非天然氨基酸调控的基因翻译系统及其应用

1.本发明涉及合成生物学，基因、细胞治疗领域，特别涉及非天然氨基酸调控的基因翻译系统及其应用。


背景技术：

2.糖尿病是常见的慢性疾病，世界范围内已有超过4亿糖尿病患者。i型糖尿病病人通常需要每天测量血糖，并计算自身的胰岛素注射剂量，在饭前注射胰岛素以控制血糖，这导致糖尿病患者的治疗依从性差。而且剂量错误等风险可能会引起严重不良反应。因此，亟需开发新的糖尿病治疗策略，以实现及时控制血糖和方便患者给药的目标。基于合成生物学设计的工程化细胞方法是近年来细胞治疗研究的重要进展，对于糖尿病、肿瘤等疾病有巨大的应用前景。
3.合成生物学可以利用自然界存在的基本生物学元件，如核酸、蛋白质和代谢物质等，通过人工改造或组建形成特定功能的生物模块，从而实现对细胞、组织或者生物体的功能设计。基于合成生物学设计，现已开发了多种能够响应外源刺激信号的基因调控系统，通过给予刺激信号调节基因表达，可以实现更加安全、精确和可预测的调控方式调控细胞功能，在基因、细胞治疗等领域有重要应用。
4.目前已开发的刺激信号调控的基因调控系统中，绝大多数都是在在细胞中转录水平调控的。刺激信号需要先激活转录因子，转录因子激活后与目的基因dna结合，转录出mrna再翻译成目的蛋白。转录水平的基因调控系统的缺点在于过程复杂，表达速度慢。在接触刺激信号数小时甚至一天后，基因调控系统才能表达目的蛋白。这样长的响应时间无法满足很多疾病需要快速和及时治疗的要求。
5.因此，提供非天然氨基酸调控的多功能基因表达平台在糖尿病治疗的应用，具有重要的现实意义。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明利用基因密码子扩展技术，结合哺乳动物合成生物学的手段，提供了一种治疗糖尿病的新方法，即利用基因翻译系统调控的胰岛素来控制血糖稳态，从而达到治疗糖尿病的目的。本发明在哺乳动物细胞中开发了一套以基因翻译系统和转录水平调控系统相结合的双输入端逻辑门。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了非天然氨基酸调控的基因翻译系统，由氨酰trna合成酶和trna正交分子对，以及读码框中含有终止密码子的目的蛋白的基因序列三部分组成；
9.所述氨酰trna合成酶包括酪氨酸氨酰trna合成酶或吡咯赖氨酸氨酰trna合成酶；
10.所述非天然氨基酸包括氧-甲基酪氨酸或nε-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸。
11.在本发明的一些具体实施方案中，所述目的蛋白的基因序列包括报告基因，或同时表达报告基因和功能蛋白的基因序列；所述目的蛋白包括转录因子或药物蛋白。
12.在本发明的一些具体实施方案中，所述目的蛋白包括分泌型碱性磷酸酶，其读码框中终止密码子的引入位点包括seap(v2tag)，seap(l22tag)，seap(v27tag)或seap(q50tag)中的一个或多个；或
13.所述同时表达报告基因和功能蛋白的基因序列包括seap(v27tag)-p2a-ins(f7tag)；
14.所述转录因子包括tta，其读码框中终止密码子的引入位点包括tta(l4tag)，tta(s7tag)，tta(k46tag)，tta(e71tag)，tta(y110tag)或tta(e159tag)中的一个或多个；或
15.所述药物蛋白包括胰岛素，其读码框中终止密码子引入位点可以是ins(l4tag)，ins(f7tag)，ins(q23tag)，ins(e64tag)或ins(l66tag)中的一个或多个。
16.在本发明的一些具体实施方案中，所述trna包括在真核体系中与所述酪氨酸氨酰trna合成酶正交的酪氨酸trna，且其反义密码子为uag，uaa，uga中的一种，其中优选为uag或uaa；或
17.所述trna包括在真核体系中与所述吡咯赖氨酸氨酰trna合成酶正交的吡咯赖氨酸氨酰trna，且其反义密码子为uag，uaa，uga中的一种，其中优先为uag或uaa。
18.在本发明的一些具体实施方案中，所述终止密码子包括tag，taa或tga中的一个或任意两个的组合；其中优选为tag和/或taa。
19.基于上述研究，本发明还提供了真核表达载体，包括所述的非天然氨基酸调控的基因翻译系统。
20.本发明还提供了工程化细胞，包括所述的非天然氨基酸调控的基因翻译系统或所述的真核表达载体。
21.在本发明的一些具体实施方案中，所述的工程化细胞包括hek293系列细胞、人源干细胞或动物源干细胞中的一种或多种。
22.此外，本发明还提供了微胶囊，包括所述的非天然氨基酸调控的基因翻译系统，所述的真核表达载体，或所述的工程化细胞中的一个或多个。
23.本发明还提供了中空纤维管，包括所述的非天然氨基酸调控的基因翻译系统，所述的真核表达载体，或所述的工程化细胞中的一个或多个。
24.本发明还提供了组合物，包括所述的非天然氨基酸调控的基因翻译系统，所述的真核表达载体，所述的工程化细胞，所述的微胶囊，或所述的中空纤维管中的一个或多个，与非天然氨基酸的组合。
25.更重要的是，本发明还提供了所述的非天然氨基酸调控的基因翻译系统，所述的真核表达载体，所述的工程化细胞，所述的微胶囊，所述的中空纤维管，或所述的组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物、蛋白翻译调控、转录-翻译结合调控或在生物计算上的应用。
26.在本发明的一些具体实施方案中，所述疾病包括糖尿病。所述疾病包括人类疾病或动物疾病。
27.此外，本发明还提供了预防和/或治疗糖尿病的药物，包括所述的非天然氨基酸调控的基因翻译系统所述的真核表达载体，所述的工程化细胞，所述的微胶囊，所述的中空纤维管，或所述的组合物，以及药学上可接受的辅料。
28.本发明还提供了预防和/或治疗糖尿病的方法，施用所述的组合物或所述的药物。
29.本发明的有益效果包括但不限于：
30.(1)本发明首次人工设计合成非天然氨基酸调控的基因翻译系统，所述系统均可被上载到哺乳动物细胞中并执行相应指令，并通过调节非天然氨基酸来实现时空可控的转基因表达。
31.(2)本发明设计的非天然氨基酸调控的基因翻译系统是翻译水平调控系统，相较于现有的转录水平的基因开关，具有更快速的目的蛋白表达速率。
32.(3)本发明所使用的基因翻译系统的刺激物非天然氨基酸是一种化学合成的物质，而自然环境或体内无法合成，相较于现有的基因开关系统正交性更好，且非天然氨基酸与天然氨基酸结构类似，有相似的药物代谢动力学性质，因而可通过制成非天然氨基酸“饼干”的方式调控体内的基因表达。
33.(4)本发明合成了非天然氨基酸调控的多功能基因表达平台，所述调控平台可用于疾病治疗，生物计算机；通过灌胃非天然氨基酸或食用非天然氨基酸“饼干”刺激胰岛素表达用于糖尿病治疗的新方法；利用微胶囊技术，将含有非天然氨基酸刺激的胰岛素表达系统的工程化细胞移植至糖尿病模型鼠中，当小鼠直接灌胃非天然氨基酸或食用非天然氨基酸“饼干”刺激后，即可激活基因翻译系统表达胰岛素，从而达到降血糖治疗糖尿病的目的。
34.(5)本发明的多功能表达平台应用于糖尿病治疗上，在治疗后的90分钟就有明显的降血糖效果，因此可以确定非天然氨基酸调控系统的降血糖效果不是由单纯灌胃非天然氨基酸所引起的。
附图说明
35.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
36.图1示非天然氨基酸调控的基因翻译系统及调控方法的原理示意图；
37.图2示非天然氨基酸调控的基因翻译系统的优化研究，即由酪氨酸trna合成酶/trna分子对的表达载体分别和4种不同的异位琥珀密码子插入位点的目的基因元件进行组合的实验结果；
38.图3示非天然氨基酸调控的基因翻译系统的优化研究，即由吡咯赖氨酸trna合成酶/trna分子对的表达载体分别和4种不同的异位琥珀密码子插入位点的目的基因元件进行组合的实验结果；
39.图4示非天然氨基酸调控的基因翻译系统的表达速率特征研究，即比较酪氨酸trna合成酶/trna和seap(v27tag)构成的翻译调控系统与转录调控系统tetone的目的蛋白表达速率快慢的实验结果；
40.图5示非天然氨基酸调控的基因翻译系统的刺激信号接触时间特征研究，即比较酪氨酸trna合成酶/trna和v27tag构成的翻译调控系统与转录调控系统tetone激活表达目的蛋白所需要的刺激信号接触时间；
41.图6示非天然氨基酸调控的基因翻译系统具有可逆性的表达特征研究的实验结果；
42.图7示非天然氨基酸调控的基因翻译系统与转录水平调控系统的相容性研究，即
利用酪氨酸trna合成酶/trna分子对的表达载体分别和6种不同的异位琥珀密码子插入位点的转录因子tta元件进行组合优化的实验结果；
43.图8示以非天然氨基酸和多西环素为双输入信号的转录-翻译结合调控系统和逻辑运算的工作情况研究的实验结果；
44.图9示非天然氨基酸调控的基因翻译系统在hek293t细胞中的优化研究，即利用酪氨酸trna合成酶/trna分子对的表达载体分别和6种不同的异位琥珀密码子插入位点的胰岛素基因元件进行组合优化的实验结果；
45.图10示筛选并测定含有非天然氨基酸调控的基因翻译系统的稳定细胞系的seap表达实验结果；
46.图11示筛选并测定含有非天然氨基酸调控的基因翻译系统的稳定细胞系的胰岛素表达实验结果；
47.图12示通过微胶囊包埋细胞移植，非天然氨基酸调控的基因翻译系统在野生型鼠体内调控报告基因seap表达研究的实验结果；
48.图13示通过中空纤维管包埋细胞移植，非天然氨基酸调控的基因翻译系统在野生型鼠体内调控报告基因seap表达的实验结果；
49.图14示在1型糖尿病的治疗过程中，非天然氨基酸诱导胰岛素表达系统调控胰岛素表达的实验结果；
50.图15示1型糖尿病的治疗过程中，非天然氨基酸诱导胰岛素表达系统降低血糖的实验结果；
51.图16示非天然氨基酸诱导胰岛素表达系统在1型糖尿病的治疗过程中糖耐受的实验结果；
52.图17示非天然氨基酸诱导胰岛素表达系统在1型糖尿病鼠中快速降低血糖的实验结果；
53.图18示在1型糖尿病的治疗过程中，非天然氨基酸诱导胰岛素表达系统调控胰岛素表达的长期研究的胰岛素实验结果；
54.图19示在1型糖尿病的治疗过程中，非天然氨基酸诱导胰岛素表达系统调控胰岛素表达的长期研究的降低血糖实验结果；
