一种抗肿瘤多肽的制备方法及应用与流程

1.本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，特别涉及一种抗肿瘤多肽的制备方法及应用。


背景技术：

2.分子靶向药物已成为抗癌药物研究的热点和发展方向，在多种肿瘤治疗中取得可喜进展，并相继投入临床使用。然而，我国高发癌症类型中胰腺癌、胃癌和胆管癌靶向药物研发相对滞后。根据我国国家癌症中心发布的最新数据，胰腺癌的发病率已达第10位，死亡率升高到第6位；胃癌的发病率高居第2位。胰腺癌早期症状不明显，大部分患者就诊时已出现局部侵袭甚至远处转移，缺乏有效的分子靶向药物，预后极差。我国自主研发的治疗晚期胃癌分子靶向药物“甲磺酸阿帕替尼片”仅能延长患者2个多月的生存期。胆管癌占消化道肿瘤的3％，近年来发病率逐年升高；因其发病隐匿、早期转移、手术切除率低、术后复发率高等特点，预后极差，目前标准治疗方案联合吉西他滨和顺铂效果并不理想。因此，迫切需要研究针对这些癌症的新分子靶点并探索新的有效药物。
3.人神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1,nrp-1)是一种由923个氨基酸组成的非络氨酸激酶跨膜糖蛋白，在脊柱动物中结构高度保守，包含由5个模块化结构域组成的胞外区，连接至一个跨膜螺旋区和一个细胞浆结构域。nrp-1的膜近端 c结构域属于mam的家族结构域牵连蛋白同源二聚体。跨膜螺旋区介导nrp-1二聚体连接胞外区至细胞内区。x-线晶体结构显示分离的nrp-1b1结构域或串联 nrp-1结构域间有多种组合，并且与抗-nrp-1fab片段复合体的c末端尾区相互作用。这种配体-受体相互作用的模型衍生来自nrp-1串联b1b2结构域和促吞噬肽间复合体晶体结构，后者是一个igg重链fc片段蛋白水解产生免疫活性四肽。这些结构特征为靶向nrp-1研发抗癌药物提供了分子基础，尤其是根据其分子结构和氨基酸序列设计多肽药物阻断nrp-1与配体结合进而抑制细胞信号通路进而提高抗癌药物的疗效是靶向nrp-1的研究热点。
4.临床研究证明胰腺癌组织高表达nrp-1，其表达水平与胰腺癌的临床分期、淋巴结浸润、远处器官转移、和病理分期呈正相关关系；而且高表达nrp-1的胰腺癌患者预后较差。我们最新的研究结果发现，与正常胃粘膜组织相比较，胃癌组织和细胞高表达nrp-1；nrp-1通过与多种信号通路共受体，参与胃癌细胞的生长和转移。nrp-1作为共受体调控关键细胞信号通路和胆管癌细胞的生长及转移。这些研究为研发针对nrp-1分子靶点治疗胰腺癌、胃癌和胆管癌提供了可靠的依据。
5.多肽是一类具有多种生物学活性的肽类化合物，存在于动、植物和微生物体内，能够调节机体各个系统器官和细胞的功能，其作用涉及机体的免疫系统、内分泌系统、神经系统以及细胞的增殖分化等过程。一些小分子活性肽凭借其分子量小、靶向性好、低毒性以及易于穿透细胞膜等特点已成为抗肿瘤药物研制关注的热点。近年来研究发现，一些植物活性肽能够通过阻断肿瘤细胞dna 的复制，诱导肿瘤细胞凋亡，从而对癌细胞的增殖和转移具有抑制作用，曾晓波等研究发现，菜籽蛋白经酶解产生的多肽对s180肉瘤细胞的增殖具
有抑制作用，其抑制作用一方面是由于菜籽肽对肿瘤细胞膜产生影响，从而阻断了肿瘤细胞的转移；另一方面可能是由于菜籽蛋白增强了机体的免疫力所致。
6.nrp-1高表达于内皮细胞，参与调控内皮细胞的生长和迁移。在所有的实体肿瘤中，内皮细胞是细胞间质中形成新生血管和淋巴管的关键细胞，决定了肿瘤生长和转移。因此，靶向nrp-1研发的药物适用于所有的实体肿瘤，具有广泛的临床应用价值。


