一种利用拉巴豆与甜高粱混合发酵制备饲料的方法

1.本发明涉及农产品加工技术领域中，一种利用拉巴豆与甜高粱混合发酵制备粗饲料的方法。


背景技术：

2.甜高粱又称粟，芦稷，是禾本科一年生粮饲、糖料与牧草兼用作物，具有生物产量高，含糖量高的特点，常用于青贮发酵。拉巴豆，也叫眉豆、扁豆等，是一种多年生豆科牧草。产草量高，含有丰富的维生素和蛋白质，其固氮能力可改善土壤性能，因此通常将拉巴豆作为轮茬作物或间套作模式植物来提升地力。拉巴豆中可溶性糖含量较低，很难单独青贮成功。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何解决豆科牧草(尤其是拉巴豆)不易青贮的难题，获得优质的豆科青贮饲料。
4.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备拉巴豆与甜高粱混合饲料的方法，所述方法包括：将青贮原料与植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)菌剂混合，得到发酵前混合物，将所述发酵前混合物进行固体厌氧发酵，收集发酵产物，得到拉巴豆与甜高粱混合饲料；
5.所述青贮原料为由拉巴豆茎叶与甜高粱秸秆组成的混合物。
6.所述拉巴豆茎叶和所述甜高粱秸秆均可为2-4cm小段。
7.上述方法中，所述青贮原料为将拉巴豆与甜高粱共同播种得到的两种植物的地上部分。在生长过程中，拉巴豆缠绕在甜高粱上。播种时拉巴豆与甜高粱的种子质量比可为9：1。
8.上述方法中，所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)可为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)wq-01。
9.上述方法中，所述发酵前混合物中，所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)的含量可为5
×
108cfu/g。
10.上述方法中，所述发酵可在20～25℃进行。
11.上述方法中，所述发酵时间可为30-90天(如60天)。
12.所述发酵可在真空、密封、避光条件下进行，具体可在密封的聚乙烯袋中进行。
13.利用所述制备拉巴豆与甜高粱混合饲料的方法制备得到的拉巴豆与甜高粱混合饲料，也属于本发明的保护范围。
14.本发明还提供了用于制备拉巴豆与甜高粱混合饲料的组合物，所述组合物由所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)菌剂与所述青贮原料组成。
15.所述制备拉巴豆与甜高粱混合饲料的方法，或所述拉巴豆与甜高粱混合饲料，或所述组合物在制备动物饲料中的应用，也属于本发明的保护范围。
16.所述动物可为反刍动物。
17.本发明的制备拉巴豆与甜高粱混合饲料的方法节约管理成本和人力物力，为甜高粱与拉巴豆混合播种的推广提供理论依据。另外，利用本发明的制备拉巴豆与甜高粱混合饲料的方法得到的拉巴豆与甜高粱混饲料具有ph值低、乳酸菌数量多、无霉变、蛋白含量高、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量低的特点，提高了养殖户的经济效益。
附图说明
18.图1为不同比例拉巴豆与甜高粱混合青贮60天后的微生物菌群组成。
具体实施方式
19.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
20.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验。
21.实施例1、拉巴豆和甜高粱混合饲料的制备
22.本实施例利用植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)wq-01(简称为植物乳杆菌wq-01)制备了拉巴豆和甜高粱混合饲料。
23.其中，植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)wq-01记载在中国专利申请202010258231.8(申请公布号cn 111534456 a)中。
24.一、菌剂的制备
25.利用mrs液体培养基(北京索莱宝科技有限公司，货号m8540-250g)培养植物乳杆菌wq-01，培养条件为37℃厌氧培养48小时，收集培养液，离心，收集菌体，利用生理盐水洗三次后，收集菌体即得到植物乳杆菌wq-01菌剂。
26.二、拉巴豆和甜高粱混合饲料的制备
