GluN2A及包含GluN2A的NMDA受体作为靶点在筛选治疗抑郁症的药物中的应用

glun2a及包含glun2a的nmda受体作为靶点在筛选治疗抑郁症的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及glun2a及包含glun2a的nmda受体作为靶点在筛选抗抑郁症的药物中的应用。


背景技术：

2.抑郁症是一种以情绪低落、兴趣衰退为核心特征的情绪相关疾病。随着现代生活节奏的加快、社会压力的增大，其发病率也在不断增加，据世界卫生组织报导，全球范围内约有3亿抑郁症患者。患者长期情绪低落，思维迟缓，失去对生活的兴趣，严重者失去家庭生活、学习和工作的能力，甚至导致自杀倾向和自杀行为，给家庭和社会带来了严重的损失和负担。因此，对抑郁症发病机制的研究及抗抑郁药物的研发显得尤为重要。
3.抑郁症是一种复杂的异源性疾病，其诱因来源于生理、心理、遗传和社会等多个层面。在过去的几十年中，虽然神经科学领域对抑郁发病机制的研究取得了一系列进展，但其确切的发病机制仍然没有得到详细的阐述。诸多的研究和临床实验表明，抑郁症的发病涉及多个方面，包括中枢神经系统内五羟色胺能和去加肾上腺能活动的降低，bdnf表达下降，下丘脑-垂体-肾上腺轴活动的异常增加，炎症反应的增加及神经再生和神经可塑性的降低等。
4.单胺类学说是之前较为广泛认同的抑郁发生的可能机制，即脑内五羟色胺和去甲肾上腺素等单胺类神经递质水平的降低导致抑郁相关样行为。现在临床使用较多的一线抗抑郁药物也主要是五羟色胺再摄取抑制剂(ssri)及五羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(snri)。这两类药物可以缓解大部分抑郁症患者的症状，但仍然存在一些缺陷，起效缓慢、发挥作用通常需要一周左右；ssri对近三分之患者没有疗效；甚至可能增加患者的自杀倾向。
5.因此，本领域急需提供快速的、低成本的抗抑郁药物的筛选方法，以提供更多的抗抑郁药物。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的在于提供glun2a亚型nmda受体抑制剂作为抗抑郁药物的用途。
7.本发明的另一个目的在于提供一种快速的、低成本的抗抑郁药物的筛选方法和装置。
8.本发明第一方面，提供了glun2a、其结合片段或包含glun2a的nmda受体在筛选抗抑郁药物或在制备用于筛选抗抑郁药物的试剂中的用途，其中将是否具有对glun2a、其结合片段或包含glun2a的nmda受体的抑制和/或结合能力作为判断候选药物是否具有抗抑郁活性的筛选标准。
9.在另一优选例中，可进一步的以所述候选药物能否提高兴奋性神经元的可兴奋性作为判断候选药物是否具有抗抑郁活性的标准。
10.在另一优选例中，所述筛选在体外进行；所述方法是非诊断非治疗的。
11.在另一优选例中，所述glun2a具有seq id no:1(人glun2a)或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，较佳地，glun2a具有与seq id no:1具有至少85％、至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列。
12.在另一优选例中，所述glun2a具有seq id no:2(鼠glun2a)或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，较佳地，glun2a具有与seq id no:2具有至少85％、至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列。
13.在另一优选例中，包含glun2a的nmda受体为包含两个glun1和两个glun2a亚基的nmda受体，或者是包含有至少1个glun2a亚基的nmda受体。
14.在另一优选例中，所述候选药物选自下组：抗体或其结合片段、小分子化合物或其药学上可接受的盐、核酸。
15.在另一优选例中，所述抑郁症包括选自下组的表型：情绪低落、思维迟缓、意志活动衰退、有自杀倾向、认知功能损害、躯体症状、或其组合。
16.本发明第二方面，提供了一种抗抑郁药物的筛选方法，包括步骤：
17.(i)提供glun2a、其结合片段和/或包含glun2a的nmda受体；
18.(ii)将候选药物与glun2a、其结合片段和/或包含glun2a的nmda受体接触；和
19.(iii)测定所述候选化合物对所述glun2a、其结合片段和/或包含glun2a的nmda受体的抑制和/或结合能力，当所述候选药物具有抑制和/或结合所述glun2a、其结合片段和/或包含glun2a的nmda受体的能力时，则所述候选药物可作为抗抑郁的候选药物。
20.在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
21.(iv)检测步骤(iii)中筛选出的候选药物对可兴奋性神经元的影响，当检测到所述候选药物能够诱导出抗抑郁样行为和/或增加所述兴奋性神经元的可兴奋性(intrinsic excitability)时，则所述候选药物可作为抗抑郁症的药物。
22.本发明第三方面，提供了一种抗抑郁药物的筛选装置，所述装置包括装载有表达有glun2a亚型nmda受体的细胞(比如hek293、cho或者hela细胞等)的膜片钳装置，其中，所述装置被配置为检测候选化合物是否可以降低或阻断glun2a亚型nmda受体介导的离子通道电流。
