黑曲霉种子及其制备方法以及黑曲霉发酵产柠檬酸的方法与流程

1.本发明涉及柠檬酸发酵领域，具体涉及一种黑曲霉种子及其制备方法以及黑曲霉发酵产柠檬酸的方法。


背景技术：

2.目前在柠檬酸行业中，发酵生产柠檬酸的过程为：黑曲霉孢子接种到种子罐的种子培养基中萌发、生长成菌丝球，将菌丝球接种到发酵罐培养基中合成生产柠檬酸。如果以菌丝球形态接到发酵罐时，由于菌丝受搅拌剪切力的作用容易断裂成碎片，造成发酵液的增稠，不利于产酸。
3.然而，菌丝球与培养基中的营养、氧等接触面积小，菌丝球内部传热传质均受到影响，常常处于缺氧状态，因此大大降低了菌丝体产酸效率。由于形成菌丝球后，菌丝球内部传质传热受到限制，为了加强菌丝球内部的供氧，需要很大的通风和搅拌转速，而搅拌转速过快又会对菌球造成破坏，大的通风造成能源消耗大。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种黑曲霉种子及其制备方法以及黑曲霉发酵产柠檬酸的方法，该方法使得发酵过程中黑曲霉以菌丝的形态进行发酵，且能够提高产酸效率。
5.为了实现上述目的，本发明一方面提供一种黑曲霉种子的制备方法，该方法包括：将黑曲霉孢子接种到种子培养基中，在多孔载体的存在下进行培养，得到黑曲霉种子；
6.其中，所述多孔载体的孔径大小为200-500ppi。
7.优选地，所述多孔载体的添加量为5-10g/l种子培养基。
8.本发明第二方面提供如上所述的方法制备得到的黑曲霉种子。
9.本发明第三方面提供一种黑曲霉发酵产柠檬酸的方法，该方法包括将如上所述的方法制备得到的黑曲霉种子接种到发酵培养基中进行发酵生产柠檬酸。
10.本发明中，通过在种子培养基中添加多孔载体，使得接种的黑曲霉孢子吸附到所述多孔载体上进行培养。孢子萌发生成菌丝，菌丝至少有部分在所述多孔载体的孔道中，受载体的保护，不会断裂，为后续的发酵提供了优良的种子。
11.通过本发明的方法制备得到的负载到多孔载体上的黑曲霉种子接种到发酵培养基中培养，大大避免了菌丝缠绕成菌球，从而导致的传质传热效率降低的问题，同时菌丝能够充分与发酵培养基接触，能够在降低接种量的情况下，大大提高产酸的效率，降低搅拌转速和通风量，使得能耗也大幅降低。
具体实施方式
12.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各
个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
13.本发明第一方面提供一种黑曲霉种子的制备方法，该方法包括：将黑曲霉孢子接种到种子培养基中，在多孔载体的存在下进行培养，得到黑曲霉种子；
14.其中，所述多孔载体的孔径大小为200-500ppi(比如可以为200、250、300、350、400、450、500ppi以及任意两个值之间组成的任意范围)。
15.本发明通过将黑曲霉孢子接种到含有多孔载体的种子培养基中进行培养，使得孢子能够吸附到多孔载体上，并萌发生成菌丝，避免了菌丝球的形成，同时还能够尽可能地防止生成的菌丝在培养过程中被剪切断裂成小段。
16.在本发明中，ppi是单位孔隙密度，用来表示单位英寸长度上的平均孔数。比如，10ppi的意思是指的在过滤网上单位英寸长度上的平均孔数是10个。
17.在本发明中，优选地，所述多孔载体的孔径大小为250-450ppi。在所述优选的情况下，能够进一步提高黑曲霉发酵产柠檬酸的效果。
18.在本发明中，单个多孔载体的体积可以在较宽的范围内选择，优选地，单个所述多孔载体的体积为小于4cm3，更优选小于2cm3。
19.所述多孔载体的形状可以是任意的形状，比如可以为球形或多面体(优选为正多面体或接近正多面体或球形的其他多面体)。
20.在本发明中，优选地，单个所述多孔载体的直径或边长为1-2cm。
21.用于制备所述多孔载体的材料可以是本领域常规能够用于制备多孔载体的材料，优选地，所述多孔载体的材质包括聚氨酯类、纳米碳化硅类和丙基硅胶类中的至少一种。
22.所述多孔载体的添加量可以在较宽的范围内选择，优选地，所述多孔载体的添加量为5-10g/l种子培养基，更优选为6-9g/l种子培养基，进一步优选为6-8g/l种子培养基。
23.在本发明中，所述黑曲霉孢子的制备方法可以是本领域常规的制备方法，比如可以使用麸皮用于黑曲霉孢子的制备，具体可以参见cn 112175837 a。
24.所述黑曲霉孢子的接种量可以在较宽的范围内选择，优选地，所述黑曲霉孢子的接种量使得接种后的种子培养基中黑曲霉孢子的含量为1
