北虫草萃取物及其用于抗氧化及抗疲劳的用途的制作方法

北虫草萃取物及其用于抗氧化及抗疲劳的用途
【技术领域】
1.本发明提供一种北虫草萃取物及其用于抗氧化及抗疲劳的用途， 该北虫草萃取物包含腺苷(adenosine)及虫草素(cordycepin)，可用于清除人体内的 自由基，降低运动后血尿素氮、got与gtp的升高，以延长肌耐力。


背景技术：

2.北冬虫夏草(cordyceps militaris)又名北虫草或蛹虫草，是方虫、 草结合的药用真菌，属于去角菌科，北虫草，其有滋补作用和多种功效，为一 种新兴的珍贵中药材。
3.北虫草与冬虫夏草同属异种，通过人工培育的方式于七十天后即 可获得其子实体，因此相较于冬虫夏草更容易进行人工栽培；且其主要药用成 分虫草素的含量比冬虫夏草高出数10倍，因此已被当作冬虫夏草的最佳替代品， 已被大量进行规模化的人工栽培。
4.北虫草中的虫草素和虫草多糖为北虫草的最主要药用成分，其具 有抗菌、消炎、抗肿瘤、调节人体内分泌和增强免疫功能等显著作用。
5.因此，如何有效地自北虫草中萃取出其虫草素和虫草多糖，并进 行其萃取物的大量生产，俨然成为一项重要议题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，为解决上述问题，本发明的主要目的是提供一种北虫 草萃取物及其用于抗氧化及抗疲劳的用途，该北虫草萃取物包含腺苷(adenosine) 及虫草素(cordycepin)，是将北虫草以溶媒萃取制成，其中该溶媒为选自由水或 有机溶剂所组成的群组。
7.于一较佳实施例，前述北虫草萃取物中，所使用的有机溶剂为 95％、70％、50％、25％的酒精。
8.于一较佳实施例，前述北虫草萃取物中，所使用的有机溶剂为 95％酒精。
9.于一较佳实施例，前述北虫草萃取物，是用于清除自由基。
10.于一较佳实施例，前述北虫草萃取物，是用于降低运动后血尿素 氮。
11.于一较佳实施例，前述北虫草萃取物，是用于延长肌耐力。
12.于一较佳实施例，前述北虫草萃取物，是用于降低运动后的got 与gtp升高。
13.于一较佳实施例，前述北虫草萃取物的萃取方法，包含：取北虫 草加入溶媒，其中该溶媒为选自由水或有机溶剂所组成的群组；在30～60℃、 100～500rpm震荡水浴的条件下连续萃取8～24小时；将萃取后的样品过滤后，减 压浓缩并干燥。
14.于一较佳实施例，前述北虫草萃取物的萃取方法中，该震荡水浴 的温度为50℃。
15.于一较佳实施例，前述北虫草萃取物的萃取方法中，该连续萃取 时间为8小时。
16.是以，通过本发明的实施，可有效自北虫草中萃取出腺苷及虫草 素，并通过溶媒萃取制成北虫草萃取物，从而清除人体内的自由基，降低运动 后血尿素氮、got与gtp的升高，以延长肌耐力，促进国人的健康。
17.以下根据具体实施方式及申请专利范围的揭露，将使本发明的其 他特征及优点显而易见。因此，本发明其他方面将由以下揭示内容所描述，而 该些方面皆属于本发明的范围内。中间化合物亦构成本文公开发明的一部分。
【附图说明】
18.图1为北虫草在不同溶媒萃取下所得的萃取物其dpph自由基清 除率。
19.图2为北虫草在不同溶媒萃取下所得的萃取物其清除超氧阴离 子自由基能力测定。
【具体实施方式】
20.本文中所使用的词汇“包含”或“包括”是指除了描述的组成、 步骤、操作指令及/或元素以外，不排除一或多个其他组成、步骤、操作指令及/ 或存在或附加元素。
21.本文中所使用的词汇“一”是指该冠词的语法对象为一或一个以 上(例如：至少为一)。
22.本发明提供一种北虫草萃取物及其用于抗氧化及抗疲劳的用途， 该北虫草萃取物包含腺苷(adenosine)及虫草素(cordycepin)，是将北虫草以溶媒萃 取制成，其中该溶媒为选自由水或有机溶剂所组成的群组。此外，于本发明的 较佳实施例中，该北虫草萃取物是以下方法萃取，其包含：取北虫草加入溶媒， 其中该溶媒为选自由水及有机溶剂所组成的群组；在30～60℃、100～500rpm震 荡水浴的条件下连续萃取8～24小时；及将萃取后的样品过滤后，减压浓缩并干 燥。