23.本发明第四方面，提供了一种抗抑郁药物的筛选装置，一种筛选抗抑郁药物的套件，包括：
24.(a)如本发明第四方面所述的第一膜片钳装置；和
25.(b)第二膜片钳装置，所述第二膜片钳装置为装载有动物(如大鼠、小鼠等)脑海马区组织切片或原代培养神经元的膜片钳装置，其中，所述装置被配置为检测候选化合物是否可以提高兴奋性神经元的可兴奋性。
26.本发明第五方面，提供了一种抗抑郁药物的筛选试剂盒，所述试剂盒包括：
27.glun2a、其结合片段和/或包含glun2a的nmda受体，其作为筛选抗抑郁药物的试剂。
28.在另一优选例中，所述glun2a、其结合片段和/或包含glun2a的nmda受体作为筛选抗抑郁症的药物的靶点。
29.本发明第六方面，提供了glun2a亚型nmda受体抑制剂在制备抗抑郁症的药物组合
物中的用途。
30.在另一优选例中，所述glun2a亚型nmda受体抑制剂选自下组：抗体或其结合片段、小分子化合物或其药学上可接受的盐、核酸。
31.在另一优选例中，所述glun2a亚型nmda受体抑制剂选自下组的化合物或其药学上可接受的盐：
[0032][0033]
在另一优选例中，所述glun2a亚型nmda受体抑制剂不是mk-801、氯胺酮。
[0034]
在另一优选例中，所述glun2a亚型nmda受体抑制剂为其单克隆抗体或多克隆抗体。
[0035]
在另一优选例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
[0036]
本发明第七方面，提供了一种治疗抑郁症的方法，包括步骤，将有效量的glun2a亚型nmda受体抑制剂给予患抑郁症的对象，从而治疗抑郁症。
[0037]
在另一优选例中，所述对象哺乳动物，如人、大鼠或小鼠。
[0038]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0039]
图1为野生型(wt)小鼠与glun2a敲除小鼠及条件敲除小鼠中glun2a蛋白表达含量。
[0040]
图2为野生型(wt)小鼠与glun2a敲除小鼠行为学实验结果。(a)旷场实验；(b)强迫游泳实验和悬尾实验。
[0041]
图3为野生型(wt)小鼠与glun2a敲除小鼠在强迫游泳实验中的不动时间与旷场实验中活动距离的相关性分析。
[0042]
图4为野生型(wt)小鼠与glun2a敲除小鼠在给予nmda受体拮抗剂处理后，在强迫游泳实验中的不动时间。(a)mk-801；(b)氯胺酮。
[0043]
图5为glun2a条件敲除小鼠给予mk-801后在强迫游泳中的不动时间。
[0044]
图6显示了在成年后再敲除glun2a亚型nmda受体可以缓解小鼠的抑郁样行为。(a)实验流程示意图；(b，c)test 1的回避失败次数和回避潜伏期；(d,e)test 2的回避失败次数和回避潜伏期；(f)成年后再敲除glun2a亚型nmda受体后，小鼠在悬尾实验中的不动时间。
[0045]
图7显示在小鼠中敲除glun2a亚型nmda受体可以增加海马区兴奋性神经元的可兴奋性。(a)从发育期就开始敲除glun2a亚型nmda受体，海马区兴奋性神经元的可兴奋性。(b)
成年后再敲除glun2a亚型nmda受体后，海马区兴奋性神经元的可兴奋性。
[0046]
图8显示敲除glun2a亚型nmda受体消除了nmda受体拮抗剂mk-801和氯胺酮(ket)诱导的海马区兴奋性神经元可兴奋性的增加。(a)wt小鼠海马区兴奋性神经元经mk-801处理后的兴奋性。(b)glun2a敲除小鼠海马区兴奋性神经元经mk-801处理后的兴奋性。(c)wt小鼠海马区兴奋性神经元经氯胺酮处理后的兴奋性。(d)glun2a敲除小鼠海马区兴奋性神经元经氯胺酮处理后的兴奋性。
具体实施方式
[0047]
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了glun2a及包含glun2a的nmda受体作为靶点在筛选抗抑郁症药物中的应用。本发明首次发现在成年习得性无助抑郁症小鼠模型中，诱导敲除glun2a可以缓解小鼠的抑郁样行为，这说明抑制和/或消除glun2a的功能，可用于治疗患者的抑郁症状。此外，glun2a的敲除可以消除nmda受体亚型非选择性拮抗剂mk-801和氯胺酮的快速抗抑郁效果，说明此类药物的抗抑郁效果需要glun2a的存在。以上结果证明glun2a可以作为开发新抗抑郁症药物的靶点。此外敲除glun2a所引起的抗抑郁效果与兴奋性神经元的可兴奋性增加相关，说明增强兴奋性神经元的可兴奋性也可以作为一个标准用来筛选抗抑郁药物。在此基础上完成了本发明。
[0048]
术语
[0049]
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
[0050]
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0051]
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
[0052]
如本文所用，术语“室温”或“常温”是指温度为4-40℃，较佳地，25
±
5℃。
[0053]
nmda受体
[0054]