27.甜高粱与拉巴豆的混合：在播种时按照拉巴豆种子：甜高粱种子重量比分别为1：1、5：1、9：1混合，待收割时拉巴豆缠绕于甜高粱上。将完熟期甜高粱秸秆及其上缠绕的结实期的拉巴豆茎叶切割(甜高粱秸秆切割长度为2-4cm)后备用；而后将步骤一所得植物乳杆菌wq-01菌剂均匀喷洒到拉巴豆和甜高粱混合物中，搅拌均匀，得到发酵前混合物，发酵前混合物中植物乳杆菌wq-01的活菌含量为5
×
108cfu/g；取400g发酵前混合物装入聚乙烯袋中，抽真空后避光青贮发酵60天，室内平均温度在20～25℃之间。对照组为不添加植物乳杆菌wq-01菌剂的拉巴豆与甜高粱混合物，记为ck；试验组记为lp；每组设置6个重复。
28.三、拉巴豆和甜高粱混合饲料的检测
29.取青贮发酵60天前后的样品测定ph，然后由cvas饲料分析中国服务中心检测干物质(dm)含量、乳酸含量、乙酸含量、丙酸含量和丁酸含量；粗蛋白(cp)、中性洗涤纤维(ndf)、酸性洗涤纤维(adf)、酸性洗涤木质素(adl)、醇溶性碳水化合物(wsc)、氨态氮的含量。检测方法依据https://chinese.foragelab.com/resources/lab-procedures所述。
30.基于高通量测序的微生物分析：
31.青贮发酵60天后取样，取10.0g样品用于dna提取，使用illumina miseq平台进行测序。通过配对末端测序(2
×
300bp)对微生物dna进行分析。细菌16s rdna扩增子测序使用338f(actcctacg ggaggcagcag)和806r(ggactachvgggtwtctaat)通用引物。使用qiime质量控制过程获得高质量的序列，并使用uchime算法检测和删除嵌合序列。得到out表格，根据物种注释结果，采用最大值排序法，选取每组在各分类水平(phylum、class、order、family、genus、species)上最大丰度排名靠前的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各组在不同分类水平上微生物组成以及相对丰度和比例。
32.四、结果分析
33.1.混合比例对发酵品质的影响
34.如表1所示，青贮60天后，和对照组(ck)相比，试验组(lp)的ph和干物质含量均有所降低，说明设置的三种混合比例均能使ph降至4.2以下，而且试验组(lp)中所添加的植物乳杆菌菌剂能够较好的维持低ph；试验组(lp)中的乳酸含量均高于对照组，乙酸含量均低于对照组，说明试验组(lp)中主要发生了同型发酵；在对照组和试验组中均未检测到丙酸和丁酸，产乳酸量最高和产乙酸量最低的均为h组。
35.表1不同比例拉巴豆与甜高粱混合青贮60天后干物质含量、ph和有机酸含量
[0036][0037]
表1中，l表示拉巴豆种子：甜高粱种子重量比为1：1，m表示拉巴豆种子：甜高粱种子重量比为5：1，h表示拉巴豆种子：甜高粱种子重量比为9：1；
[0038]
sem是指标准误，全称standard error of mean，是描述均数抽样分布的离散程度及衡量均数抽样误差大小的尺度；
[0039]
％为质量百分比；
[0040]
同一行数据中，标有相同字母的数据间无显著差异，标有不同字母的数据间有显著差异。
[0041]
2.混合比例对营养品质的影响：
[0042]
如表2所示，与对照组(ck)相比，试验组(lp)的粗蛋白含量均显著增加。在h组中，试验组(lp)的中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量均有所降低，酸性洗涤木质素含量变化不显著，说明该组的纤维素消化率较高；在l组和m组中，试验组(lp)的中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维以及酸性洗涤木质素的含量均相较于对照组(ck)有所增加。中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维是反映纤维质量好坏的最直接指标，酸性洗涤纤维与动物消化率呈负相关，其含量
越低，饲草的消化率越高，饲用价值也越大。试验组(lp)中的氨态氮含量均显著降低，说明在这三种混合比例下，植物乳杆菌的添加能够抑制蛋白质的分解，氨态氮含量最低的是m组。试验组(lp)中除l组外，m组和h组的醇溶性碳水化合物含量均增加。在对照组(ck)中，相对饲用价值随着拉巴豆比例呈正相关，同时所有试验组(lp)的相对饲用价值均高于对照组(ck)，说明植物乳杆菌菌剂cgmcc no.13318与混合比例共同提高了饲料的相对饲用价值。
[0043]
表2不同比例拉巴豆与甜高粱混合青贮60天后的营养品质