×
10
5-1
×
106cfu/ml。
25.采用本发明所述的方法，能够使得黑曲霉孢子的接种量降低一半以上。
26.孢子的数量可以通过本领域公知的方法测定，例如，黑曲霉麸曲中、黑曲霉孢子悬浮液中、黑曲霉种子液中的孢子数均可以按照血球平板计数法测得。具体地，该方法为：称取1g黑曲霉麸曲5组，每组中加入4体积％的无菌生理盐水，经过磁力搅拌器和超声波使孢子成为游离状态，分别在显微镜下进行孢子计数，取5组得到的数据的平均值。
27.应当理解的是，孢子往往以孢子悬浮液的方式接种，可以控制孢子悬浮液的添加量和孢子悬浮液中孢子的含量控制接种量。
28.在本发明中，将获得的孢子接种到种子培养基中进行培养，对于所述种子培养基没有特别的限制，可以是本领域常规的种子培养基，例如，可以是淀粉质原料酶解液化液，加水稀释至总糖含量为5-20重量％，得到种子培养液。
29.在本发明的一个优选的实施方式中，所述种子培养基包含淀粉质原料酶解液化液、硫酸铵和磷酸氢二钾。优选地，所述种子培养基的ph为5-6。
30.在本发明中，所述种子培养基中各组分的含量可以在较宽的范围内选择。具体的，
所述种子培养基中的总糖含量可以为5-20重量％。以总糖干重计，所述硫酸铵的含量可以为0.6-1.0重量％，所述磷酸氢二钾的含量可以为0.2-0.5重量％。
31.在本发明中，所述总糖含量的测定方法可以是本领域公知的各种方法，优选为费林法，参照国标gbt50099-2008。
32.在本发明中，所述淀粉质原料可以是本领域常规使用的富含淀粉的原料，比如玉米、小麦、红薯、土豆、大米中的一种或多种，优选为玉米。
33.在本发明中，对于将黑曲霉孢子接种到种子液中进行培养的条件没有特别的限定，可以是本领域常用的条件，例如，可以包括：培养的温度为33-40℃，起始ph值为5-6。
34.所述培养的时间可以在较宽的范围内选择，优选地，培养时间为20-22h。
35.在本发明中，搅拌转速均以发酵罐的体积为2m3为例，优选地，所述培养的过程中，控制转速不高于90rpm，优选为70-80rpm。在所述优选的情况下，即可满足供氧需求，同时有利于菌丝的生长且在载体内呈现较为松散的状态，降低搅拌剪切力对载体和附着在载体内菌丝的破坏。应当理解的是，当发酵罐的体积更小时，其搅拌转速会相应提高。
36.优选地，所述培养的过程中，控制通风量为0.12-0.15vvm。在所述优选的情况下，即可满足供氧需求，降低能源消耗，同时，该通风条件下也有利于黑曲霉生长形成松散菌丝的状态。
37.术语“通气量”，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(v/v
·
min或vvm)，例如通气比为1:0.1-1，简称通气量为0.1-1vvm。
38.在本发明中，经过培养，能够得到黑曲霉种子，所述黑曲霉种子包含负载到多孔载体上的黑曲霉菌丝。应当理解的是，所述黑曲霉种子还包含游离在种子培养基中的黑曲霉菌丝。
39.本发明第二方面提供如上所述的方法制备得到的黑曲霉种子。
40.应当理解的是，所述黑曲霉种子包含负载到多孔载体上的黑曲霉菌丝。
41.本发明第三方面提供一种黑曲霉发酵产柠檬酸的方法，该方法包括将如上所述的方法制备得到的黑曲霉种子接种到发酵培养基中进行发酵生产柠檬酸。
42.优选地，以发酵培养基的体积为基准，所述黑曲霉种子的接种量为7-10体积％。
43.根据本发明的发酵制备柠檬酸的方法，对发酵培养基的成分没有特别的要求，只要可以用于柠檬酸发酵的发酵培养基即可。优选地，发酵培养基含有由淀粉质原料酶解得到的酶解产物，且优选由淀粉质原料酶解得到的酶解产物的量占发酵培养基总量的80-100重量％。
44.一般地，淀粉质原料酶解得到的产物称为液化液，液化液经固液分离得到酶解残渣和液化清液，通常可以将液化清液用于制备发酵培养基，也可以将液化清液与液化液混合后用于制备发酵培养基。因此，本发明中，所述由淀粉质原料酶解得到的酶解产物包括上述经固液分离得到的液化清液，也包括未经固液分离的液化液，还包括上述二者的混合物。
45.发酵培养基优选由液化液和液化清液与水混合或不与水混合得到，且进一步优选以发酵培养基的总重量为100重量份为基准，液化清液的用量为85-90重量份，液化液的用量为10-15重量份。