nmda受体指n-甲基-d-天冬氨酸受体，是离子型谷氨酸受体的一个亚型，nmda是一个四聚体，由两个必要的glun1和两个可变的glun2或glun3亚基组成。nmda受体功能异常与阿尔茨海默症、帕金森综合症、亨廷顿舞蹈症等多种神经退行性疾病，及自闭症、精神分裂症、抑郁症等精神类疾病相关。
[0055]
glun2a、包含glun2a的nmda受体
[0056]
glun2包含glun2a、glun2b、glun2c、glun2d四种亚型，从结构上看每个亚型均包含四个结构域：胞外结构域(n-terminal domain)，激动剂结合结构域(agonist-binding domain),跨膜结构域(transmembrane domain)和胞内结构域(c-terminal domain)，但其表达在不同脑区分布不同，并且随发育阶段的不同而发生改变。因此nmda受体亚基的多样性增加了研究抑郁症发病机制的复杂性。
[0057]
其中，本发明的glun2a可以为各组哺乳动物，如灵长类、鼠等，优选地，人类、大鼠或小鼠。
[0058]
优选地，所述glun2a具有seq id no:1(人glun2a)或与其具有至少80％同一性的
氨基酸序列，优选地，glun2a具有与seq id no:1具有至少85％、至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列。
[0059]
优选地，所述glun2a具有seq id no:2(鼠glun2a)或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，优选地，glun2a具有与seq id no:2具有至少85％、至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列。
[0060]
seq id no:1
[0061][0062][0063]
seq id no:2
[0064][0065]
抑郁症
[0066]
抑郁症是最常见的抑郁障碍(major depressive disorder)，以显著的心境低落为主要临床特征，是心境障碍(mood disorder)的典型类型。抑郁症的临床表现包括：情绪低落、思维迟缓、意志活动减退、认知功能损害(如记忆力下降、注意力障碍等)、躯体症状(如睡眠障碍、乏力、呕吐、心慌等)。
[0067]
本发明中，所述抑郁包括抑郁症(major depressive disorder)的抑郁症状，还包括在其他疾病中的抑郁症状，比如躁郁症、精神分裂症等。
[0068]
如本文所用，术语“抗抑郁”、“抗抑郁症”或“治疗抑郁症”可互换使用，指部分或全部缓解、逆转或治疗抑郁症。特别地，所述抗抑郁不包括预防抑郁症的形成。特别地，所述抑郁症不是由遗传因素引起的，或遗传因素不是该抑郁症的主因。特别地，所述对象为大脑发育正常的抑郁症患者。
[0069]
抗抑郁药物筛选方法
[0070]
本发明人意外的发现，通过敲除或抑制glun2a，可以逆转/治疗抑郁症。此外，现有的抗抑郁症药物需要在glun2a存在下才能体现抗抑郁效果。
[0071]
因此，本发明提供了glun2a、其结合片段或包含glun2a的nmda受体在筛选抗抑郁药物或在制备用于筛选抗抑郁药物的试剂中的用途。本发明中，可将是否具有对glun2a、其结合片段或包含glun2a的nmda受体的抑制和/或结合能力作为判断候选药物是否具有抗抑
郁活性的筛选标准。
[0072]
进一步地，本发明还提供了一种抗抑郁药物的筛选方法，包括步骤：
[0073]
(i)提供glun2a、其结合片段和/或包含其的nmda受体；
[0074]
(ii)将候选药物与glun2a、其结合片段和/或包含其的nmda受体接触；和
[0075]
(iii)测定所述候选化合物对所述glun2a、其结合片段和/或包含其的nmda受体的抑制和/或结合能力，当所述候选药物具有抑制和/或结合所述glun2a、其结合片段和/或包含其的nmda受体的能力时，则所述候选药物可作为抗抑郁症的候选药物。
[0076]
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
[0077]
(iv)检测步骤(iii)中筛选出的候选药物对可兴奋性神经元的影响，当检测到所述候选药物能够诱导出抗抑郁样行为和/或增加所述兴奋性神经元的可兴奋性(intrinsic excitability)时，则所述候选药物可作为抗抑郁症的药物。
[0078]
本发明的筛选方法可在分子、细胞、组织或动物层面上进行。优选地，所述方法在体外进行。
[0079]
如本文所用，用于筛选抗抑郁药物的“包含glun2a的nmda受体”和“glun2a亚型nmda受体”、“包含glun2a亚基的nmda受体”可互换使用，指含有至少一个glun2a亚基的nmda受体，如包含1个或2个glun2a亚基的nmda受体，优选地，所述受体包含2个glun2a亚基。
[0080]
本领域技术人员理解，所述候选药物与glun2a、其结合片段和/或包含glun2a的nmda受体的抑制和/或结合能力可以根据本领域常用方法测定，包括但并不限于通过分子实验、细胞实验和/或动物实验来进行。通常检测方法包括但并不限于：膜片钳实验、蛋白印迹实验、高效液相色谱、电泳、质谱、免疫荧光、或其组合。如测定候选药物抑制glun2a、其结合片段和/或包含其的nmda受体的ic
50
值，通常可与阳性或阴性的对照药物相比较。
[0081]