[0044][0045][0046]
表2中，l表示拉巴豆种子：甜高粱种子重量比为1：1，m表示拉巴豆种子：甜高粱种子重量比为5：1，h表示拉巴豆种子：甜高粱种子重量比为9：1；
[0047]
相对饲用价值是衡量牧草采食量和能量价值的重要指标，相对饲用价值(rfv)、干物质采食量(dm)以及可消化干物质(ddm)计算公式如下：rfv＝dmi
×
ddm/1.29；dme＝120/ndf(％dm)；ddm＝88.9-0.779
×
adf(％dm)；
[0048]
sem是指指标准误，全称standard error of mean，是描述均数抽样分布的离散程度及衡量均数抽样误差大小的尺度；
[0049]
％为质量百分比；
[0050]
同一行数据中，标有相同字母的数据间无显著差异，标有不同字母的数据间有显著差异。
[0051]
3.混合比例对微生物菌群的影响
[0052]
如图1所示，青贮60天后，在ck组中，随着拉巴豆比例的提高，乳杆菌属(lactobacillus)的丰度随之增加(ck-l：33.11％，ck-m：54.34％，ck-l：77.88％)，魏斯氏属的丰度依次降低(ck-l：39.83％，ck-m：36.77％，ck-l：3.79％)，条件致病菌乌尔新不动杆菌的丰度也随着拉巴豆比例的提高而减少(ck-l：6.4％，ck-m：0.43
‰
，ck-l：0.58
‰
)；在lp组中，乳杆菌属(lactobacillus)的丰度均高于90％，成为优势菌，且乳杆菌丰度与拉巴豆比例存在一定的正相关性(ck-l：93.45％，ck-m：96.10％，ck-l：96.15％)；魏斯氏属的丰度与拉巴豆比例呈现负相关性(ck-l：2.56％，ck-m：1.08％，ck-l：6.13
‰
)，乌尔新不动杆菌的丰度均低于1
‰
。
[0053]
表3不同比例拉巴豆与甜高粱混合青贮60天后的微生物菌群组成
[0054] ck.lck.mck.hlp.llp.mlp.h乳杆菌属33.96％55.18％80.39％94.76％97.21％97.51％魏斯氏菌属40.17％37.03％4.04％2.59％1.09％0.62％不动杆菌属6.51％0.10％0.03％0.07％0.04％0.06％克雷伯氏菌属4.67％0.83％1.47％0.22％0.06％0.06％奈瑟氏菌属0.69％0.32％1.11％0.00％0.00％0.00％粪杆菌0.95％0.22％0.35％0.03％0.02％0.04％沙雷氏菌属2.33％0.07％0.10％0.08％0.03％0.01％罗思氏菌属0.70％0.30％0.73％0.00％0.00％0.00％链球菌属0.52％0.31％0.83％0.02％0.02％0.02％偶氮弧菌0.00％0.01％0.61％0.00％0.00％0.00％unidentified_chloroplast1.29％1.23％0.58％0.21％0.21％0.12％罗河杆菌属0.00％0.00％0.58％0.02％0.03％0.01％肠杆菌属1.52％0.25％0.18％0.07％0.02％0.01％劳特罗普氏菌属0.40％0.11％0.30％0.00％0.00％0.00％毛螺菌属0.22％0.31％0.05％0.00％0.00％0.01％食酸菌属0.00％0.01％0.28％0.00％0.00％0.00％软弱贫养菌属0.22％0.10％0.18％0.00％0.00％0.00％直肠真杆菌属0.13％0.13％0.23％0.01％0.01％0.01％副球菌属0.01％0.01％0.20％0.00％0.00％0.00％瘤胃球菌属0.13％0.01％0.18％0.00％0.00％0.00％其他5.59％3.46％7.58％1.91％1.25％1.52％
[0055]
表3中，ck.l、ck.m、ck.h分别表示对照组中拉巴豆种子：甜高粱种子重量比为1：1，、5：1、9：1，lp.l、lp.m、lp.h分别表示试验组中拉巴豆种子：甜高粱种子重量比为1：1，、5：1、9：1。
[0056]
综上所述，将甜高粱与拉巴豆按照1:9比例播种收割后混合发酵后获得的饲料同时具有乳酸含量高，中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维以及木质素低，乳杆菌丰度高的特点，是最优的甜高粱与拉巴豆混合比例。
[0057]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。
总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。