46.根据本发明的发酵制备柠檬酸的方法，液化清液可以通过多种方法制备得到，例如，可以通过如下方法制备得到：将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物进行酶解，酶解得到
的产物再经固液分离，得到液化清液和酶解残渣，固液分离的条件使酶解残渣的固含量为45-55重量％，优选为49-51重量％。
47.根据本发明的发酵制备柠檬酸的方法，淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，比如玉米、小麦、红薯、土豆、大米中的一种或多种，优选为玉米。
48.所述酶解步骤可以通过本领域常用的方法完成，比如向粉碎产物中添加产酶微生物和/或酶，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下保温完成。所述产酶微生物为能够分泌淀粉酶的产酶微生物。所述酶包括淀粉酶。
49.由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克粉碎后的粉碎产物的干重计，淀粉酶的用量为15-50个酶活力单位。
50.本发明中，酶活力单位的定义为：在ph值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
51.酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为70-105℃，更优选为90-95℃。酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选酶解的时间为90-150分钟，更优选为100-120分钟。酶解的ph值可以在很大范围内改变，优选为5-7，更优选为5.4-6.2。
52.淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。所述淀粉酶可以通过商购获得。
53.在本发明中，固液分离的方法与装置为本领域技术人员所公知，例如，压滤机或离心机。
54.优选地，所述发酵的过程中，控制转速不高于80rpm，优选为60-70rpm。
55.优选地，所述发酵的过程中，控制通风量为0.12-0.15vvm。
56.在所述优选的转速和通气量的情况下，即可满足供氧需求，降低能源消耗，也有利于黑曲霉发酵生产柠檬酸。
57.所述发酵的条件可以在较宽的范围内选择，优选地，所述发酵的条件包括：温度为33-40℃，初始ph为2-5。
58.在本发明中，采用本发明所述的黑曲霉种子进行发酵产柠檬酸，避免了传统培养方法获得的菌丝直接接种到发酵培养基后，因搅拌剪切力而导致的断裂从而造成发酵液的增稠情况，也利于发酵结束后菌体和培养基的分离，降低分离成本。
59.另外，本发明的发明人还发现，负载在多孔载体上的黑曲霉种子可以重复利用，即可以进行多次发酵，发酵次数4-5次以后，其发酵效率才会明显降低。
60.在本发明中，可以根据不同工业产品的要求分离并精制柠檬酸，比如中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装。
61.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
62.所述黑曲霉购自国家标准品网，型号为黑曲霉98003。
63.酸度：中和1克化学物质所需的氢氧化钾(koh)的毫克数，通过《gb1987-2007食品添加剂柠檬酸》的方法测得，单位为％。
64.转化率：即柠檬酸的转化率，转化率(％)＝(柠檬酸发酵液的浓度
×
柠檬酸发酵液的体积/总糖的重量)
×
100％，其中所述柠檬酸发酵液的浓度为酸度。
65.氨水中nh3的质量浓度为4％，磷酸氢二钾溶液中k2hpo4的质量浓度为1％。
66.种子培养基中的总糖含量均指以费林法测定的还原糖含量计的糖含量。
67.在以下实施例和对比例中，发酵在2m3的发酵罐中进行。
68.在以下实施例中，均进行三次重复实验，获得的结果为平均值。
69.制备例1
70.本制备例用于说明本发明中黑曲霉孢子的制备
71.取成熟麸曲用无菌水冲洗并过滤，然后加入到35℃、ph为6.5的无菌水中，然后并入钢瓶中进行保温震荡4h，得到分散均匀的孢子悬浮液，其中，孢子浓度为3.0
×
108个孢子/ml悬浮液。
72.制备例2
73.本制备例用于说明本发明中种子培养基的制备