如本文所用，术语“抑制”、“抑制能力”、“降低”或“阻断”指对glun2a亚型nmda受体功能的抑制作用，如对glun2a亚型nmda受体介导的钠、钾、钙信号(电流)或者其它与之偶联的下游信号通路或者影响(比如erk的磷酸化，或者兴奋性神经元可兴奋性等)的抑制作用。较佳地，与未施用相比，施用本发明的候选药物或抑制剂后，glun2a亚型nmda受体功能下降至少10％，较佳地，至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、或至少100％。
[0082]
在另一优选例中，可以通过检测候选药物与glun2a、其结合片段和/或包含glun2a的nmda受体的结合能力来筛选药物，如与glun2a、其结合片段和/或包含glun2a的nmda受体的底物或阳性对照药物的结合能力c0相比，本发明的候选药物或抑制剂与glun2a、其结合片段和/或包含glun2a的nmda受体的结合能力c1为c0的至少10％，较佳地，至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、或至少100％，甚至200％或300％及以上。
[0083]
药物筛选装置或套件
[0084]
本发明提供了一种筛选抗抑郁药物的膜片钳(patch clamp)装置。
[0085]
本发明中，用于筛选抗抑郁药物的膜片钳装置通过检测候选药物能否阻断细胞膜上的包含glun2a的nmda受体介导的离子通道电流来筛选抗抑郁药物。也就是说，一个优选的实施例中，膜片(patch)区域为所述包含glun2a的nmda受体所在区域。
[0086]
膜片钳技术是是采用钳制电压或电流的方法对生物膜上离子通道的电活动进行记录的微电极技术，在本领域广泛应用，其装置结构对本领域技术人员而言是已知的。典型地，膜片钳装置可包括选自下组的器件：机械部分(防震工作台、屏蔽罩、仪器设备架)、光学
部分(显微镜、视频监视器、单色光系统)、电子部件(膜片钳放大器、刺激器、数据采集设备、计算机系统)和微操纵器。或者，可以使用市售的膜片钳装置，如multiclamp系统或者heka系统。
[0087]
优选地，可用于所述膜片钳装置的细胞包括：过表达包含人源或鼠源glun2a亚型nmda受体的细胞，比如(但并不限于)hek293、cho或者hela等细胞或者非洲爪蟾卵母细胞等，优选地，所述细胞为过表达包含人源或鼠源glun2a亚型nmda受体的hek293细胞。通常，药物筛选时，每个候选药物可使用大于或等于三个细胞进行测试。
[0088]
优选地，本发明还提供了一种筛选抗抑郁药物的套件，包括：
[0089]
(a)所述装载有表达有glun2a亚型nmda受体的细胞的第一膜片钳装置，且所述装置被配置为检测候选化合物是否可以降低或阻断glun2a亚型nmda受体介导的离子通道电流(如通过膜片钳的全细胞记录方式检测)；和
[0090]
(b)第二膜片钳装置，所述装置为装载有动物脑海马区组织切片或原代培养神经元(如大鼠、小鼠等)的膜片钳装置，其中，所述装置被配置为检测候选化合物是否可以提高兴奋性神经元的可兴奋性。
[0091]
通常，所述套件还包括说明书等。
[0092]
所述套件可以通过第一膜片钳装置进行快速初筛，然后通过第二膜片钳装置对通过初筛的候选药物进行复筛，可实现快速、高准确性的筛选抗抑郁药物。
[0093]
抗抑郁药物的筛选试剂盒
[0094]
本发明的抗抑郁药物的筛选试剂盒包含glun2a、其结合片段和/或包含glun2a的nmda受体作为筛选抗抑郁药物的试剂。
[0095]
通常，所述试剂盒还包括容器、说明书等。
[0096]
glun2a抑制剂、组合物及其用途
[0097]
本发明供了glun2a亚型nmda受体抑制剂在制备抗抑郁症的药物组合物中的用途。
[0098]
在另一优选例中，所述glun2a亚型nmda受体抑制剂选自下组：抗体或其结合片段、小分子化合物或其药学上可接受的盐、核酸。
[0099]
在另一优选例中，所述glun2a亚型nmda受体抑制剂为已知的glun2a具有抑制活性的物质，或为通过本发明的药物筛选方法筛选得到的对glun2a、其结合片段和/或包含其的nmda受体具有抑制和/或结合能力的物质。
[0100]
本发明中，所述药物组合物包括作为抗抑郁活性成分的glun2a亚型nmda受体抑制剂，以及药学上可接受的载体。
[0101]“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”是指有助于活性剂的配制和/或施用和/或被个体吸收的物质，并且可以包含在本公开的组合物中而不引起对该个体的显著不利的毒理作用。药学上可接受的载体和赋形剂的非限制性实例包括水、nacl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、常规蔗糖、常规葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、风味剂、盐溶液(例如林格溶液)、醇、油、明胶、碳水化合物，诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷和颜料等。这样的制剂可以被灭菌，并且如果需要，与不会有害地与本文提供的化合物反应或干扰本文提供的化合物的活性的辅助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等混合。本领域普通技术人员将认识到其他药物载体和赋形剂适用于本发明的抑制剂。
