一种阿加曲班21（R）和21（S）非对映异构体的分离方法与流程

一种阿加曲班21（r）和21（s）非对映异构体的分离方法
技术领域
1.本发明属于化学分析领域，具体涉及一种阿加曲班21（r）和21（s）非对映异构体的分离方法。


背景技术：

2.阿加曲班（argatroban）是(2r,4r)-4-甲基-1-[n2-((r,s)-3-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉磺酰基)-l-精氨酰基]-2-哌啶羧酸一水合物的通用名称；相应的英文名为:rgatroban(hydrate);argatroban(2r,4r)-1-[(2s)-5-[(aminoiminomethyl)amino]-1-oxo-2-[[(1,2,3,4-tetrahydro-3-methyl-8-quinolinyl)sulfonyl]amino]pentyl]-4-methyl-2-piperidinecarboxylic acid，分子式为：c
23h36
n6o5s
•
h2o，相对分子量为：526.66，化学文摘号为：74863-84-6；其化学成分是21(r)和21(s)阿加曲班的混合物，通常两者的比例约为64∶36，其结构式为：阿加曲班是由日本三菱(mitsubishi)化学研究所最早研制合成的抗血栓药，于1990年在日本上市，2001年在韩国上市。首先被应用于临床治疗周围动脉闭塞性疾病，然后开始将其用于治疗急性脑血栓形成，以及心肌梗死溶栓的辅助治疗，并用于在抗凝血酶(at)缺乏患者进行血透时的抗凝处理。
[0003]
2000年，fda批准了史克必成(smithkline beecham)和得克萨斯生物技术公司(texas bitechnology)的可注射抗血栓小分子药物阿加曲班(argatroban，novastan)，应用于治疗和预防血栓形成及肝素诱导的免疫性疾病-血小板减少症(hit)，以及用于对需要进行经皮冠脉介入术(pci)病人的治疗。2003年3月5日在美国中风学会第28届国际中风大会上公布的多中心二期临床试验结果表明，阿加曲班在急性缺血性中风治疗中的疗效显著、安全性高。
[0004]
阿加曲班晶型研究现状：阿加曲班是l-精氨酸的衍生物，其只与凝血酶活性位点相互作用，是凝血酶的竞争性抑制剂。现报导的argatroban(阿加曲班)合成路线都是以硝基-l-精氨酸为起始原料、以哌啶羧酸酯或喹啉磺酰氯缩合先后次序不同，构成两条主要路线。当首先与哌啶羧酸酯缩合时，称氨基保护法；硝基-l-精氨酸的氨基用t-boc保护、再与哌啶羧酸酯缩合、去boc保护基、与喹啉磺酰氯缩合、酯水解、氢化去硝基得阿加曲班。若首
先与喹啉 磺酰氯缩合时称非保护法：硝基精氨酸与喹啉磺酰氯缩合后再与哌啶羧酸酯缩合、酯水解、氢化去硝基，得目标产物。实验证明不论采取哪条路线，其产物阿加曲班均是21(r) 和21(s)的混合物，比例约为r：s＝64∶36。21(r)和21(s)物化性质极为接近，这两种异构体都具有生物活性，但21(s)阿加曲班的效力是21(r)阿加曲班的两倍，在21(s)阿加曲班在水中的溶解度大约是21(r)阿加曲班的五倍。21(r)和21(s)物化性质极为接近，彻底分离难度很大，现已报导衍生后制备色谱分离，柱层析法和proteina亲和层析法，这些方法分离量小、收率低，尚达不到实用级水平。
[0005]
近年来，世界各国卫生组织对药物成分的要求和规定越来越严格，除了规定各种杂质的总含量和单一杂质的最高含量之外，如果活性药物成分呈现一个或多个立体中心，需对药物成分中允许的异构体或光学异构体逐一进行分离鉴定，并严格控制其含量。消旋体药物是光学异构体的混合物，从降低治疗用量和减少对人体不良反应的角度，高活性单一成分光学活体作为药物代替消旋体是一个发展趋势。
[0006]
最接近方案说明： wo 1249062009公布了一种制备阿加曲班21(r) 和21(s)的混合物的无水、一水和2-丙醇溶剂化的方法；cn101914133a公布了一种21(s)阿加曲班的定向合成方法，该法过程相对复杂、成本高且收率低； cn1951936a公布了一种以21(r)：21(s)=65:35为起始原料，通过在20%甲醇水溶液中结晶，制备了纯度为98.1%的21s-阿加曲班。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的：阿加曲班两个非对映异构体21(s)和21(r)的分离工作吸引了众多研究者。由于二者物化性质极为相似，因此分离难度很大。本发明提供了一种以阿加曲班均是21(r) 和21(s)非对映体比例为52：48 21r/21s阿加曲班非对映体混合物为起始原料，采用重结晶法分离21(s)和21(r)阿加曲班的方法，通过结晶法对阿加曲班两个非对映异构体21(s)和21(r)实行分离。该分离方法显著简化了操作过程，提高了析出固体的结晶度，该方法所获得的阿加曲班两个非对映异构体21(s)和21(r)具有较为理想的收率和纯度，而且通过该方法，首次获得了阿加曲班两个非对映异构体21(s)和21(r)的单晶体，确定了阿加曲班两个非对映异构体21(s)和21(r)的晶胞参数、空间群、分子的三维空间结构以及分子在空间通过氢键相互作用的情况。