74.将玉米进行粉碎，得到粉碎后产物，将粉碎后的产物按16重量％的浓度调浆，相对于每克粉碎后的产物，加入30个酶活力单位的淀粉酶(诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶)，进入喷射器，在95℃、ph为5.8的条件下酶解110分钟，得到酶解液化液，采用费林法测定的酶解液化液总糖的含量。
75.按照总糖为4.5t加入酶解液化液，将酶解液化液投入种子罐，再向种子罐中添加50kg的硫酸铵和25kg的磷酸二氢钾，调节ph至5.8，并定容至40m3。按照正常灭菌流程进行灭菌操作，灭菌结束后冷却至36℃备用。
76.制备例3
77.本制备例用于说明本发明中发酵培养基的制备
78.按照制备例2的方法制备得到酶解液化液，将部分酶解液化液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和酶解残渣，其中，酶解残渣的固含量为50重量％。将上述液化清液和酶解液化液按照10:1的重量比混合后并进行灭菌，得到发酵培养基。
79.实施例1
80.本实施例用于说明本发明所述的黑曲霉种子的制备以及柠檬酸的发酵。
81.(1)黑曲霉种子的制备
82.将灭菌后的直径为1cm、孔径大小为350ppi的球形多孔载体(材质为聚氨酯)加入制备例2制备的种子培养基中，用于黑曲霉种子的培养。其中，所述多孔载体的添加量为8g/l种子培养基。
83.将制备例1获得的孢子悬浮液接种到制备例2制备的种子培养基中，其中接种量为0.05体积％，培养温度为35
±
2℃，通气量为0.16vvm，搅拌转速为80rpm。培养26小时后，结束培养，得到黑曲霉种子。
84.(2)柠檬酸的发酵
85.将步骤(1)制备得到的黑曲霉种子液加入到制备例3得到的发酵培养基中开始发酵，以发酵培养基的体积为基准，所述黑曲霉种子液的接种量为10体积％，发酵条件包括温度为37℃，起始ph值为4.5，通气量为0.15vvm，搅拌转速为70rpm，还原糖为0g/100ml时，停止发酵，进行固液分离，得到发酵上清液和发酵后菌体。
86.记录发酵周期，并测定固液分离后上清液的酸度，计算柠檬酸的转化率，具体结果见表1(为实施例1-1)。
87.此外，将发酵后菌体重新按照步骤(2)的方式接种、发酵，重复两次(也即连续发酵三次)，测定每次发酵的酸度和柠檬酸转化率，结果见表1(分别为实施例1-2和1-3)。
88.实施例2
89.本实施例用于说明本发明所述的黑曲霉种子的制备以及柠檬酸的发酵。
90.(1)黑曲霉种子的制备
91.将灭菌后的直径为1.2cm、孔径大小为250ppi的球形多孔载体(材质为聚氨酯)加入制备例2制备的种子培养基中，用于黑曲霉种子的培养。其中，所述多孔载体的添加量为9g/l种子培养基。
92.将制备例1获得的孢子悬浮液接种到制备例2制备的种子培养基中，其中接种量为0.04体积％，培养温度为35
±
2℃，通气量为0.16vvm，搅拌转速为80rpm。培养25小时后，结束培养，得到黑曲霉种子。
93.(2)柠檬酸的发酵
94.将步骤(1)制备得到的黑曲霉种子液加入到制备例3得到的发酵培养基中开始发酵，以发酵培养基的体积为基准，所述黑曲霉的接种量为10体积％，发酵条件包括温度为37℃，起始ph值为4.5，通气量为0.16vvm，还原糖为0g/100ml时，停止发酵，进行固液分离，得到发酵上清液和发酵后菌体。
95.记录发酵周期，并测定固液分离后上清液的酸度，计算柠檬酸的转化率，具体结果见表1。
96.实施例3
97.本实施例用于说明本发明所述的黑曲霉种子的制备以及柠檬酸的发酵。
98.(1)黑曲霉种子的制备
99.将灭菌后的直径为1.5cm、孔径大小为450ppi的球形多孔载体(材质为聚氨酯)加入制备例2制备的种子培养基中，用于黑曲霉种子的培养。其中，所述多孔载体的添加量为10g/l种子培养基。
100.将制备例1获得的孢子悬浮液接种到制备例2制备的种子培养基中，其中接种量为0.06体积％，培养温度为35
±
2℃，通气量为0.16vvm，搅拌转速为80rpm。培养25小时后，结束培养，得到黑曲霉种子。
101.(2)柠檬酸的发酵
102.将步骤(1)制备得到的黑曲霉种子液加入到制备例3得到的发酵培养基中开始发酵，以发酵培养基的体积为基准，所述黑曲霉的接种量为10体积％，发酵条件包括温度为37℃，起始ph值为4.5，通气量为0.16vvm，还原糖为0g/100ml时，停止发酵，进行固液分离，得到发酵上清液和发酵后菌体。
103.记录发酵周期，并测定固液分离后上清液的酸度，计算柠檬酸的转化率，具体结果见表1。