[0102]
在某些实施例中，本发明的药物组合物可以以固体或液体形式。
[0103]
通过任意合适的途径，包括口服地、肠胃外地、通过吸入喷雾、局部地、直肠地、鼻地、含服地、阴道地或经由植入型药盒，可以将活性成分施用给受试者。本文使用的术语“肠胃外的”包括皮下的、静脉内的、肌肉内的、关节内的、滑膜内的、胸骨内的、鞘内的、肝内的、病灶内的(intralesional)和颅内的注射或输注技术。优选地，口服地、腹膜内地或静脉内地施用所述组合物。
[0104]
适合于口服施用的本发明的药物组合物典型地将是以固体形式的离散单元，例如以片剂、胶囊、扁囊剂、粉末、颗粒、锭剂、贴片、栓剂、丸剂的形式，或以液体形式，例如液体制剂、可注射的或可输注的溶液或悬浮液。
[0105]
向个体提供治疗有效量的活性成分的精确量将取决于给药方式、疾病和/或病症的类型和严重程度以及个体的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。本领域普通技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。当与其他治疗剂组合施用时，任何其他治疗剂的“治疗有效量”将取决于所用药物的类型。合适的剂量对于批准的治疗剂是已知的，并且可以由本领域普通技术人员根据个体的状况、治疗的病症类型和通过以下使用的本发明化合物的量进行调整，例如，在文献中报道和在physician’s desk reference(第57版，2003)中推荐的剂量。优选地，应如此配制组合物，使得可以将0.01-100mg/kg体重/天的抑制剂剂量施用给接受这些组合物的患者。在某些实施方案中，本发明的组合物提供了0.01mg至50mg的剂量。在其它实施方案中，提供了0.lmg-25mg或5mg-40mg的剂量。
[0106]
本发明还提供了一种治疗抑郁症的方法，包括步骤，将有效量的glun2a亚型nmda受体抑制剂给予患抑郁症的对象，从而治疗抑郁症。
[0107]
本发明的药物组合物或治疗剂的给药对象的实例包括哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴等)。在另一优选例中，所述对象为大脑发育完全的个体，如成年后才患有抑郁症的对象。如对于人类，给药对象的年龄为≥16岁或≥18岁或≥20岁。
[0108]
本发明的主要优点包括：
[0109]
1.本发明首次证明了抑制glun2a可用于逆转/治疗抑郁症，从而为开发治疗抑郁症的特异性药物提供了可能。
[0110]
2.本发明提供了glun2a抑制剂在治疗抑郁症中的应用，与通用型的nmda受体抑制剂相比，使用特异性的glun2a抑制剂可降低药物副作用。
[0111]
3.本发明还提供了筛选抗抑郁症药物的筛选方法、筛选装置或筛选试剂盒，通过使用glun2a作为药物靶标，可以实现快速地、低成本地高通量筛选抗抑郁药物。
[0112]
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0113]
实验动物：
[0114]
glun2a全基因敲除小鼠购自日本理化学研究所，并于上海南方模式生物科技股份有限公司繁殖，得到glun2a野生型(wt)和glun2a敲除型小鼠(ko)。grin2a flox/flox
小鼠与
ubc-creert小鼠均购自上海南方模式生物科技股份有限公司，将此两种小鼠配繁，获得ubc-creert/grin2a
flox/flox
小鼠。ubc-creert/grin2a
flox/flox
小鼠给予他莫昔芬(tamoxifen)后，诱导cre重组酶表达从而获得glun2a条件敲除型小鼠。将小鼠置于湿度为50
±
10％，温度为22-25℃的标准条件下培养，12小时-12小时昼夜节律(夜时间：8p.m.to8a.m.)，标准食物和水饲养。所有实验都是按照《中国科学院大学实验动物管理和使用道德准则》的建议进行。
[0115]
药物：mk-801(行为学实验：10mg/kg；电生理：10μm)，氯胺酮(行为学实验：10mg/kg；电生理：20μm)，他莫昔芬(2mg/mouse)
[0116]
抗体：glun2a抗体购自美国novusbio公司；α/β-tubulin抗体购自美国cell signaling technology公司。
[0117]
试剂：tetrodotoxin购自上海沃凯生物技术有限公司，picrotoxin购自美国sigma公司，nbqx和ro 25-6981购自美国tocris公司。
[0118]
氯化胆碱溶液：cholinecl 110,nahco
3 25,mgso4·
7h2o 7,kcl 1.25,nah2po4·
2h2o 1.25,cacl
2 0.5,d-glucose 25,na ascorbate 11.6,na pyruvate 3.1。
[0119]
人工脑脊液(acsf):nacl 127,kcl 2.5,nah2po4·
2h2o 1.25,nahco
3 25,cacl
2 2.5,mgcl
2 1.3,d-glucose 25。
[0120]
电极内液:120k-gluconate,20kcl,10hepes,10na phosphocreatine,4na2atp,0.3na3gtp,2.5mgcl
2 and 0.5egta(ph 7.25).