23.本文中所使用的术语“腺苷”是核苷的一种，由核糖(呋喃核糖) 与腺嘌呤的一部分组成，中间由β-n9-配糖键(β-n9-glycosidic bond)连结；腺苷在 生物化学上扮演重要角色，包括以腺苷三磷酸(atp)或腺苷双磷酸(adp)形式转 移能量，或是以环状腺苷单磷酸(camp)进行信号传递等。
24.本文中所使用的术语「虫草素」，又称3'-脱氧腺苷，是腺嘌呤核 糖核苷的衍生物，具有分子式:c
10h13
n5o3，分子量:251.24，在近年的研究中认 为，虫草素可抑制白血病细胞生长、癌干细胞活性及其与癌细胞相关间叶干细 胞的交互作用；此外，也曾有报导指出虫草素可抑制肝癌细胞生长与细胞迁移 能力。
25.本文中所使用的术语“溶媒萃取”，是指利用水及有机溶剂所组 成的群组，从北虫草中萃取腺苷(adenosine)及虫草素(cordycepin)的方式。
26.本文中所使用的术语「有机溶剂」，是指可用以萃取出腺苷及虫 草素的溶剂，例如但不限于酒精、汽油、氯仿及丙酮等。于本发明一较佳实施 例中为酒精，但不限于此。在本发明实施例中，该有机溶剂的浓度可为25～95％， 例如25～30％、30～35％、40～45％、50～55％、60～65％、70～75％、80～85％ 或90～95％。于一较佳实施例中，该有机溶剂的浓度为90～95％，例如90％、91％、 92％、93％、94％或95％。
27.在本发明实施例中，该震荡水浴温度可为20℃～80℃，例如 20℃～40℃、40℃～60℃、60℃或60℃～80℃。于一较佳实施例中，该震荡水 浴温度为40℃～60℃，例如40℃、50℃或60℃。
28.在本发明实施例中，该震荡水浴的每分钟转速可为100rpm～ 700rpm，例如100rpm
～300rpm、300rpm～500rpm或500rpm～700rpm。于一较佳 实施例中，该震荡水浴的每分钟转速为100rpm～300rpm进行，例如100rpm、 200rpm或300rpm。
29.在本发明实施例中，该萃取时间可为1～24小时，例如1～3小时、 3～6小时、6～9小时、9～12小时、12～15小时、15～18小时、18～22小时、或 22～24小时。于一较佳实施例中，该萃取时间为6～9小时，例如6小时、7小时、 8小时或9小时。
30.在本发明实施例中，该减压浓缩温度可为20℃～80℃，例如 20℃～40℃、40℃～60℃、60℃或60℃～80℃。于一较佳实施例中，该减压浓 缩温度为40℃～60℃，例如40℃、50℃或60℃。
31.本发明中所得的北虫草萃取物可用于清除自由基、降低运动后血 尿素氮、延长肌耐力及降低运动后的got与gtp升高。
[0032]“自由基”是指身体经过新陈代谢后所产生的物质，活性极强， 很容易与其他物质做反应。当组织器官受伤，会累积大量的自由基，它是一个 不稳定的因子，会攻击健康细胞，抢夺健康细胞的电子，引发细胞凋亡而导致 老化。
[0033]“血尿素氮”是指血液中的尿素所含的氮，就称为尿素氮；尿素 是蛋白质代谢的最终产物，经肾脏排泄到体外。若肾功能障碍而导致排泄机能 低下时，会导致血中的尿素氮增加；此外，若过度运动，血中的尿素氮亦会增 加，因此，血尿素氮为评估与控制运动负荷的科学依据。
[0034]
got(或称为ast)与gpt(或称为alt)是肝脏内的两种酵素，因 此，被称的为肝功能指数，gpt大多存在于肝细胞内，而got除了存在肝脏之 外，还存在于心肌、肌肉及红血球。若过度运动，肝功能指数亦会增加，因此， 肝功能指数也可评估与控制运动负荷的科学依据。
[0035]
本文中，该北虫草萃取物可投与哺乳动物及非哺乳动物，前 述哺乳动物包括但不限于：人类、非人灵长类动物、绵羊、狗、鼠类啮齿 动物(如：小鼠、大鼠等)、天竺鼠、猫、兔、牛、马；前述非哺乳动物包 括但不限于：鸡、两栖类动物及爬行类动物。较佳地，该使用者是人类。
[0036]