55.图20示非天然氨基酸诱导胰岛素表达系统在1型糖尿病的长期治疗过程中糖耐受研究的实验结果。
具体实施方式
56.本发明公开了非天然氨基酸调控的基因翻译系统及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
57.本发明提供了一种非天然氨基酸调控的基因翻译系统调控的多功能基因表达平台，其中所述平台是以非天然氨基酸调控的基因翻译系统为核心，即由非天然氨基酸精确调控蛋白的翻译，并将其应用于糖尿病治疗和生物计算机。
58.其中，本发明所述的非天然氨基酸调控的基因翻译系统，是由氨酰trna合成酶(aminoacyl-trna synthetase，aars)和trna正交分子对，以及读码框中含有终止密码子的目的基因序列三部分组成。
59.其中，基因翻译系统中所述的氨酰trna合成酶和trna正交分子对可以是酪氨酸氨酰trna合成酶和trna正交分子对。其中，酪氨酸氨酰trna合成酶和trna正交分子对使用的非天然氨基酸可以是氧-甲基酪氨酸(o-methyl-tyrosine，omey)。
60.其中，基因翻译系统中所述的氨酰trna合成酶和trna正交分子对可以是吡咯赖氨酸氨酰trna合成酶和trna正交分子对。其中，吡咯赖氨酸氨酰trna合成酶和trna正交分子对使用的非天然氨基酸可以是nε-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸(n-ε-((tert-butoxy)carbonyl)-l-lysine，bock)。
61.其中，基因翻译系统中所述的目的蛋白可以是单一蛋白报告基因如分泌型碱性磷酸酶；优选地，所述的分泌型碱性磷酸酶，其读码框中终止密码子引入位点可以是seap(v2tag),seap(l22tag),seap(v27tag)，seap(q50tag)。
62.其中，基因翻译系统中所述的目的蛋白可以是单一蛋白转录因子tta；优选地，所述的转录因子tta，其读码框中终止密码子引入位点可以是tta(l4tag),tta(s7tag)，tta(k46tag)，tta(e71tag)，tta(y110tag)，tta(e159tag)。
63.其中，基因翻译系统中所述的目的蛋白可以是单一药物蛋白胰岛素(insulin,ins)；优选地，所述的胰岛素，其读码框中终止密码子引入位点可以是ins(l4tag),ins(f7tag),ins(q23tag)，ins(e64tag)，ins(l66tag)。
64.其中，基因翻译系统中所述的目的蛋白也可以是编码同时表达报告基因和功能蛋白的基因序列如seap(v27tag)-p2a-ins(f7tag)。
65.其中，在所述的非天然氨基酸调控的基因翻译系统由人工设计、合成的双质粒系统装载，所述双质粒系统中涉及的序列详见附表1。
66.本发明中，所述非天然氨基酸调控的基因翻译系统在体内的调控方式可通过口服摄入非天然氨基酸来实现，主要包括：a)灌胃非天然氨基酸；b)喂食非天然氨基酸“饼干”。
67.本发明还提供了一种所述非天然氨基酸调控的基因翻译系统在诱导基因表达中的应用。
68.本发明还提供了一种非天然氨基酸诱导基因表达的调控方法，所述方法是由非天然氨基酸调控的基因翻译系统进行调控。其中，所述非天然氨基酸调控的基因翻译系统诱导基因表达的调控方式如图1所示。当非天然氨基酸不存在时，所述氨酰trna合成酶无法催化正交trna，正交trna无法结合所述的目的蛋白基因上的读码框中终止密码子，目的蛋白基因翻译终止；而当非天然氨基酸存在时，所述氨酰trna合成酶可以催化正交trna和非天然氨基酸形成非天然氨基酸酰化trna，非天然氨基酸酰化trna识别所述的目的蛋白基因上的读码框中终止密码子上，启动目的蛋白基因翻译。
69.本发明还提供了含有非天然氨基酸调控的基因翻译系统的真核表达载体。
70.本发明还提供了含有非天然氨基酸调控的基因翻译系统的工程化细胞；其中，所述工程化细胞为动物细胞系，如hek293t。
71.本发明还提供了一种中空纤维管，所述中空纤维管包埋所述非天然氨基酸调控的基因翻译系统、或所述工程化细胞，其含有所述非天然氨基酸调控的基因翻译系统的工程
化细胞。其中，所述中空纤维管是由聚偏氟乙烯形成的一种半透膜，它能允许小分子物质的自由通透，如细胞生长所需的营养物质、诱导物非天然氨基酸等，同时能拦截大于50kd的大蛋白如免疫球蛋白、白蛋白等自由通透。所述的中空纤维管特性既能保证中空纤维管内细胞的正常生长，又能巧妙地避开体内免疫系统的攻击。并且，所述中空纤维管还能保证细胞产生的效应分子或蛋白可分泌至中空纤维管外，行使其功能。
72.本发明中，所述含有非天然氨基酸调控的基因翻译系统的工程化细胞均可进行中空纤维管包埋，再将其移植至小鼠腹腔内，当通过灌胃非天然氨基酸能剂量依赖地调控报告基因的蛋白翻译。
73.本发明还提供了一种微胶囊，所述微胶囊包裹所述非天然氨基酸调控的基因翻译系统、或所述工程化细胞，其含有所述非天然氨基酸调控的基因翻译系统的工程化细胞。其中，所述微胶囊是由海藻酸-多聚赖氨酸-海藻酸形成的一种半透膜，它能允许小分子物质的自由通透，如细胞生长所需的营养物质、诱导物非天然氨基酸等，同时能拦截大于75kd的大蛋白如免疫球蛋白、白蛋白等自由通透。所述微胶囊的特性既能保证胶囊内细胞的正常生长，又能巧妙地避开体内免疫系统的攻击。并且，所述胶囊还能保证细胞产生的效应分子或蛋白可分泌至胶囊外，行使其功能。
74.本发明中，所述含有非天然氨基酸调控的基因翻译系统的工程化细胞均可进行包裹形成微胶囊，再将其移植至小鼠腹腔内，当通过灌胃非天然氨基酸能剂量依赖地调控报告基因的蛋白翻译。
75.本发明还提供了非天然氨基酸调控的多功能基因表达平台、所述非天然氨基酸调控的基因翻译系统、所述真核表达载体、所述工程化细胞或所述微胶囊在糖尿病治疗上的应用，所述糖尿病治疗的应用是通过灌胃非天然氨基酸或食用非天然氨基酸“饼干”刺激非天然氨基酸调控的基因翻译系统表达胰岛素的方法实现(通过改造非天然氨基酸调控的基因翻译系统，使其通过灌胃非天然氨基酸或食用非天然氨基酸“饼干”刺激产生胰岛素的方法实现，即，所述治疗方法是利用非天然氨基酸调控的基因翻译系统精确调控胰岛素的表达来治疗糖尿病)，所述多功能平台可调控胰岛素精准表达释放用于糖尿病治疗。
76.本发明还提供了一种所述非天然氨基酸调控的多功能基因表达平台在小鼠体内调控血糖的方法，所述方法包括以下步骤：
77.a)人工构建含有非天然氨基酸刺激胰岛素表达调控系统的哺乳动物细胞表达载体；
78.b)制备含有非天然氨基酸刺激胰岛素表达调控系统的工程化细胞；
79.c)制备微胶囊，其内部包裹非天然氨基酸刺激胰岛素表达调控系统的工程化细胞；
80.d)所述微胶囊以腹腔注射的形式移植至糖尿病模型鼠体内；
81.e)小鼠体内通过灌胃非天然氨基酸或食用非天然氨基酸“饼干”刺激胰岛素，并释放至血液中以达到降血糖的目的。
82.本发明还提供了一种治疗糖尿病的新方法，通过所述非天然氨基酸调控的多功能基因表达平台、所述非天然氨基酸调控的基因翻译系统、所述真核表达载体、所述工程化细胞或所述微胶囊，采用灌胃非天然氨基酸或食用非天然氨基酸“饼干”的方式便可达到降血糖的效果。
83.本发明所述的非天然氨基酸调控的多功能基因表达平台、所述非天然氨基酸调控的基因翻译系统、所述真核表达载体、所述工程化细胞或所述微胶囊也可用于其它疾病的治疗，即通过表达不同治疗功能的药物蛋白来实现不同疾病的治疗。
84.本发明还提供了非天然氨基酸调控的多功能基因表达平台、所述非天然氨基酸调控的基因翻译系统、所述真核表达载体、所述工程化细胞在生物计算上的应用，可用于构建复杂的生物计算机；所述生物计算机的应用是通过合成一套双输入信号为非天然氨基酸和多西环素的逻辑门实现的；其中所述的逻辑运算为a不包括b(animply b)。
85.其中，所述a不包括b(animply b)的逻辑运算中，只有当a信号非天然氨基酸输入而b信号多西环素不输入时才有信号seap的输出。
86.本发明所述的非天然氨基酸调控的基因翻译系统均具有微调性、可逆性的表达动力学特征。其中，所述的微调性是指下游的基因表达均受非天然氨基酸的精准调控，并呈现出剂量依赖性的关系；所述的可逆性是指非天然氨基酸调控基因表达的整个过程是可逆的，可以通过控制非天然氨基酸的存在与否实现基因表达的开启或关闭。
87.本发明的有益效果在于，(1)本发明首次人工设计合成非天然氨基酸调控的基因翻译系统，所述系统均可被上载到哺乳动物细胞中并执行相应指令，并通过调节非天然氨基酸来实现时空可控的转基因表达。(2)本发明设计的非天然氨基酸调控的基因翻译系统是翻译水品调控系统，相较于现有的转录水平的基因开关，具有更快速的目的蛋白表达速率。(3)本发明所使用的基因翻译系统的刺激物非天然氨基酸是一种化学合成的物质，而自然环境或体内无法合成，相较于现有的基因开关系统正交性更好，且非天然氨基酸与天然氨基酸结构类似，有相似的药物代谢动力学性质，因而可通过制成非天然氨基酸“饼干”的方式调控体内的基因表达。(4)本发明合成了非天然氨基酸调控的多功能基因表达平台，所述调控平台可用于疾病治疗，生物计算机；通过灌胃非天然氨基酸或食用非天然氨基酸“饼干”刺激胰岛素表达用于糖尿病治疗的新方法；利用微胶囊技术，将含有非天然氨基酸刺激的胰岛素表达系统的工程化细胞移植至糖尿病模型鼠中，当小鼠直接灌胃非天然氨基酸或食用非天然氨基酸“饼干”刺激后，即可激活基因翻译系统表达胰岛素，从而达到降血糖治疗糖尿病的目的。(5)本发明的多功能表达平台应用于糖尿病治疗上，在治疗后的90分钟就有明显的降血糖效果，因此可以确定非天然氨基酸调控系统的降血糖效果不是由单纯灌胃非天然氨基酸所引起的。
88.本发明提供的非天然氨基酸调控的基因翻译系统及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
89.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
90.实施例1：非天然氨基酸调控的开关系统的构建
91.本实施例中包含了非天然氨基酸调控的开关系统所涉及质粒载体的构建方法，但不对
92.本发明的保护范围有所界定。详细设计方案及步骤见表1。
93.表1
94.[0095][0096]
tyrrs序列：如seq id no.1所示
[0097]