[0008]
为实现上述发明目的，本发明一种阿加曲班21（r）和21（s）非对映异构体的分离方法，具体实施方案为：本发明所述一种阿加曲班21（r）和21（s）非对映异构体的分离方法，该分离方法以21(s)与21(r)的阿加曲班非对映体混合物为原料，初始原料阿加曲班21(r)与21(s)的比例是：21(r)∶21(s)＝52∶48。
[0009]
本发明所述一种阿加曲班21（r）和21（s）非对映异构体的分离方法， 21(r)-非对映异构体制备的起始原料为96.8/3.2 dr阿加曲班；21（s）-非对映异构体制备的起始原料为41.8/58.2 dr阿加曲班。
[0010]
本发明所述一种阿加曲班21（r）和21（s）非对映异构体的分离方法，该方法原料和
溶剂的比为1:80w/v-90w/v。
[0011]
本发明所述一种阿加曲班21（r）和21（s）非对映异构体的分离方法，所述溶剂为醇和水。
[0012]
本发明所述一种阿加曲班21（r）和21（s）非对映异构体的分离方法，所述溶剂醇和水的重量(体积)比例：6∶4～6。
[0013]
本发明所述所述一种阿加曲班21（r）和21（s）非对映异构体的分离方法，所述溶剂醇为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或多种组合。
[0014]
本发明所述一种阿加曲班21（r）和21（s）非对映异构体的分离方法，所述溶剂醇和水的重量(体积)比例： 6:4。
[0015]
本发明所述一种阿加曲班21（r）和21（s）非对映异构体的分离方法，所述溶剂醇为甲醇。
[0016]
（一） 本发明阿加曲班均非对映体比例，由hplc系统由安捷伦（palo alto，ca）1100系列液相色谱组成，配备自动进样器、dad检测器和安装在pc上用于数据收集和处理的chemostation软件。使用zorbax sb-c18（安捷伦）柱（100 x4.6 mm，1.8μm）。柱温：60℃。流动相：a：醋酸铵缓冲溶液，ph值5.5；乙腈/甲醇1:1。洗脱梯度从a/b 70/30（35分钟）到55/45（50分钟）。流速：1.2ml/min，紫外检测波长260 nm。在perkin-elmer仪器上记录旋光值，在589 nm和25
°
c下。dsc（差示扫描量热法）在perkin elmer仪器（mod。dsc7），加热速率为5.00
°
c/min，从50
°
c到250
°
c。
[0017]
（二） 原料路线确定的原则和依据。 首先采用氨基保护法，即：硝基-l-精氨酸的氨基用t-boc保护、再与哌啶羧酸酯缩合、去boc保护基、与喹啉磺酰氯缩合、酯水解、氢化去硝基得阿加曲班粗品，粗品用（丙酮：水=1:1）进行重结晶，得到非对映体比例(dr)为21r/21s=52/48的阿加曲班非对映体混合物，作为起始原料，该方法重结晶得到的非对映体比例(dr)为21r/21s=52/48的阿加曲班非对映体混合物非对映体比例稳定。
[0018]
（三） 工艺技术方案的比较和选择理由本发明采用非对映体比例(dr)为21r/21s=52/48的阿加曲班非对映体混合物，通过优化水/甲醇的比例，采用重结晶法分离21(s)和21(r)阿加曲班的方法，通过结晶法对阿加曲班两个非对映异构体21(s)和21(r)实行分离。该分离方法显著简化了操作过程，提高了析出固体的结晶度，该方法所获得的阿加曲班两个非对映异构体21(s)和21(r)具有较为理想的收率和纯度，而且通过该方法，首次获得了阿加曲班两个非对映异构体21(s)和21(r)的单晶体，确定了阿加曲班两个非对映异构体21(s)和21(r)的晶胞参数、空间群、分子的三维空间结构以及分子在空间通过氢键相互作用的情况。
[0019]
附图说明：图1：21(r)阿加曲班视图，显示了相对任意的原子编号方案（椭球体的概率为30%，h原子为任意半径的球体）；图2：21(s)阿加曲班视图，显示了相对相对的任意原子编号方案（20%概率下的热椭球），存在于不对称单元中的四个水氧基中的三个（o7，o8，o9）在两个位置上同样无序。