[0121]
实施例
[0122]
一、实验方法
[0123]
1.旷场实验(open field test)：
[0124]
旷场实验(oft)箱(带隔音箱，不透明有机玻璃制，内径40*40*40cm)，分析软件购自noldus(ethovision xt 11.5)。实验在安静的环境下进行，实验前动物称重并在实验房间适应至少30min。实验前设置好软件ethovision xt 11.5，将12周龄及以上的小鼠放入箱内(40cm*40cm)底面中心，记录1h小鼠活动情况。每次实验后使用75％酒精擦拭仪器，以免上一轮动物残留的信息(如动物的大、小便等气味)影响下次测试结果。更换下一轮动物，继续实验。实验结束后收集数据进行统计分析。
[0125]
2.强迫游泳实验(forced-swim test)：
[0126]
将小鼠放入直径为25cm，高30cm的透明有机玻璃水缸中，内注有15cm高的水，水温为23-25℃，总记录时间为6min，分析后4min内小鼠的不动时间，反应小鼠的无助绝望程度。
[0127]
3.悬尾实验(tail suspension test)：
[0128]
将小鼠远端尾部约1.5cm固定后，头部朝下悬挂，距离地面约35cm。记录总时长为6min，分析后4min内小鼠静止不动的时间百分比，以此反应小鼠的绝望程度。
[0129]
4.习得性无助实验(learned helplessness)：
[0130]
将成年小鼠置于包含两个相同大小隔间的穿梭箱(panlab,barcelona,spain)中进行不可逃避电刺激和习得性无助实验。该设备可以提供条件刺激(cs)(即声音和光)和非条件刺激(us，即通过隔间地板给予小鼠足底电击)，由shutavoid软件控制(panlab,barcelona,spain)。首先给予小鼠连续三天的训练实验：将小鼠放入任一隔间适应环境3分钟，然后关闭两个隔间之间的门，给予50次随机间隔为15-35秒的不可预知的足底电击
(0.2ma，5秒)。对照组小鼠在训练阶段不进行电击，其余条件相同。在习得性无助测试阶段，除保持两个隔间之间的门开放之外，其余条件与训练阶段相同，在小鼠逃至另一隔间后终止电击。通过逃脱失败率(％)和逃出潜伏期(s)评估小鼠的习得性无助表型。
[0131]
5.mk-801和氯胺酮的急性给药：
[0132]
mk-801按0.1mg/kg的剂量，氯胺酮按10mg/kg的剂量，以腹腔注射的方式给予小鼠。腹腔注射1小时候进行后续旷场实验、悬尾实验、强迫游泳等行为学实验。
[0133]
6.western blotting实验：
[0134]
取适量脑组织放入1.5ml ep管中，加入0.5-1ml ripa裂解液，然后每个ep管中加入1颗beads，于tissue lyser裂解4-6min，然后12,000rpm离心10分钟。利用prierce tm bca蛋白试剂盒(购于美国thermo scientific公司)测定上清液中蛋白浓度，然后取8ug蛋白用于western blotting分析。蛋白样品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离，并转移至pvdf膜上。将膜置于1％bsa-tbst封闭液中在室温封闭1-2小时，然后用1:1000稀释的一抗在4℃孵育过夜，之后用1:1000稀释的二抗在室温孵育1-2小时。
[0135]
7.脑片的准备和电生理记录：
[0136]
脑片准备：
[0137]
将呈有氯化胆碱切片溶液的烧杯置于冰盒中，并持续通入95％o2和5％co2的混合气体，使之含氧饱和，备用。将4-8周龄小鼠用异氟烷麻醉之后迅速断头处死，暴露颅骨、剥离硬脑膜之后将全脑置于预冷的氯化胆碱溶液中约1分钟左右以降低脑补温度。然后取出全脑，剥离出双侧海马，贴于琼脂块表面，并使海马的一端接近琼脂块的一条边缘，之后用502胶将贴附有海马的琼脂块粘合在振荡切片机的可拆卸托盘上，将托盘固定于盛满预冷氯化胆碱切片溶液的振荡切片机的切片槽中。将振荡切片机刀片调节至水平位置，启动切片机，开始切片。振荡切片机进到速度设置约为0.2mm/s，切片厚度为400um。将切好的海马切片用胶管小心的放入于在33-34℃水浴锅预热的acsf中孵育30-60分钟，并持续的通入95％o2和5％co2混合气体。33-34℃孵育结束后，将呈有脑片的容器从水浴锅中取出，于室温下孵育30分钟左右并保持持续通气，然后进行电生理记录。海马切片在室温并持续通气的条件下可使用约6小时。
[0138]
8.全细胞记录：
[0139]