atggcaagcagtaacttgattaaacaattgcaagagcgggggctggtagcccaggtgacggacgaggaagcgttagcagagcgactggcgcaaggcccgatcgcactcgtgtgtggcttcgatcctaccgctgacagcttgcatttggggcatcttgttccattgttatgcctgaaacgcttccagcaggcgggccacaagccggttgcgctggtaggcggcgcgacgggtctgattggcgacccgagcttcaaagctgccgagcgtaagctgaacaccgaagaaactgttcaggagtgggtggacaaaatccgtaagcaggttgccccgttcctcgatttcgactgtggagaaaactctgctatcgcggccaataattatgactggttcggcaatatgaatgtgctgaccttcctgcgcgatattggcaaacacttctccgttaaccagatgatcaacaaagaagcggttaagcagcgtctcaaccgtgaagatcaggggatttcgttcactgagttttcctacaacctgctgcagggttatagtatggcctgtttgaacaaacagtacggtgtggtgctgcaaattggtggttctgaccagtggggtaacatcacttctggtatcgacctgacccgtcgtctgcatcagaatcaggtgtttggcctgaccgttccgctgatcactaaagcagatggcaccaaatttggtaaaactgaaggcggcgcagtctggttggatccgaagaaaaccagcccgtacaaattctaccagttctggatcaacactgcgcgtgccgacgtttaccgcttcctgaagttcttcacctttatgagcattgaagagatcaacgccctggaagaagaagataaaaacagcggtaaagcaccgcgcgcccagtatgtactggcggagcaggtgactcgtctggttcacggtgaagaaggtttacaggcggcaaaacgtattaccgaatgcctgttcagcggttct
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[0098]
tyrtrna序列：如seq id no.2所示
[0099]
aaaaaatggtgggggacggattcgaaccgccgaacccaaagggagcggatttagagtccgccgcgtttagccacttcgctaccccaccggatccgagtggtctcatacagaacttataagattcccaaatccaaagacatttcacgtttatggtgatttcccagaacacatagcgacatgcaaat
[0100]
pylrs序列：如seq id no.3所示
[0101]
atggcaagcagtaacttgattaaacaattgcaagagcgggggctggtagcccaggtgacggacgaggaagcgttagcagagcgactggcgcaaggcccgatcgcactcgtgtgtggcttcgatcctaccgctgacagcttgcatttggggcatcttgttccattgttatgcctgaaacgcttccagcaggcgggccacaagccggttgcgctggtaggcggcgcgacgggtctgattggcgacccgagcttcaaagctgccgagcgtaagctgaacaccgaagaaactgttcaggagtgggtggacaaaatccgtaagcaggttgccccgttcctcgatttcgactgtggagaaaactctgctatcgcggccaataattatgactggttcggcaatatgaatgtgctgaccttcctgcgcgatattggcaaacacttctccgttaaccagatgatcaacaaagaagcggttaagcagcgtctcaaccgtgaagatcaggggatttcgttcactgagttttcctacaacctgctgcagggttatagtatggcctgtttgaacaaacagtacggtgtggtgctgcaaattggtggttctgaccagtggggtaacatcacttctggtatcgacctgacccgtcgtctgcatcagaatcaggtgtttggcctgaccgttccgctgatcactaaagcagatggcaccaaatttggtaaaactgaaggcggcgcagtctggttggatccgaagaaaaccagcccgtacaaattctaccagttctggatcaacactgcgcgtgccgacgtttaccgcttcctgaagttcttcacctttatgagcattgaagagatcaacgccctggaagaagaagataaaaacagcggtaaagcaccgcgcgcccagtatgtactggcggagcaggtgactcgtctggttcacggtgaagaaggtttacaggcggcaaaacgtattaccgaatgcctgttcagcggttctttgagtgcgctgagtgaagcggacttcgaacagctggcgcaggacggcgtaccgatggttgagatggaaaagggcgcagacctgatgcaggcactggtcgattctgaactgcaaccttcccgtggtcaggcacgtaaaactatcgcctccaatgccatcaccattaacggtgaaaaacagtccgatcctgaatacttctttaaagaagaagatcgtctgtttggtcgttttaccttactgcgtcgcggtaaaaagaattactgtctgatttgctggaaagggcccgtt
[0102]
pyltrna序列：如seq id no.4所示
[0103]
aaaaaatggtgggggacggattcgaaccgccgaacccaaagggagcggatttaga
[0104]
gtccgccgcgtttagccacttcgctaccccaccggatccgagtggtctcatacagaacttataagattcccaaatccaaagacatttcacgtttatggtgatttcccagaacacatagcgacatgcaaat
[0105]
seap(v2)序列：如seq id no.5所示
[0106]
atgtagctggggccctgcatgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggcatcatcccagttgaggaggagaacccggacttctggaaccgcgaggcagccgaggccctgggtgccgccaagaagctgcagcctgcacagacagccgccaagaacctcatcatcttcctgggcgatgggatgggggtgtctacggtgacagctgccaggattctaaaagggcagaagaaggacaaactggggcctgagatacccctggctatggaccgcttcccatatgtggctctgtccaagacatacaatgtagacaaacatgtgccagacagtggagccacagccacggcctacctgtgcggggtcaagggcaacttccagaccattggcttgagtgcagccgcccgctttaaccagtgcaacacgacacgcggcaacgaggtcatctccgtgatgaatcgggccaagaaagcagggaagtcagtgggagtggtaaccaccacacgagtgcagcacgcctcgccagccggcacctacgcccacacggtgaaccgcaactggtactcggacgccgacgtgcctgcctcggcccgcca
ggaggggtgccaggacatcgctacgcagctcatctccaacatggacattgatgtgatcctgggtggaggccgaaagtacatgtttcgcatgggaaccccagaccctgagtacccagatgactacagccaaggtgggaccaggctggacgggaagaatctggtgcaggaatggctggcgaagcgccagggtgcccggtatgtgtggaaccgcactgagctcatgcaggcttccctggacccgtctgtgacccatctcatgggtctctttgagcctggagacatgaaatacgagatccaccgagactccacactggacccctccctgatggagatgacagaggctgccctgcgcctgctgagcaggaacccccgcggcttcttcctcttcgtggagggtggtcgcatcgaccacggtcatcacgaaagcagggcttaccgggcactgactgagacgatcatgttcgacgacgccattgagagggcgggccagctcaccagcgaggaggacacgctgagcctcgtcactgccgaccactcccacgtcttctccttcggaggctaccccctgcgagggagctccatcttcgggctggcccctggcaaggcccgggacaggaaggcctacacggtcctcctatacggaaacggtccaggctatgtgctcaaggacggcgcccggccggatgttaccgagagcgagagcgggagccccgagtatcggcagcagtcagcagtgcccctggacgaagagacccacgcaggcgaggacgtggcggtgttcgcgcgcggcccgcaggcgcacctggttcacggcgtgcaggagcagaccttcatagcgcacgtcatggccttcgccgcctgcctggagccctacaccgcctgcgacctggcgccccccgccggcaccaccgacgccgcgcacccggggcggtcccggtccaagcgtctggat
[0107]
seap(l22)序列：如seq id no.6所示
[0108]
atggttctggggccctgcatgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctcctagggcatcatcccagttgaggaggagaacccggacttctggaaccgcgaggcagccgaggccctgggtgccgccaagaagctgcagcctgcacagacagccgccaagaacctcatcatcttcctgggcgatgggatgggggtgtctacggtgacagctgccaggattctaaaagggcagaagaaggacaaactggggcctgagatacccctggctatggaccgcttcccatatgtggctctgtccaagacatacaatgtagacaaacatgtgccagacagtggagccacagccacggcctacctgtgcggggtcaagggcaacttccagaccattggcttgagtgcagccgcccgctttaaccagtgcaacacgacacgcggcaacgaggtcatctccgtgatgaatcgggccaagaaagcagggaagtcagtgggagtggtaaccaccacacgagtgcagcacgcctcgccagccggcacctacgcccacacggtgaaccgcaactggtactcggacgccgacgtgcctgcctcggcccgccaggaggggtgccaggacatcgctacgcagctcatctccaacatggacattgatgtgatcctgggtggaggccgaaagtacatgtttcgcatgggaaccccagaccctgagtacccagatgactacagccaaggtgggaccaggctggacgggaagaatctggtgcaggaatggctggcgaagcgccagggtgcccggtatgtgtggaaccgcactgagctcatgcaggcttccctggacccgtctgtgacccatctcatgggtctctttgagcctggagacatgaaatacgagatccaccgagactccacactggacccctccctgatggagatgacagaggctgccctgcgcctgctgagcaggaacccccgcggcttcttcctcttcgtggagggtggtcgcatcgaccacggtcatcacgaaagcagggcttaccgggcactgactgagacgatcatgttcgacgacgccattgagagggcgggccagctcaccagcgaggaggacacgctgagcctcgtcactgccgaccactcccacgtcttctccttcggaggctaccccctgcgagggagctccatcttcgggctggcccctggcaaggcccgggacaggaaggcctacacggtcctcctatacggaaacggtccaggctatgtgctcaaggacggcgcccggccggatgttaccgagagcgagagcgggagccccgagtatcggcagcagtcagcagtgcccctggacgaagagacccacgcaggcgaggacgtggcggtgttcgcgcgcggcccgcaggcgcacctggttcacggcgtgcaggagcagaccttcatagcgcacgtcatggccttcgccgcctgcctggagccctacaccgcctgcgacctggcgccccccgccggcaccaccgacgccgcgcacccggggcggtcccggtccaagcgtctggat
[0109]
seap(v27)序列：如seq id no.7所示
[0110]
atggttctggggccctgcatgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggcatcatcccataggaggaggagaacccggacttctggaaccgcgaggcagccgaggccctgggtgccgccaagaagctgcagcctgcacagacagccgccaagaacctcatcatcttcctgggcgatgggatgggggtgtctacggtgacagctg
ccaggattctaaaagggcagaagaaggacaaactggggcctgagatacccctggctatggaccgcttcccatatgtggctctgtccaagacatacaatgtagacaaacatgtgccagacagtggagccacagccacggcctacctgtgcggggtcaagggcaacttccagaccattggcttgagtgcagccgcccgctttaaccagtgcaacacgacacgcggcaacgaggtcatctccgtgatgaatcgggccaagaaagcagggaagtcagtgggagtggtaaccaccacacgagtgcagcacgcctcgccagccggcacctacgcccacacggtgaaccgcaactggtactcggacgccgacgtgcctgcctcggcccgccaggaggggtgccaggacatcgctacgcagctcatctccaacatggacattgatgtgatcctgggtggaggccgaaagtacatgtttcgcatgggaaccccagaccctgagtacccagatgactacagccaaggtgggaccaggctggacgggaagaatctggtgcaggaatggctggcgaagcgccagggtgcccggtatgtgtggaaccgcactgagctcatgcaggcttccctggacccgtctgtgacccatctcatgggtctctttgagcctggagacatgaaatacgagatccaccgagactccacactggacccctccctgatggagatgacagaggctgccctgcgcctgctgagcaggaacccccgcggcttcttcctcttcgtggagggtggtcgcatcgaccacggtcatcacgaaagcagggcttaccgggcactgactgagacgatcatgttcgacgacgccattgagagggcgggccagctcaccagcgaggaggacacgctgagcctcgtcactgccgaccactcccacgtcttctccttcggaggctaccccctgcgagggagctccatcttcgggctggcccctggcaaggcccgggacaggaaggcctacacggtcctcctatacggaaacggtccaggctatgtgctcaaggacggcgcccggccggatgttaccgagagcgagagcgggagccccgagtatcggcagcagtcagcagtgcccctggacgaagagacccacgcaggcgaggacgtggcggtgttcgcgcgcggcccgcaggcgcacctggttcacggcgtgcaggagcagaccttcatagcgcacgtcatggccttcgccgcctgcctggagccctacaccgcctgcgacctggcgccccccgccggcaccaccgacgccgcgcacccggggcggtcccggtccaagcgtctggat
[0111]
seap(q50)序列：如seq id no.8所示
[0112]
atggttctggggccctgcatgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggcatcatcccagttgaggaggagaacccggacttctggaaccgcgaggcagccgaggccctgggtgccgccaagaagctgtagcctgcacagacagccgccaagaacctcatcatcttcctgggcgatgggatgggggtgtctacggtgacagctgccaggattctaaaagggcagaagaaggacaaactggggcctgagatacccctggctatggaccgcttcccatatgtggctctgtccaagacatacaatgtagacaaacatgtgccagacagtggagccacagccacggcctacctgtgcggggtcaagggcaacttccagaccattggcttgagtgcagccgcccgctttaaccagtgcaacacgacacgcggcaacgaggtcatctccgtgatgaatcgggccaagaaagcagggaagtcagtgggagtggtaaccaccacacgagtgcagcacgcctcgccagccggcacctacgcccacacggtgaaccgcaactggtactcggacgccgacgtgcctgcctcggcccgccaggaggggtgccaggacatcgctacgcagctcatctccaacatggacattgatgtgatcctgggtggaggccgaaagtacatgtttcgcatgggaaccccagaccctgagtacccagatgactacagccaaggtgggaccaggctggacgggaagaatctggtgcaggaatggctggcgaagcgccagggtgcccggtatgtgtggaaccgcactgagctcatgcaggcttccctggacccgtctgtgacccatctcatgggtctctttgagcctggagacatgaaatacgagatccaccgagactccacactggacccctccctgatggagatgacagaggctgccctgcgcctgctgagcaggaacccccgcggcttcttcctcttcgtggagggtggtcgcatcgaccacggtcatcacgaaagcagggcttaccgggcactgactgagacgatcatgttcgacgacgccattgagagggcgggccagctcaccagcgaggaggacacgctgagcctcgtcactgccgaccactcccacgtcttctccttcggaggctaccccctgcgagggagctccatcttcgggctggcccctggcaaggcccgggacaggaaggcctacacggtcctcctatacggaaacggtccaggctatgtgctcaaggacggcgcccggccggatgttaccgagagcgagagcgggagccccgagtatcggcagcagtcagcagtgcccctggacgaagagacccacgcaggcgaggacgtggcggtgttcgcgcgcggcccgcaggcgcacctggttcacggcgtgcaggagcagaccttcatagcgcacgtcatggccttcgccgcctgcctggagccctacaccgcctgcgacctggcgccccccgccggcaccaccgacgccgcgcaccc