具体实施方式
[0020]
下面实施例只为进一步说明本发明，不以任何形式限制本发明范围。
[0021]
实施例1将21r/s-阿加曲班（52/48 dr，78 g）溶解于71℃下6:4（470 ml）的甲醇/水混溶液中。缓慢冷却溶液至室温（12h）。将反应体系上层清液抽吸后得到白色沉淀物，然后用甲醇/水6:4（18 ml）和水（3 x 18 ml）分别洗涤。得到沉淀（i）（41.8/58.2 dr，59.04 g），沉淀（i）是制备21s双对映异构体的起始物料。母液在减压下蒸发，得到回收的残留物（ii），残留物（ii）是制备21r非对映异构体的起始材料（96.8/3.2 dr，14.5 g）。
[0022]
实施例221r-非对映异构体的制备。将固体ii（6.74 g）溶解于甲醇/水6:4（40.8ml）中，控制温度为72℃。将溶液缓慢冷却至室温（5小时）。将反应体系上层清液抽吸后得到白色沉淀物，用甲醇/水6:4（3.3 ml）和水（9.6 ml）分别洗涤，并显示96.9/3.1 dr（3.99 g，71%）[αd] 25
140.9（甲醇中的浓度为0.8mg/ml）。dsc测定显示化合物在164.04
°
c有吸热峰。hplc谱图保留时间为：26.87分钟。母液减压蒸发得到残余物（1.58 g，19%），显示96.3/3.7 dr。
[0023]
实施例321s-非对映异构体的制备。将固体沉淀i（37.5g，41.8/58.2 dr）由甲醇/水6:4（2.4 l）结晶一次。每次将溶液缓慢冷却至室温（24小时）后，将反应体系上层清液抽吸后得到白色沉淀物并用水冲洗。固体（16.3 g，24.7/75.3 dr）从甲醇/水6:4（阿加曲班/溶剂1:80w/v）再次结晶二次。得到21s-阿加曲班（1.44g，总收率4.8%）的最终样品显示0.5/99.5dr。[αd]
25
221.3（甲醇中的浓度为0.8mg/ml）。dsc测定显示化合物在223.25℃有吸热峰。hplc谱图保留时间为： 27.44分钟。
[0024]
对比例1按照对比文件3将7克阿加曲班(r∶s＝52∶48)，加入210ml85％的甲醇水溶液中，加热回流6小时至透明，冷却到室温，静置5小时，析出白色晶体，过滤、80℃下干燥， 重量3.2克，21(s)含量49.5％(hplc法)。
[0025]
对比例2将7克阿加曲班(r∶s＝52∶48)由甲醇/水6:4（448ml）结晶一次，21(s)含量90.5％(hplc法)。每次将溶液缓慢冷却至室温（24小时）后，将反应体系上层清液抽吸后得到白色沉淀物并用水冲洗。固体（2g，24.7/75.3 dr）从甲醇/水6:4（阿加曲班/溶剂1:80w/v）再次结晶二次。得到21s-阿加曲班（0.36g，总收率5.2%）的最终样品显示0.5/99.5dr。
[0026]
试验例：结构确证：所有nmr实验均在bruker avance iii 500型超导高分辨核磁共振谱仪上完成。1h-nmr观测频率为500.13mhz ，
13
c-nmr观测频率为125.75 mhz，使用5 mm pabbo bb-1h/d z-grd探头，取约30 mg阿加曲班样品，以dmso-d6为溶剂(tms为内标)测定1h-nmr ，1h-nmr(dmso-d6 d2o)，
13
c-nmr(包括常温、高温60℃、高温120℃的图谱)、1h-1
h cosy, dept, hsqc,hmbc及关键中间体的常温
13
c-nmr。其中1h-nmr的谱宽为15 khz，采样点数为65 536弛豫延迟时间为1 s; 13
c-nmr的谱宽为38 khz采样点数为65536，弛豫延迟时间为1.5 s。
[0027]
晶体测定：晶体结构测定选用尺寸为0.20mm
×
0.25mm
×
0.35mm的单晶,在cad4pdp11/44型四圆单晶衍射仪上,用mokα射线,石墨单色器,以25个衍射点精确测定取向矩阵和晶胞参数,用θ/2θ方式扫描,在2
°
《θ《25
°
范围内共收集独立衍射1705个,其中i》3.0σ
(i)者为1509个用于结构测定和修正,数据经lp校正,但未经吸收校正,所得晶体属单斜晶系,空间群p21/c。
[0028]
表1
ꢀꢀ
21r和21s阿加曲班的1h和
13
c数据
表2 21r和21s阿加曲班的重要构象的相对能量（kcal/mol）、重要扭转角（
°
）和环折叠坐标bq（
å
）、φ2（
°
）、θ（
°
）
a.
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。