本文中，该北虫草萃取物可用于例如制造食品、医药品、原料 等的用途。本发明食品之例可列举营养补助食品、健康食品、机能性食品、幼 儿用食品、老人用食品等。本说明书中，食品为固体、流体及液体及该等的混 合物，较佳为液体。如作为医药品(如前药)，其剂型并无特别限制，可作成溶液 状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型，且必要时可含有其他的医 药活性成分或补助成分(例如载剂成分)。
[0037]
实施例
[0038]
以下将通过示范性实施例更详细地说明本发明。虽然本文揭示示 范性实施例，但应理解其是用于说明本发明而非用以限制本发明的范围。
[0039]
实施例1：不同北虫草萃取配方对北虫草萃取物去除自由基能力 的试验
[0040]
北虫草萃取配方筛选
[0041]
实验方法：
[0042]
取北虫草加入以不同溶媒，分别为95％、70％、50％和25％酒精 与水，并在50℃、200rpm震荡水浴的条件下连续萃取8小时，最后将萃取所得 的样品以滤纸抽气过滤，于50℃减压浓缩并干燥。
[0043]
实验结果：
[0044]
由下表1的结果所示，北虫草萃取物以水的萃取率最佳，为46.90
ꢀ±
3.62％；以95％酒精进行萃取所得的萃取率最差，仅为12.94
±
2.14％。
[0045]
表1：北虫草萃取物经由不同萃取溶媒所得萃取物的产率。 萃取溶剂萃取率(％)h2o46.90
±
3.6225％etoh35.42
±
2.1750％etoh35.00
±
2.4270％etoh30.82
±
1.9495％etoh12.94
±
2.14注：每组数据由三次实验平均所得，以平均值
±
标准误差(mean
±
s.e.m.)来 表示。
[0046]
实施例2：不同北虫草萃取配方取得的北虫草萃取物成分分析
[0047]
实验方法：
[0048]
虫草素含量检测：高效液相层析法(hplc)
[0049]
取标准品虫草素(cordycepin)作为指标成分，并制作其检量线来 确认其成分含量。
[0050]
腺苷含量检测：高效液相层析法(hplc)
[0051]
取标准品腺苷(adenosine)作为指标成分，并制作其检量线来确认 其成分含量。
[0052]
实验结果：
[0053]
如下表2所示，腺苷萃取物含量以在以水作为溶媒萃取所得的萃 取率最佳，为2292.0
±
3.51μg/g；以在以70％酒精作为溶媒萃所得的萃取率最 差，为1499.5
±
2.51μg/g。虫草素萃取物含量以在以95％酒精作为溶媒萃所得的 萃取率最佳，为10440.8
±
2.96μg/g；以在以70％酒精作为溶媒萃所得的萃取率 最差，为6935.2
±
2.61μg/g。
[0054]
表2：北虫草萃取物于不同萃取溶媒下的腺苷和虫草素含量注：每组数据由三次实验平均所得，以平均值
±
标准误差(mean
±
s.e.m.)来 表示。
[0055]
实施例3：不同北虫草萃取配方取得的北虫草萃取物的体外活性 评估
[0056]
实验方法：
[0057]
1.体外清除α,α-二苯基-β-苦基苯肼(dpph，α,α-diphenyl
‑ꢀ
β-picrylhydrazyl)自由基效力测定
[0058]
dpph自由基清除能力的测定是依据shimada等提出的方法，通过 取1ml、0.1mm的dpph甲醇溶液与1ml、0～2mg的不同浓度的发酵甲醇溶液 进行混合，再于室温下静置30分钟，最后以分光光度计测量其于517nm的吸光 值。
[0059]
dpph的清除率(％)以下列公式计算：
[0060]
清除率(％)＝[(abs
control-abs
sample
)/abs
control
]
×
100
[0061]
2.清除超氧阴离子自由基能力测定
[0062]
参考robak and gryglewski所提出的方法，取500μl不同浓度的 萃取物并依序加入以ph 7.4的磷酸钠缓冲液，配置80μm的pms、624μm的 nadh、200μm的nbt溶液进行混合，再振荡20秒后于室温静置14分钟，最后 以分光亮度计测量其于560nm的吸光值。若吸光值越低，则表示该样品清除超 氧阴离子的能力越强。
[0063]
超氧阴离子的清除效应百分率(scavenging effects％)以下列公式 计算：
[0064]