ggggcggtcccggtccaagcgtctggat
[0113]
seap序列：如seq id no.9所示
[0114]
atggttctggggccctgcatgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggcatcatcccagttgaggaggagaacccggacttctggaaccgcgaggcagccgaggccctgggtgccgccaagaagctgcagcctgcacagacagccgccaagaacctcatcatcttcctgggcgatgggatgggggtgtctacggtgacagctgccaggattctaaaagggcagaagaaggacaaactggggcctgagatacccctggctatggaccgcttcccatatgtggctctgtccaagacatacaatgtagacaaacatgtgccagacagtggagccacagccacggcctacctgtgcggggtcaagggcaacttccagaccattggcttgagtgcagccgcccgctttaaccagtgcaacacgacacgcggcaacgaggtcatctccgtgatgaatcgggccaagaaagcagggaagtcagtgggagtggtaaccaccacacgagtgcagcacgcctcgccagccggcacctacgcccacacggtgaaccgcaactggtactcggacgccgacgtgcctgcctcggcccgccaggaggggtgccaggacatcgctacgcagctcatctccaacatggacattgatgtgatcctgggtggaggccgaaagtacatgtttcgcatgggaaccccagaccctgagtacccagatgactacagccaaggtgggaccaggctggacgggaagaatctggtgcaggaatggctggcgaagcgccagggtgcccggtatgtgtggaaccgcactgagctcatgcaggcttccctggacccgtctgtgacccatctcatgggtctctttgagcctggagacatgaaatacgagatccaccgagactccacactggacccctccctgatggagatgacagaggctgccctgcgcctgctgagcaggaacccccgcggcttcttcctcttcgtggagggtggtcgcatcgaccacggtcatcacgaaagcagggcttaccgggcactgactgagacgatcatgttcgacgacgccattgagagggcgggccagctcaccagcgaggaggacacgctgagcctcgtcactgccgaccactcccacgtcttctccttcggaggctaccccctgcgagggagctccatcttcgggctggcccctggcaaggcccgggacaggaaggcctacacggtcctcctatacggaaacggtccaggctatgtgctcaaggacggcgcccggccggatgttaccgagagcgagagcgggagccccgagtatcggcagcagtcagcagtgcccctggacgaagagacccacgcaggcgaggacgtggcggtgttcgcgcgcggcccgcaggcgcacctggttcacggcgtgcaggagcagaccttcatagcgcacgtcatggccttcgccgcctgcctggagccctacaccgcctgcgacctggcgccccccgccggcaccaccgacgccgcgcacccggggcggtcccggtccaagcgtctggat
[0115]
tta(l4tag)序列：如seq id no.10所示
[0116]
atgtctagataggacaagagcaaagtcataaactctgctctggaattactcaatgaagtcggtatcgaaggcctgacgacaaggaaactcgctcaaaagctgggagttgagcagcctaccctgtactggcacgtgaagaacaagcgggccctgctcgatgccctggcaatcgagatgctggacaggcatcatacccacttctgccccctggaaggcgagtcatggcaagactttctgcggaacaacgccaagtcattccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggctaaagtgcatctcggcacccgcccaacagagaaacagtacgaaaccctggaaaatcagctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggatcaggagcatcaagtagcaaaagaggaaagagagacacctaccaccgattctatgcccccacttctgagacaagcaattgagctgttcgaccatcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtggcctggagaaacagctaaagtgcgaaagcggcgggccggccgacgcccttgacgattttgacttagacatgctcccagccgatgcccttgacgactttgaccttgatatgctgcctgctgacgctcttgacgattttgaccttgacatgctccccgggtaa
[0117]
tta(s7tag)序列：如seq id no.11所示
[0118]
atgtctagactggacaagtagaaagtcataaactctgctctggaattactcaatgaagtcggtatcgaaggcctgacgacaaggaaactcgctcaaaagctgggagttgagcagcctaccctgtactggcacgtgaagaacaagcgggccctgctcgatgccctggcaatcgagatgctggacaggcatcatacccacttctgccccctggaaggcgagtcatggcaagactttctgcggaacaacgccaagtcattccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggctaaagtgcat
ctcggcacccgcccaacagagaaacagtacgaaaccctggaaaatcagctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggatcaggagcatcaagtagcaaaagaggaaagagagacacctaccaccgattctatgcccccacttctgagacaagcaattgagctgttcgaccatcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtggcctggagaaacagctaaagtgcgaaagcggcgggccggccgacgcccttgacgattttgacttagacatgctcccagccgatgcccttgacgactttgaccttgatatgctgcctgctgacgctcttgacgattttgaccttgacatgctccccgggtaa
[0119]
tta(k46tag)序列：如seq id no.12所示
[0120]
atgtctagactggacaagagcaaagtcataaactctgctctggaattactcaatgaagtcggtatcgaaggcctgacgacaaggaaactcgctcaaaagctgggagttgagcagcctaccctgtactggcacgtgtagaacaagcgggccctgctcgatgccctggcaatcgagatgctggacaggcatcatacccacttctgccccctggaaggcgagtcatggcaagactttctgcggaacaacgccaagtcattccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggctaaagtgcatctcggcacccgcccaacagagaaacagtacgaaaccctggaaaatcagctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggatcaggagcatcaagtagcaaaagaggaaagagagacacctaccaccgattctatgcccccacttctgagacaagcaattgagctgttcgaccatcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtggcctggagaaacagctaaagtgcgaaagcggcgggccggccgacgcccttgacgattttgacttagacatgctcccagccgatgcccttgacgactttgaccttgatatgctgcctgctgacgctcttgacgattttgaccttgacatgctccccgggtaa
[0121]
tta(e71tag)序列：如seq id no.13所示
[0122]
