养上清液；将上清液浓缩得慢病毒液；
[0154]
(2)取1.1ml慢病毒液，加入到2.2ml实施例4制得的慢病毒稳定剂中，混合均匀，即得。
[0155]
实施例10慢病毒制剂的制备
[0156]
(1)对含有慢病毒(lv2-car-19慢病毒载体)的细胞培养物进行澄清过滤，去除其中的细胞、细胞碎片及其大颗粒杂质，获得含有慢病毒的细胞培养上清液；将上清液浓缩得慢病毒液；
[0157]
(2)取1.1ml慢病毒液，加入到2.2ml实施例5制得的慢病毒稳定剂中，混合均匀，即得。
[0158]
试验例1 4℃和-70℃条件下的慢病毒制剂稳定性试验
[0159]
将实施例6-7制备的慢病毒制剂置于4℃和-70℃条件下冻存(操作见表1)，检测hpsec及病毒滴度。第3周和9周样品均为冻融1次后立即检测，第6周样品经过冻融2次及4℃放置3天后检测，第12周样品经过冻融1次及4℃放置3天后检测。结果见图1(a)和图1(b)，hpsec检测和滴度变化不明显，损失率低于10％。
[0160]
表1
[0161][0162]
试验例2慢病毒制剂在-70℃条件下存储3个月的稳定性研究
[0163]
取实施例8-10的慢病毒制剂，于-70℃及以下冻存0，1，2，3个月，采用hpsec检测及滴度检测，考察慢病毒制剂的储存稳定性。结果见图2(a)和图2(b)，本发明慢病毒制剂在-70℃及以下储存3个月，hpsec检测和滴度变化不明显，损失率小于10％。
[0164]
试验例3慢病毒制剂在-70℃条件下存储12个月的稳定性研究
[0165]
取实施例10的慢病毒制剂，于-70℃及以下冻存0，1，2，3，6，9，12个月，考察慢病毒制剂的储存稳定性。采用hpsec及病毒滴度法进行检测，并采用颗粒计数进行颗粒数的测定(图3)，结果表明，慢病毒制剂在12个月的储存中，hpsec检测、滴度变化和颗粒数变化均不明显，损失率均低于10％。此外，采用差示扫描荧光(dsf)进行慢病毒制剂变性温度(tm)测定，慢病毒制剂的tm(℃)为51.2℃，热稳定性好。
[0166]
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。