将孵育结束的海马切片用吸管小心的转移至显微镜载物台的浴槽中，使用连有平行尼龙丝的anchor压制固定，利用蠕动泵使浴槽中持续的泵入氧饱和的acsf，温度维持在室温23-26左右。首先在低倍镜下(10x)定位到海马ca1区域，然后转到高倍镜(40
×
)下找到ca1，之后将视野切换至显示器，寻找海马ca1状态良好的锥体(pyramidal)神经元。状态较好的神经元表现为，细胞立体感强、轮廓清晰、无肿胀、无核仁出现、细胞膜富有弹性及电极接触后可出现“酒窝状”凹陷。实验中使用p-1000电极拉制仪“三步法”拉制玻璃电极，使电极入液阻抗为4-6mω。电极入液之前，用10ml注射器向电极内施加约2ml左右的正压以防止电极尖端堵塞，并用multiple 700b将记录软件的基线归零。使用微电极操作仪将电极慢慢接近细胞表面，电极触及细胞表面时，会出现“酒窝状”凹陷，此时立刻释放正压并给予适当的负压，使电极和细胞之间形成封接。通过记录软件观察封接电阻的变化，当阻抗达到gω时表明细胞和电极之间形成了高阻封接，待其稳定30-60s左右，给予负压破膜，此刻即形成了全细胞模式。在电流钳模式下，给予10-330pa去极化步阶电流刺激，阶跃电流为20pa，通
过分析神经元产生的动作电位数目评估神经元的兴奋性。
[0140]
9.数据分析：
[0141]
所有数值均表示为平均值
±
标准误(sem)。使用t检验进行统计分析，p《0.05被认为有统计学意义。
[0142]
二、实验结果
[0143]
1、glun2a全基因敲除小鼠与条件小鼠的鉴定
[0144]
取小鼠海马组织进行western blotting分析。如图1a所示，与wt小鼠相比，ko小鼠的glun2a蛋白表达显著降低，说明glun2a ko小鼠构建成功。在ubc-creert/grin2a
flox/flox
小鼠中，如图1b所示，给予他莫昔芬的小鼠中glun2a蛋白的表达量也显著降低，表明成功建立了glun2a条件敲除小鼠。
[0145]
2、glun2a ko小鼠表现出抗抑郁样行为，且不依赖于自发活动能力的增加
[0146]
首先通过旷场实验评估了小鼠的自发活动能力。
[0147]
如图2a所示，glun2a ko小鼠在旷场中的活动距离显著高于wt小鼠，表明glun2a ko小鼠自发活动能力增加。
[0148]
然后通过悬尾实验和强迫游泳实验分析小鼠的抑郁样行为。
[0149]
如图2b所示，与wt小鼠相比，glun2a ko小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间都显著降低，表明glun2a ko小鼠表现出抗抑郁样行为。
[0150]
接着进一步分析了glun2a ko小鼠的抗抑郁行为和自发活动能力之间是否存在相关性。
[0151]
如图3所示，无论是wt小鼠还是glun2a ko小鼠，其在强迫游泳实验中的不动时间和旷场实验中的活动距离之间不存在线性相关。由此表明glun2a ko小鼠表现出抗抑郁样行为且不依赖于自发活动能力的增加。
[0152]
3、敲除glun2a阻断了mk-801与氯胺酮的抗抑郁效应
[0153]
mk-801和氯胺酮是nmda受体的非竞争性拮抗剂，能够诱使小鼠产生快速的抗抑郁样行为。给予wt和glun2a ko小鼠分别腹腔注射10mg/kg的mk-801或氯胺酮，之后进行强迫游泳实验。
[0154]
如图4a-b所示，腹腔注射mk-801或氯胺酮1小时后，wt小鼠在强迫游泳实验的不动时间都显著降低，表明mk-801和氯胺酮可以在wt小鼠中产生快速抗抑郁效应。而glun2a ko小鼠在给予同样的mk-801或氯胺酮处理后，其在强迫游泳实验中的不动时间与对照组相当，说明mk-801和氯胺酮不能在glun2a ko小鼠中诱导产生快速抗抑郁效应，进而表明mk-801和氯胺酮的抗抑郁效应可能是通过抑制glun2a实现的。
[0155]
4、成年小鼠中敲除glu2a ko可以产生抗抑郁样行为
[0156]
抑郁症主要在青壮年时期发病，因此进一步探究了在成年后敲除glun2a是否有抗抑郁效应。12周龄的ubc-creert/grin2a
flox/flox
小鼠腹腔注射tamoxifen，剂量为2mg/只，连续注射7天，然后再经过一周进行悬尾实验和强迫游泳实验。
[0157]
如图5所示，与对照小鼠相比，glun2a条件敲除小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间都显著降低，由此说明在成年期敲除glun2a可以使小鼠产生抗抑郁行为，也提示glun2a是重要的抗抑郁治疗靶点。