atgtctagactggacaagagcaaagtcataaactctgctctggaattactcaatgaagtcggtatcgaaggcctgacgacaaggaaactcgctcaaaagctgggagttgagcagcctaccctgtactggcacgtgaagaacaagcgggccctgctcgatgccctggcaatcgagatgctggacaggcatcatacccacttctgccccctgtagggcgagtcatggcaagactttctgcggaacaacgccaagtcattccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggctaaagtgcatctcggcacccgcccaacagagaaacagtacgaaaccctggaaaatcagctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggatcaggagcatcaagtagcaaaagaggaaagagagacacctaccaccgattctatgcccccacttctgagacaagcaattgagctgttcgaccatcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtggcctggagaaacagctaaagtgcgaaagcggcgggccggccgacgcccttgacgattttgacttagacatgctcccagccgatgcccttgacgactttgaccttgatatgctgcctgctgacgctcttgacgattttgaccttgacatgctccccgggtaa
[0123]
tta(y110tag)序列：如seq id no.14所示
[0124]
atgtctagactggacaagagcaaagtcataaactctgctctggaattactcaatgaagtcggtatcgaaggcctgacgacaaggaaactcgctcaaaagctgggagttgagcagcctaccctgtactggcacgtgaagaacaagcgggccctgctcgatgccctggcaatcgagatgctggacaggcatcatacccacttctgccccctggaaggcgagtcatggcaagactttctgcggaacaacgccaagtcattccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggctaaagtgcatctcggcacccgcccaacagagaaacagtaggaaaccctggaaaatcagctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggatcaggagcatcaagtagcaaaagaggaaagagagacacctaccaccgattctatgcccccacttctgagacaagcaattgagctgttcgaccatcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtggcctggagaaacagctaaagtgcgaaagcggcgggccggccgacgcccttgacgattttgacttagacatgctcccagccgatgcccttgacgactttgaccttgatatgctgcctgctgacgctcttgacgattttgaccttgacatgctccccgggtaa
[0125]
tta(e159tag)序列：如seq id no.15所示
[0126]
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[0127]
ins(l4tag)序列：如seq id no.16所示
[0128]
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[0129]
ins(f7tag)序列：如seq id no.17所示
[0130]
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[0131]
ins(q23tag)序列：如seq id no.18所示
[0132]
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[0133]
ins(e64tag)序列：如seq id no.19所示
[0134]
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[0135]
ins(l66tag)序列：如seq id no.20所示
[0136]
atggccctgctggtgcacttcctgccactgctggccctgctggccctgtgggagccaaagccaacccaggcctttgtgaagcagcacctgtgcggaccacacctggtggaggccctgtacctggtgtgcggagagaggggcttcttttatacacccaagagccggagaaagagggaggaccctcaggtggagcagtaggagctgggaggttcccctggcgatc
tgcagaccctggccctggaggtggcaaggcagaagaggggcatcgtggaccagtgctgtacaagcatctgctccctgtaccagctggagaactattgtaattga
[0137]
seap(v27tag)-ins(f7tag)序列：如seq id no.21所示
[0138]
atgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggcatcatcccagttgaggaggagaacccggacttctggaaccgcgaggcagccgaggccctgggtgccgccaagaagctgcagcctgcacagacagccgccaagaacctcatcatcttcctgggcgatgggatgggggtgtctacggtgacagctgccaggatcctaaaagggcagaagaaggacaaactggggcctgagatacccctggccatggaccgcttcccatatgtggctctgtccaagacatacaatgtagacaaacatgtgccagacagtggagccacagccacggcctacctgtgcggggtcaagggcaacttccagaccattggcttgagtgcagccgcccgctttaaccagtgcaacacgacacgcggcaacgaggtcatctccgtgatgaatcgggccaagaaagcagggaagtcagtgggagtggtaaccaccacacgagtgcagcacgcctcgccagccggcacctacgcccacacggtgaaccgcaactggtactcggacgccgacgtgcctgcctcggcccgccaggaggggtgccaggacatcgctacgcagctcatctccaacatggacattgacgtgatcctaggtggaggccgaaagtacatgtttcgcatgggaaccccagaccctgagtacccagatgactacagccaaggtgggaccaggctggacgggaagaatctggtgcaggaatggctggcgaagcgccagggtgcccggtatgtgtggaaccgcactgagctcatgcaggcttccctggacccgtctgtgacccatctcatgggtctctttgagcctggagacatgaaatacgagatccaccgagactccacactggacccctccctgatggagatgacagaggctgccctgcgcctgctgagcaggaacccccgcggcttcttcctcttcgtggagggtggtcgcatcgaccatggtcatcatgaaagcagggcttaccgggcactgactgagacgatcatgttcgacgacgccattgagagggcgggccagctcaccagcgaggaggacacgctgagcctcgtcactgccgaccactcccacgtcttctccttcggaggctaccccctgcgagggagctccatcttcgggctggcccctggcaaggcccgggacaggaaggcctacacggtcctcctatacggaaacggtccaggctatgtgctcaaggacggcgcccggccggatgttaccgagagcgagagcgggagccccgagtatcggcagcagtcagcagtgcccctggacgaagagacccacgcaggcgaggacgtggcggtgttcgcgcgcggcccgcaggcgcacctggttcacggcgtgcaggagcagaccttcatagcgcacgtcatggccttcgccgcctgcctggagccctacaccgcctgcgacctggcgccccccgccggcaccaccgacgccgcgcacccgggttactctagagtcggggcggccggccgcttcgagcagacaggagcaaccaacttttccctgctgaagcaggcaggcgacgtggaggagaatcctggacccatggccctgtggatgcgctagctgcccctgctggccctgctcgtcctctgggagcccaagcctgcccaggcttttgtcaaacagcacctttgtggtcctcacctggtggaggctctgtacctggtgtgtggggaacgtggtttcttctacacacccaagtcccgtcgtaaaagggaggacccgcaagtgccacaactggagctgggtggaggcccggaggccggggatcttcagaccttggcactggaggttgcccggcagaagcgtggcattgtggatcagtgctgcaccagcatctgctccctctaccaactggagaactactgcaactga
[0139]
实施例2：非天然氨基酸调控的基因翻译系统在hek293t细胞中的优化研究，即利用酪氨酸trna合成酶/trna分子对的表达载体分别和4种不同的异位琥珀密码子插入位点的目的基因元件进行组合优化。
[0140]