104.实施例4
105.本实施例用于说明本发明所述的黑曲霉种子的制备以及柠檬酸的发酵。
106.按照实施例1所述的方法进行操作，不同的是，所述多孔载体为直径为2cm的球形载体，孔径大小为500ppi，添加量为10g/l种子培养基。
107.记录发酵周期，并测定固液分离后上清液的酸度，计算柠檬酸的转化率，具体结果
见表1。
108.实施例5
109.本实施例用于说明本发明所述的黑曲霉种子的制备以及柠檬酸的发酵。
110.按照实施例1所述的方法进行操作，不同的是，所述多孔载体为直径为3cm的球形载体，孔径大小为200ppi，添加量为5g/l种子培养基。
111.记录发酵周期，并测定固液分离后上清液的酸度，计算柠檬酸的转化率，具体结果见表1。
112.对比例1
113.本对比例用于说明常规的黑曲霉种子的制备方法以及柠檬酸的发酵。
114.按照实施例1所述的方法进行操作，不同的是，不使用多孔载体，也即，不向所述种子培养基中添加多孔载体。
115.记录发酵周期，并测定固液分离后上清液的酸度，计算柠檬酸的转化率，具体结果见表1。
116.此外，在发酵过程中，由于搅拌转速和通风量较低，使得菌丝松散不能有效抱团成菌球状，菌丝没有得到载体的保护，在搅拌的剪切力作用下菌丝不断的断裂、料液粘稠，不利于氧的传递等等，使得发酵效率较低。
117.对比例2
118.本对比例用于说明常规的黑曲霉种子的制备方法以及柠檬酸的发酵。
119.按照对比例1所述的方法进行操作，不同的是，步骤(1)中，接种量为0.1体积％，搅拌转速调整为100rpm，通风量为0.2；步骤(2)中，接种量为10体积％，搅拌转速调整为100rpm，通风量为0.2。
120.记录发酵周期，并测定固液分离后上清液的酸度，计算柠檬酸的转化率，具体结果见表1。
121.此外，虽然在高转速和大通风的条件下，菌丝抱团成球较好，但由于菌球内部传氧传质等较差，发酵效率不高；同时，由于菌球没有被载体进行吸附，菌体个体较小，终点固液分离时不能有效分离，需要使用板框进行加压过滤分离，菌体不能被重复利用。
122.对比例3
123.本对比例用于说明常规的黑曲霉种子的制备方法以及柠檬酸的发酵。
124.按照实施例1所述的方法进行操作，不同的是，多孔载体的孔径为10ppi。
125.记录发酵周期，并测定固液分离后上清液的酸度，计算柠檬酸的转化率，具体结果见表1。
126.发酵过程中，由于搅拌转速和通风较低，使得菌丝松散不能有效抱团成球状，而载体孔径较大，虽然能够起到一定的保护作用，但仍不能够有效吸附并保护菌丝，在搅拌的剪切力作用下菌丝不断的断裂、料液粘稠，不利于氧的传递，使得发酵效率较低。
127.在孔径更大(比如5ppi)的情况下，多孔载体基本无法吸附菌丝，增加该多孔载体后，反而使得发酵液的干物质更高，更为粘稠，发酵效果甚至比对比例1更差。
128.表1
129.实施例编号发酵周期/h酸度％柠檬转化率％实施例1-14817.599.45
实施例1-24817.599.46实施例1-34917.499.32实施例25217.299.01实施例35317.298.95实施例45417.399.21实施例55717.299.03对比例17814.381.95对比例26416.794.91对比例36914.685.80
130.通过表1的结果可以看出，实施例1-5采用本发明的技术方案，在优选的低通风、低搅拌转速的条件下，培养黑曲霉菌丝并利用本发明所述的多孔载体对菌丝进行固定化保护的发酵技术，与对比例1-3相比，周期和转化率均有明显的优势效果。
131.而对比例1采用相同的培养基和培养条件下，只是不添加任何载体时，在发酵过程中菌丝被破坏成大量断丝、物料粘稠，发酵周期大大延长且发酵转化率非常低，发酵基本失败。对比例2中在不添加载体的情况下，通过提高搅拌转速和通风量能够实现正常发酵，但是其发酵周期较实施例更长，发酵效果也较差。对比例3中虽然添加了多孔载体，但是在其孔隙较大的情况下，也无法有效吸附菌丝，对菌丝进行保护，也会造成料液粘稠、发酵效率低等问题。
132.本发明所述的技术方案具有种子罐孢子接种量少，发酵罐搅拌转速低、通风量低，菌丝发酵效率高等明显优势。
133.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征、载体形状以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。