[0158]
此外，进一步地，分别给予mk-801之后，对照小鼠的不动时间显著降低，而glun2a
条件敲除小鼠在经过mk-801处理后，不动时间并未发生改变，说明在成年小鼠中敲除glun2a同样遮盖了mk-801诱导的快速抗抑郁效应。
[0159]
5、glun2a敲除可以缓解习得性无助诱发的抑郁样行为
[0160]
为一进步评估敲除glun2a可以产生抗抑郁效应，利用习得性无助构建了抑郁小鼠模型。
[0161]
如图6b-c所示，ubc-creert/grin2a
flox/flox
小鼠在经历不可逃避足底电击后，其逃脱失败率和逃脱潜伏期与对照组小鼠相比显著增加，说明利用习得性无助成功建立了抑郁小鼠模型。
[0162]
接着，分别给予抑郁模型小鼠他莫昔芬和对照处理，进行glun2a敲除。
[0163]
如图6d所示，glun2a敲除后，逃脱失败率显著下降，表明glu2a敲除缓解了抑郁小鼠的抑郁样行为。
[0164]
此外，还通过悬尾实验再次评估了glun2a的敲除效应。如图6f所示，抑郁模型小鼠在敲除glun2a后，其在悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间显著降低，再次表明glun2a敲除缓解了抑郁小鼠的抑郁样行为，同时也揭示glun2a为重要的抗抑郁治疗靶点。
[0165]
6、glun2a通过调节神经元的兴奋性调控抑郁样行为
[0166]
如图7a所示，在同样的去极化电流刺激下，glun2a ko小鼠海马区兴奋性神经元产生的动作电位数目显著高于wt小鼠，说明glun2a敲除显著增加了海马区神经元的兴奋性。如图7b所示，在成年小鼠中敲除glun2a，依然可以增加海马区神经元的兴奋性。
[0167]
综合上述结果，表明glun2a通过调节海马区神经元的兴奋性调控抑郁样行为。为了更进一步证实这一观点，分别用mk-801和氯胺酮孵育wt小鼠和glun2a ko的海马切片。如图8所示，mk-801和氯胺酮显著增加了wt小鼠海马神经元的兴奋性，而glun2a ko阻断了mk-801和氯胺酮造成的兴奋性的增加。这与前述结果一致，即glun2a敲除阻断了mk-801和氯胺酮在小鼠中诱导的快速抗抑郁样行为。
[0168]
行为学实验表明，glun2a ko小鼠表现出抗抑郁样行为，在成年后敲除glun2a仍然可以缓解抑郁模型小鼠的抑郁样行为，且glun2a敲除阻断了mk-801和氯胺酮的快速抗抑郁效应。
[0169]
电生理实验表明，glun2a ko小鼠海马区兴奋性神经元的兴奋性增加，且敲除glun2a消除了mk-801和氯胺酮诱发的神经元兴奋性增加。
[0170]
综上可见，glun2a亚型nmda受体作为靶点在治疗抑郁症中有潜在的重要应用前景，且兴奋性神经元的兴奋性增加可以作为筛选抗抑郁药物的标准。
[0171]
讨论
[0172]
nmda受体作为一种谷氨酸能离子通道受体，不仅介导中枢神经系统的兴奋性谷氨酸能传递，在突触可塑性、神经元存活、学习和记忆等中都发挥着不可或缺的作用。
[0173]
从本发明的实验结果可以看出，mk-801或氯胺酮等抗抑郁症药物在glun2a ko小鼠中无法产生快速抗抑郁效应，这提示mk-801和氯胺酮的抗抑郁效应是通过抑制glun2a实现的，也就是说，glun2a是一种抗抑郁药物的作用靶点，换言之，当一种药物能够抑制glun2a时，其可以产生抗抑郁作用，因此，本发明提供了glun2a亚型nmda受体或glun2a结合片段用于筛选抗抑郁药物的用途。
[0174]
进一步地，在经由习得性无助范式构建的抑郁症动物模型中，利用tamoxifen诱导
的条件性敲除小鼠glun2a，直接证明抑制glun2a能够缓解、逆转/治疗抑郁症。
[0175]
需要说明的是，与在基因组中敲除glun2a基因的模型小鼠能够先天抗抑郁症的形成(预防性地效果，影响了小鼠的大脑发育)不同，本发明首次证明了抑制glun2a可以逆转/治疗在成年后才患有抑郁症的对象。
[0176]
因此，本发明证明了glun2a亚型nmda受体可作为治疗抑郁症的靶点，从而为开发抗抑郁药物提供了新的策略。此外，还提供了glun2a亚型nmda受体抑制剂用于抗抑郁的医药用途。现有获批上市的nmda受体拮抗剂没有亚型选择性，由此带来的副作用限制了其使用。根据本发明可开发用于治疗抑郁症的特异性glun2a抑制剂，从而降低药物副作用。
[0177]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。