第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。
[0141]
第二步，细胞接种。转染前一天将hek293t细胞以每孔1
×
10^5个的细胞量接种于24孔板中，每孔加入500μl含10％fbs的dmem培养基。
[0142]
第三步，质粒转染。本实施例的转染体系可分为4组，包括tyrrs/trna和seap(v2tag),tyrrs/trna和seap(l22tag),tyrrs/trna和seap(v27tag)，tyrrs/trna和seap(q50tag)。将上述每组质粒按总量为800ng,1:1的比例与转染试剂pei(质粒与pei质量比1:3)进行预混，溶于50μlopti-mem中。静置15分钟后，将dna-pei预混液滴加至每孔细胞中。
[0143]
第四步，加入非天然氨基酸。转染4h后，撤去原来的培养基。每组内分别加入含有1mm非天然氨基酸o-methyl-tyrosine(omey)或不含有omey的新鲜培养基。
[0144]
第五步，检测报告基因seap的表达量。48h后，收集细胞上清液，并置于65℃烘箱内加热30分钟以除去内源性的碱性磷酸酶。然后，按照每孔100μl2xbuffer液和20μlpnpp底物的比例预混检测工作液并置于37℃培养箱中进行预热。细胞上清液加热30min后，吸取80μl的上清液至96孔板中，并加入120μl预混的检测工作液，然后将板快速置于酶标仪上，在405nm处检测样品的吸光值(连续检测10次，每次间隔1分钟)。最后，以检测时间为横坐标，对应吸光值为纵坐标绘制并计算出曲线斜率。计算酶活的公式为：酶活＝曲线的斜率x256.8(单位：u/l)。
[0145]
实验结果(见图2)显示上述非天然氨基酸调控的基因翻译系统的不同异位琥珀密码子插入位点优化均能激活报告基因seap的表达，但系统所产生的诱导效果各不相同，其中，seap(v27tag)信噪比最佳。
[0146]
实施例3：非天然氨基酸调控的基因翻译系统在hek293t细胞中的优化研究，即利用吡咯赖氨酸trna合成酶/trna分子对的表达载体分别和4种不同的异位琥珀密码子插入位点的目的基因元件进行组合优化。
[0147]
第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。
[0148]
第二步，细胞接种(具体步骤同实施例2)。
[0149]
第三步，质粒转染。本实施例的转染体系可分为4组，包括pylrs/trna和seap(v2tag),pylrs/trna和seap(l22tag),pylrs/trna和seap(v27tag)，pylrs/trna和seap(q50tag)。将上述每组质粒按总量为800ng,1:1的比例与转染试剂pei(质粒与pei质量比1:3)进行预混，溶于50μlopti-mem中。静置15分钟后，将dna-pei预混液滴加至每孔细胞中。
[0150]
第四步，加入非天然氨基酸。转染4h后，撤去原来的培养基。每组内分别加入含有1mm非天然氨基酸n-ε-((tert-butoxy)carbonyl)-l-lysine(bock)或不含有bock的新鲜培养基。
[0151]
第五步，检测报告基因seap的表达量(具体步骤同实施例2)。
[0152]
实验结果(见图3)显示上述非天然氨基酸调控的基因翻译系统的不同异位琥珀密码子插入位点优化均能激活报告基因seap的表达，但系统所产生的诱导效果各不相同，其中，seap(v27tag)信噪比最佳。
[0153]
实施例4：非天然氨基酸调控的基因翻译系统的表达速率特征研究，即比较酪氨酸trna合成酶rs/trna和seap(v27tag)构成的翻译调控系统与转录调控系统tetone的目的蛋白表达速率快慢。
[0154]
第一步，细胞接种(具体步骤同实施例2)。
[0155]
第二步，质粒转染。本实施例的转染体系可分为2组，包括：tyrrs/trna和v27tag，plvx-tetone-seap。质粒按总量为800ng,与转染试剂pei(质粒与pei质量比1:3)进行预混，溶于50μlopti-mem中。静止15分钟后，将dna-pei预混液滴加至每孔细胞中。
[0156]
第三步，加入刺激信号。转染24h后，撤去原来的培养基。翻译调控系统组内分别加入含有1mm非天然氨基酸omey或不含有omey的新鲜培养基。转录调控系统组内分别加入含有1mm诱导剂多西环素(doxycycline，dox)或不含有dox的新鲜培养基。
[0157]
第四步，检测报告基因seap的表达量(具体步骤同实施例2)。
[0158]
实验结果(见图4)显示非天然氨基酸调控的基因翻译系统比转录水平调控系统的目的蛋白表达速率更快。
[0159]
实施例5：非天然氨基酸调控的基因翻译系统的刺激信号接触时间特征研究，即比较酪氨酸trna合成酶/trna和v27tag构成的翻译调控系统与转录调控系统tetone激活表达目的蛋白所需要的刺激信号接触时间。
[0160]
第一步，细胞接种(具体步骤同实施例2)。
[0161]
第二步，质粒转染(具体步骤同实施例4)。
[0162]
第三步，加入刺激信号。转染24h后，撤去原来的培养基。翻译调控系统组内分别加入含有1mm非天然氨基酸omey或不含有omey的新鲜培养基。转录调控系统组内分别加入含有1mm诱导剂dox或不含有dox的新鲜培养基。使刺激分子接触细胞分别1,5,30,180min后，更换新鲜培养基，48h后取样检测培养基的seap水平。
[0163]
第五步，检测报告基因seap的表达量(具体步骤同实施例2)。
[0164]
实验结果(见图5)显示非天然氨基酸调控的基因翻译系统激活表达目的蛋白所需要的刺激信号接触时间比转录调控系统所需时间更短。
[0165]
实施例6：非天然氨基酸调控的基因翻译系统具有可逆性的表达特征研究。
[0166]
第一步，细胞接种(具体步骤同实施例2)。
[0167]
第二步，质粒转染(具体步骤同实施例4)。
[0168]
第二步，在第1天，“on-off-on”实验组加入1mm的非天然氨基酸；第2天，撤去原有的培养基，加入不含诱导剂的培养基；第3天，重新将培养基更换为含有1mm非天然氨基酸的培养基。与此同时，每隔8h吸取细胞上清液检测报告基因seap的表达量。而“off-on-off”实验组则在第1天加入不含非天然氨基酸的培养基；第2天，加入1mm的非天然氨基酸；第3天，重新将培养基更换为不含诱导剂的培养基。同样地，每隔8h吸取细胞上清液检测报告基因seap的表达量(具体步骤同实施例2)。
[0169]
实验结果(见图6)表明通过控制非天然氨基酸的存在与否可以实现其对系统基因表达的开启或关闭，说明非天然氨基酸调控的基因翻译系统具有良好的可逆性。
[0170]
实施例7：非天然氨基酸调控的基因翻译系统与转录水平调控系统的相容性研究，即利用酪氨酸trna合成酶/trna分子对的表达载体分别和6种不同的异位琥珀密码子插入位点的转录因子tta元件进行组合优化。
[0171]
第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。
[0172]
第二步，细胞接种(具体步骤同实施例2)。
[0173]
第三步，质粒转染。本实施例的转染体系可分为10组，包括tyrrs/trna,tre-seap和tta(l4tag)；tyrrs/trna,tre-seap和tta(s7tag)；tyrrs/trna,tre-seap和tta(k46tag)；tyrrs/trna,tre-seap和tta(e71tag)；tyrrs/trna,tre-seap和tta(y110tag)；tyrrs/trna,tre-seap和tta(e159tag)。将上述每组质粒按总量为800ng,1:1:1的比例与转染试剂pei(质粒与pei质量比1:3)进行预混，溶于50μlopti-mem中。静置15分钟后，将dna-pei预混液滴加至每孔细胞中。
[0174]
第四步，加入非天然氨基酸(具体步骤同实施例2)。
[0175]
第五步，检测报告基因seap的表达量(具体步骤同实施例2)。
[0176]
实验结果(见图7)显示非天然氨基酸调控的基因翻译系统的不同异位琥珀密码子
插入位点均能激活转录因子tta的表达，但系统所产生的诱导效果各不相同，其中，tta(k46tag)信噪比最佳。表明可以形成转录-翻译结合调控系统，即非天然氨基酸调控的基因翻译系统可以和转录水平调控系统相容。
[0177]
实施例8：以非天然氨基酸和多西环素为双输入信号的转录-翻译结合调控系统和逻辑运算的工作情况研究。
[0178]
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详情见表1。
[0179]
第二步，细胞接种(具体步骤同实施例2)。
[0180]
第三步，质粒转染。本实施例中的转染体系为tta(k46tag)，ptre-seap和tyrrs/trna。质粒按总量为800ng,1:1:1的比例与转染试剂pei(质粒与pei质量比1:3)进行预混，溶于50μlopti-mem中。静置15分钟后，将dna-pei预混液滴加至每孔细胞中。
[0181]
第四步，加入刺激分子。转染4小时后，更换新鲜的培养基同时加入不同组合的刺激分子。其中逻辑门所涉及的诱导物组合分为4种，包括(1)不加任何刺激分子，(2)只加1mm的非天然氨基酸，(3)只加1mm的dox，(4)同时加入1mm的非天然氨基酸和1mm的dox两种诱导物。
[0182]
第五步，检测报告基因seap的表达量(具体步骤同实施例2)。
[0183]
实验结果(见图8)表明在可以形成两个刺激分子调控的转录-翻译结合调控系统，上述逻辑门中，seap的不同输出结果都符合相应的输入组合，即表明上述逻辑门在哺乳动物hek293t中可以进行正确的逻辑运算。
[0184]
实施例9：非天然氨基酸调控的基因翻译系统在hek293t细胞中的优化研究，即利用酪氨酸trna合成酶/trna分子对的表达载体分别和6种不同的异位琥珀密码子插入位点的胰岛素基因元件进行组合优化。
[0185]
第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。
[0186]
第二步，细胞接种(具体步骤同实施例2)。
[0187]