[1-(样品于560nm的吸光值/未添加样品的控制组于560nm的吸 光值)]
×
100％
[0065]
实验结果：
[0066]
由图1及图2的结果(每组数据由三次实验平均所得，以平均值
±ꢀ
标准误差(mean
±
s.e.m.)来表示)所示，北虫草以水作为溶媒来进行萃取的萃取 率最佳。此外，体外清除dpph自由基的效力与清除超氧阴离子自由基的活性亦 以水作为溶媒来进行萃取具最佳效果。
[0067]
由于北虫草以95％酒精作为溶媒来进行萃取所得的虫草素萃取 物含量最高，为10440.8
±
2.96μg/g，故以此萃取物型态的北虫草配方，以进一步 进行抗疲劳功效性评估。
[0068]
实施例4：摄入以95％酒精作为溶媒取得的北虫草萃取物(以下 简称为北虫草萃取物)其推迟运动期间疲劳发生或促进运动后疲劳消除的试验
[0069]
以下将依据中国台湾地区卫生署公告「健康食品的抗疲劳功能评估方 法(920829卫署食字第0920401629号公告)」进行北虫草的抗疲劳功能性评估。
[0070]
实验动物处置
[0071]
从乐斯科实验动物繁殖及研究中心所购置的sd品系雄性8～10周 龄的大白鼠，并饲养于大仁科技大学动物中心。动物饲养室有灯光及温度控制， 白天保持光亮，晚上保持黑暗，温度维持于25
±
1℃，相对湿度55
±
5下。每日让 大白鼠自由饮水，基础饲料采饮食方式给予喂食，饲料采福寿牌啮齿类动物饲 料。
[0072]
剂量与组别设计
[0073]
分为对照组、正控制组及喂饲样品剂量组，剂量组分别为建议摄 取量的1倍、2倍、5倍的剂量组。实验期分别于四周结束后，进行运动能力测试 与生化值的测定。运动能力是以游泳耐力做为测试项目；生化值的测定方法使 用市售的生化试剂直接测定之。
[0074]
评估试验方法
[0075]
抗疲劳的评估流程包含体能挑战与疲劳恢复，即于体能挑战后， 观察各疲劳恢复指标的变化情形，如果因特殊营养品的介入而使得疲劳恢复指 针加速改善，即可显示该特殊营养品具有抗疲劳的功效。
[0076]
1.抗疲劳功能性评估
[0077]
北虫草萃取物对sd大鼠的体重影响分析
[0078]
实验方法：
[0079]
分组sd大鼠喂食的1倍剂量为100mg/kg，2倍剂量为200mg/kg， 而5倍剂量则为500mg/kg。对照组则是喂食中草药刺五加的酒精萃出物100 mg/kg，刺五加的酒精萃出物已经由委托实验室证实喂食100mg/kg具有明显抗 疲劳功效。
[0080]
实验结果：
[0081]
由下表3的结果所示，经过统计分析，每周各组的体重并无呈现 显著差异，显示喂食水的空白组、喂食刺五加的对照组与100mg/kg、200mg/kg 与500mg/kg不同剂量的北虫草酒精萃出物。结果显示喂食北虫草萃取物对sd大 鼠的平均体重并无显著影响。
[0082]
表3：sd大鼠管喂北虫草样品产品饲养期间每周的重量变化注1：空白组：喂食生理食盐水；对照组：喂食100mg/kg刺五加；1倍剂 量喂食100mg/kg、2倍剂量喂食200mg/kg、5倍剂量喂食500mg/kg的北虫草酒精 萃出物。注2：数值以统计软件spss中单因子变方分析(one-way anova)进行统计 处理，再以duncan's multiple range test作各组间的差异性比较，p《0.05表具有 显著差异(n＝10)。
[0083]
于管喂sd大鼠后第三周起隔日让sd大鼠先适应水性共三次，每 次游泳5～10分钟，之后休息三天后开始游泳运动相关试验，而休息与运动测试 期间则持续管喂北虫草酒精萃出物，以进一步进行抗疲劳功能性评估。
[0084]
2.抗疲劳功能性评估
[0085]
游泳后对sd大鼠的血尿素氮分析
[0086]
实验方式：
[0087]
于游泳前对sd大鼠采血一次，游泳90分钟后休息60分钟再采血 一次，再分析其血尿素氮的数值的变化。
[0088]
实验结果：
[0089]
由下表4的结果所示，游泳前各组sd大鼠的血尿素氮数值介于 11.8～13.1mg/dl，于统计上并无显著的差异性。游泳后空白组的血尿素氮为 22.2
±
2.2mg/dl；对照组的血尿素氮为18.3
±
1.3mg/dl；实验组则介于18.2～18.9 mg/dl之间，将实验组或对照组与空白组比较，于统计上皆呈现显著差异，显示 刺五加或北虫草酒精萃出物对降低运动所造成的血尿素氮升高有明显的效果。
[0090]
由下表4的结果所示，空白组的游泳耐力时间为22.1
±
5.5分钟；对 照组的游泳耐力时间为35.3
±
3.9分钟；实验组的时间介于40.9～52.8之间，于统 计上空白组与对照组、实验组间呈现显著差异，喂食刺五加的对照组与喂食蛹 虫草酒精萃取物的实验组sd大鼠其游泳耐力明显较空白组延长。
[0091]
由下表4的结果所示，空白组的肌耐力吊棉绳试验时间为6.9
±
1.4 秒；对照组时间为14.4
±
2.0分钟；实验组的时间介于16.4～22.1分钟之间，于统 计上空白组与对照组、实验组间统计上呈现显著差异，喂食蛹虫草酒精萃出物 肌耐力时间明显较空白组延长1.9～3.9倍以上的时间。结果显示喂食北虫草酒精 萃出物可延长sd大鼠游泳耐力与肌耐力吊棉绳时间。
[0092]
表4：sd大鼠连续喂食样品四周后游泳测试前后抗疲劳相关生化 数值血尿素氮、游泳耗竭与肌耐力单杠时间游泳耗竭与肌耐力单杠时间注1：空白组：喂食生理食盐水；对照组：喂食刺五加(100mg/kg)；1倍剂 量喂食100mg/kg、2倍剂量喂食200mg/kg、5倍剂量喂食500mg/kg的北虫草酒精 萃出物。注2：数值以统计软件spss中单因子变方分析(one-way anova)进行统计处 理，再以duncan's multiple range test作各组间的差异性比较，p《0.05表具有显 著差异(n＝10)。
[0093]
游泳后对sd大鼠的血糖值分析
[0094]
实验方式：
[0095]
于游泳前对sd大鼠采血一次，游泳90分钟后休息60分钟再采血 一次，再分析其血尿素氮的数值的变化。另因长时间运动亦会影响肝功能指数 got与gpt的变化，因此以下亦进行sd大鼠肝功能指数got与gpt的测量。
[0096]
实验结果：
[0097]
由下表5的结果所示，游泳前各组的血糖值介于111.8～120.6 mg/dl，于统计上并无呈现显著差异。游泳后空白组的血糖值为102.2
±
4.2mg/dl； 对照组血糖值为103.8
±
16.1mg/dl；实验组则介于101.3～108.0mg/dl之间，于统 计上各组之间无呈现显著差异，显示此次喂食北虫草酒精萃出物实验并无让血 液中血糖值处于较高的状态。
[0098]
由下表5的结果所示，游泳前各组的got值介于79.6～85.0u/l 间，而gpt则介于39.5～41.6u/l之间，于统计上并无呈现显著差异。游泳后空 白组其got与gpt数值为125.3
±
17.4u/l与49.2
±
2.6u/l；对照组其got与gpt数 值为102.1
±
9.5u/l与39.5
±
3.7u/l；实验组其got与gpt数值为94.5～100.0u/l 与38.0～41.8u/l，于统计上got与gpt数值中，对
照组和实验组相对于空白组 呈现显著差异，但对照组与实验组并无显著性差异。因此喂食低剂量组(100 mg/kg)北虫草萃取物相较于喂食高剂量组(500mg/kg)使sd大鼠有更低的gpt 值。结果显示北虫草酒精萃出物中可能具有降低运动所造成的got与gpt的升 高的效果。
[0099]
表5：sd大鼠连续喂食样品四周后游泳测试前后生化数值变化注1：空白组：喂食生理食盐水；对照组：喂食刺五加(100mg/kg)；1倍剂 量喂食100mg/kg、2倍剂量喂食200mg/kg、5倍剂量喂食500mg/kg的北虫草酒精 萃出物。注2：数值以统计软件spss中单因子变方分析(one-way anova)进行统计 处理，再以duncan's multiple range test作各组间的差异性比较，p《0.05表具有 显著差异(n＝10)。
[0100]
因此，由以上的实施例证实北虫草酒精萃出物可加速运动后恢复 期血尿素氮浓度下降，有助于增进运动后疲劳的消除，且亦具有降低长时间运 动所造成的got与gpt升高的损伤的效果。