第三步，质粒转染。本实施例的转染体系可分为6组，包括tyrrs/trna和ins(l4tag),tyrrs/trna和ins(f7tag),tyrrs/trna和ins(q23tag)，tyrrs/trna和ins(e64tag)，tyrrs/trna和ins(l66tag)。将上述每组质粒按总量为800ng,1:1的比例与转染试剂pei(质粒与pei质量比1:3)进行预混，溶于50μlopti-mem中。静置15分钟后，将dna-pei预混液滴加至每孔细胞中。
[0188]
第四步，加入非天然氨基酸(具体步骤同实施例2)。
[0189]
第五步，利用胰岛素elisa试剂盒(mercodia ab；cat.no.10-1247-01)测定胰岛素的表达量。
[0190]
实验结果(见图9)显示上述非天然氨基酸调控的基因翻译系统的不同异位琥珀密码子插入位点优化均能激活胰岛素的表达，但系统所产生的诱导效果各不相同，其中，ins(f7tag)信噪比最佳。
[0191]
实施例10：筛选并测定含有非天然氨基酸调控的基因翻译系统的稳定细胞系。
[0192]
第一步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。
[0193]
第二步，hek293t细胞接种(具体步骤同实施例2)。
[0194]
第三步，质粒转染。将质粒psb-seap(v27tag)-ins(f7tag)，psb-omeyrs-12trna和转座酶质粒按总量为200ng,5:5:1的比例与转染试剂pei(质粒与pei质量比1:3)进行预混，
溶于50μlopti-mem中。静置15分钟后，将dna-pei预混液滴加至每孔细胞中。
[0195]
第四步，重新接种细胞并加入抗生素进行筛选。转染4h后，将每孔细胞通过胰酶消化重新接种于10cm皿中，并加入1μg/ml的嘌呤霉素和100μg/ml的博来霉素进行筛选。2周之后，挑选单克隆细胞系于24孔板中进行扩增。
[0196]
第五步，鉴定单克隆细胞系的正确性。将扩增好的各个单克隆细胞系接种于24孔板中，其中实验组加入1mm的非天然氨基酸诱导剂。加药48小时后检测报告基因seap的表达量(具体步骤同实施例2)。最后，将测试效果佳的稳定细胞系进行扩增、保存。
[0197]
第六步，验证单克隆细胞系的胰岛素表达能力。将扩增好的单克隆细胞系接种于24孔板中，其中实验组加入1mm的非天然氨基酸诱导剂。加药48小时后检测报告基因胰岛素的表达量(具体步骤同实施例9)。
[0198]
实验结果(见图10，图11)显示获得了具有seap表达高信噪比的单克隆细胞系，而且能够通过非天然氨基酸调控胰岛素表达。
[0199]
实施例11：通过微胶囊包埋细胞移植，非天然氨基酸调控的基因翻译系统在野生型鼠体内调控报告基因seap的表达研究。
[0200]
第一步，准备细胞。将生长状态良好的非天然氨基酸调控的基因翻译系统稳定细胞系培养在含1μg/ml的嘌呤霉素和100μg/ml的博来霉素、10％fbs的dmem培养基。
[0201]
第二步，微胶囊包埋细胞制备。收集细胞，利用微胶囊造粒仪对其包裹，形成含有非天然氨基酸调控的基因翻译系统稳定细胞系的胶囊微球。每个微胶囊含有约200个细胞，直径大小为200μm。
[0202]
第三步，微胶囊体内移植。将微胶囊通过腹腔注射的方式移植至野生型小鼠体内，每只小鼠体内平均移植2x10^6个细胞。
[0203]
第四步，给药。给药方式灌胃不同浓度的非天然氨基酸，每天灌胃3次。
[0204]
第五步，检测小鼠体内seap的表达量。给药48h后，通过眼眶取血的方式收集小鼠血清，采用罗氏的s e ap报告基因化学发光检测试剂盒(roche diagnostics；cat.no.11779842001)。
[0205]
实验结果(见图12)显示，通过微胶囊包埋细胞移植，非天然氨基酸调控的基因翻译系统在野生型鼠体内能精准调控基因表达，具有浓度依赖性，灌胃非天然氨基酸可激活系统的目的蛋白表达。
[0206]
实施例12：通过中空纤维管包埋细胞移植，非天然氨基酸调控的基因翻译系统在野生型鼠体内调控报告基因seap的表达研究。
[0207]
第一步，准备细胞(具体步骤同实施例11)。
[0208]
第二步，中空纤维管包埋细胞。收集细胞，利用注射器将细胞灌入中空纤维管中，将中空纤维管两端封口，形成含有非天然氨基酸调控的基因翻译系统稳定细胞系的中空纤维管。每个中空纤维管含有1x10^6个细胞。
[0209]
第三步，中空纤维管体内移植。将中空纤维管移植至野生型小鼠皮下组织，每只小鼠体内平均移植2根中空纤维管。
[0210]
第四步，给药(具体步骤同实施例11)。
[0211]
第五步，检测小鼠体内seap的表达量(具体步骤同实施例11)。
[0212]
实验结果(见图13)显示，通过中空纤维管包埋细胞移植，非天然氨基酸调控的基
因翻译系统在野生型鼠体内能精准调控基因表达，具有浓度依赖性，灌胃非天然氨基酸可激活系统的目的蛋白表达。
[0213]
实施例13：利用链脲霉素造模法构建1型糖尿病模型鼠。
[0214]
第一步，禁食。给药前，选择40只体重为25g左右，雄性的c57bl/6j小鼠进行长达16h的禁食。
[0215]
第二步，给药。将链脲霉素溶解于柠檬酸缓冲液(0.1mol/l，ph 4.5)中，然后以50mg/kg的给药剂量进行小鼠腹腔注射，并连续注射5天。由于链脲霉素易降解，因此整个过程需要保证药品处于低温避光的状态，且注射过程需快速。
[0216]
第三步，测定血糖值。第14天，在小鼠饥饿4小时后检测血糖水平，血糖值高于18mm的小鼠可视为造模成功。
[0217]
实施例14：在1型糖尿病的治疗过程中，非天然氨基酸诱导胰岛素表达系统调控胰岛素的表达研究。
[0218]
第一步，准备细胞(具体步骤同实施例11)。
[0219]
第二步，微胶囊制备(具体步骤同实施例11)。
[0220]
第三步，微胶囊体内移植(具体步骤同实施例11)。
[0221]
第四步，给药。对照组小鼠灌胃0mg/kg/d的生理盐水，实验组灌胃含有200mg/kg/d的非天然氨基酸的生理盐水。每天注射3次。
[0222]
第五步，检测小鼠空腹血糖。模型鼠进行4小时的禁食。切开小鼠尾巴根部，是血糖仪(拜尔contour plus)检测小鼠血糖。
[0223]
第六步，检测小鼠体内胰岛素的表达量。给药48h后，通过眼眶取血的方式收集小鼠血清，采用胰岛素elisa试剂盒检测小鼠体内的胰岛素表达量。
[0224]
实验结果(见图14，图15)显示在1型糖尿病鼠中，非天然氨基酸能精准调控胰岛素的表达，并且能够改善小鼠高血糖症状。
[0225]
实施例15：非天然氨基酸诱导胰岛素表达系统在1型糖尿病的治疗过程中糖耐受研究。
[0226]
本实例是在1型糖尿病模型鼠进行实例14的治疗后展开的，其糖耐受的具体实验方法如下：
[0227]
第一步，模型鼠进行16h的禁食。
[0228]
第二步，配制100mg/ml的葡萄糖溶液。
[0229]
第三步，测量小鼠的0点血糖，并按照1g/kg的葡萄糖剂量进行腹腔注射。然后，依次测量小鼠在30，60，90，120min的血糖值。
[0230]
实验结果(见图16)显示相比于对照组，治疗组的高血糖症得到了良好的改善和控制，即说明非天然氨基酸所调控表达的胰岛素在1型糖尿病治疗上有显著的效果。
[0231]
实施例16：在1型糖尿病的治疗过程中，非天然氨基酸诱导胰岛素表达系统调控胰岛素的表达速率研究。
[0232]
第一步，准备细胞(具体步骤同实施例11)。
[0233]
第二步，微胶囊制备(具体步骤同实施例11)。
[0234]
第三步，微胶囊体内移植(具体步骤同实施例11)。
[0235]
第四步，检测小鼠初始血糖。切开小鼠尾巴根部，是血糖仪(拜尔contour plus)检
测小鼠血糖。
[0236]
第五步，给药。对照组小鼠灌胃0mg/kg的生理盐水，实验组灌胃含有200mg/kg的非天然氨基酸的生理盐水。记为0分钟。
[0237]
第五步，检测小鼠血糖。切开小鼠尾巴根部，是血糖仪(拜尔contour plus)检测小鼠血糖。给药后，在第30，60，90，120，150，180分钟检测血糖。
[0238]
实验结果(见图17)显示在1型糖尿病鼠中，非天然氨基酸能快速调控胰岛素的表达，并且能够改善小鼠高血糖症状。
[0239]
实施例17：制作非天然氨基酸“饼干”。
[0240]
第一步，将普通小鼠饲料碾碎，称为粉末状。
[0241]
第二步，取6ml omey溶液(400mg/ml)，加入24g普通饲料粉末。
[0242]
第三步，搅拌混匀后，通过模具压制成型。室温晾干，制成非天然氨基酸“饼干”(相当于每克饼干含有100mgomey)
[0243]
实施例18：在1型糖尿病的治疗过程中，非天然氨基酸诱导胰岛素表达系统调控胰岛素表达的长期研究。
[0244]
第一步，准备细胞(具体步骤同实施例11)。
[0245]
第二步，微胶囊制备(具体步骤同实施例11)。
[0246]
第三步，微胶囊体内移植(具体步骤同实施例11)。
[0247]
第四步，给药。对照组小鼠灌胃0mg/kg/d的生理盐水，每天注射3次；灌胃实验组灌胃含有200mg/kg/d的非天然氨基酸的生理盐水。每天注射3次；非天然氨基酸“饼干”组使用非天然氨基酸“饼干”替代小鼠普通饲料喂食。
[0248]
第五步，检测小鼠空腹血糖(具体步骤同实施例14)。
[0249]
第六步，检测小鼠体内胰岛素的表达量(具体步骤同实施例14)。
[0250]
实验结果(见图18，图19)显示在1型糖尿病鼠中，非天然氨基酸灌胃给药和非天然氨基酸“饼干”喂食都能长期调控胰岛素的表达，并且能够改善小鼠高血糖症状。
[0251]
实施例19：非天然氨基酸诱导胰岛素表达系统在1型糖尿病的治疗过程中糖耐受研究。
[0252]
本实例是在1型糖尿病模型鼠进行实例17的治疗后展开的，其糖耐受的具体实验方法如下：
[0253]
第一步，模型鼠进行16h的禁食。
[0254]
第二步，配制100mg/ml的葡萄糖溶液。
[0255]
第三步，测量小鼠的血糖(具体步骤同实施例15)。
[0256]
实验结果(见图20)显示相比于对照组，非天然氨基酸灌胃给药和非天然氨基酸“饼干”喂食组的高血糖症得到了良好的改善和控制，即说明非天然氨基酸所调控表达的胰岛素在1型糖尿病治疗上有显著的效果。
[0257]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。