技术实现要素：

7.一方面，本发明提供一种抗肿瘤多肽的制备方法及应用，解决现有技术中存在的问题。
8.为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：
9.一种抗肿瘤多肽的制备方法，包括以下步骤：
10.s1：收集成熟的杭白芷，去除杂质，低温压榨脱油后将杭白芷捣碎，并用粉碎机粉碎后过40目筛子，得脱脂杭白芷粉末，用蒸馏水将脱脂杭白芷粉末浸泡溶胀，调节料液比和ph值，在超声波作用下使脱脂杭白芷粉末中的蛋白质充分溶解，离心收集沉淀，经冷冻干燥后得杭白芷分离蛋白；
11.s2：取金藿斛粉末，用液氮研磨后加入pbs浸泡12-36h，用纱布过滤掉残渣得到金藿斛的pbs提取液；在pbs提取液中加入硫酸铵过夜，离心后除去上清液，得到蛋白浸膏，用pbs溶解蛋白浸膏后装入透析袋，透析一定时间，然后冻干得到金藿斛蛋白质粉末；
12.s3：取杭白芷分离蛋白和金藿斛蛋白质粉末,蒸馏水配成蛋白液，分别加入碱性蛋白酶alcalase、碱性蛋白酶37017和胰蛋白酶进行水解，水解后，灭酶、冷却至室温、离心取上清液，可得三种酶解液；
13.s4：用装有截留分子量为3kda超滤膜的amiconultra-15离心超滤管对三种酶解液产物进行分离，离心分离后，收集超滤液；
14.s5：采用biotage快速制备液相色谱全自动纯化系统对超滤液分离纯化，色谱柱为sephadexg-15，洗脱液为0.1mol/l的nacl，流速1ml/min，检测波长280nm，三种酶解产物经sephedax g-25色谱柱层析后共得到9个多肽组分，即得抗肿瘤多肽。
15.在一些实施例中的优选方案，所述s1中离心转速为5000-10000r/min。
16.在一些实施例中的优选方案，所述s2中透析袋的截留分子量范围为 5000-10000，透析时间为2-4天。
17.在一些实施例中的优选方案，所述s3中的水解过程中实时用0.05-0.5 mol/l的naoh和hcl来调节反应体系的ph值，控制ph值在ph
±
0.05之内。
18.在一些实施例中的优选方案，所述碱性蛋白酶alcalase 2.4l的酶解条件为：底物质量浓度30g/l，ph9.5，酶解温度60℃。
19.在一些实施例中的优选方案，所述胰蛋白酶的酶解条件为：温度25-55℃， ph＝6-10，反应时间为6-12h。
20.在一些实施例中的优选方案，所述碱性蛋白酶37017的酶解条件为：酶温度20-65℃，ph＝7-10，反应时间为6-13h。
21.在一些实施例中的优选方案，所述s3中的灭酶为在90-100℃的水浴中灭酶10-30min；所述s3中的离心为5000-10000r/min下离心5-30min。
22.在一些实施例中的优选方案，所述s4中离心转速为8000rpm，离心时间 25min。
23.另一方面，本发明还提供了上述抗肿瘤多肽在抗肝癌药物中的应用，用于抑制人肝癌细胞hepg2的增殖。
24.本发明的表明对人肝癌细胞hepg2的增殖具有较强的抑制作用，当浓度达到150μg/ml时，其抑制率达到了92％以上，基本接近抗癌药紫杉醇的抑制效果。本发明所涉及的抗肿瘤多肽来源于天然植物杭白芷和金藿斛，对人体无毒无副作用，因此可作为抗癌药物做临床应用研究。
附图说明
25.图1为本实施例的抗肿瘤多肽的制备的流程图。
具体实施方式
26.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
27.参阅图1，一种抗肿瘤多肽的制备方法，具体包括以下步骤：
28.s1：收集成熟的杭白芷，去除杂质，低温压榨脱油后将杭白芷捣碎，并用粉碎机粉碎后过40目筛子，得脱脂杭白芷粉末，用蒸馏水将脱脂杭白芷粉末浸泡溶胀，调节料液比和ph值，在超声波作用下使脱脂杭白芷粉末中的蛋白质充分溶解，在离心转速为5000-10000r/min离心后收集沉淀，经冷冻干燥后得杭白芷分离蛋白；根入药，能祛风，散湿，排脓，生肌止痛；主治风寒感冒，前额头痛，鼻窦炎，牙痛，痔漏、便血、白带、痈疖肿毒、烧伤等症。
29.s2：取金藿斛粉末，用液氮研磨后加入pbs浸泡12-36h，用纱布过滤掉残渣得到金藿斛的pbs提取液；在pbs提取液中加入硫酸铵过夜，离心后除去上清液，得到蛋白浸膏，用pbs溶解蛋白浸膏后装入截留分子量范围5000-10000 的透析袋，透析三天，然后冻干得到金藿斛蛋白质粉末；热病伤津，虚热不退，胃阴不足，口干咽燥、脘痛干呕、肺燥咳嗽，腰膝酸软，阴伤目暗。本品性味：甘、微寒，甘凉清润，主入胃肾，作用重在中下二焦，既清胃热生津止渴，又滋肾阴退热明目，为津伤口渴、阴虚目暗良药。
30.s3：取杭白芷分离蛋白和金藿斛蛋白质粉末,蒸馏水配成蛋白液，分别加入碱性蛋白酶alcalase、碱性蛋白酶37017和胰蛋白酶进行水解，碱性蛋白酶 alcalase 2.4l的酶解条件为：底物质量浓度30g/l，ph9.5，酶解温度60℃；胰蛋白酶的酶解条件为：温度25-55℃，ph＝6-10，反应时间为6-12h；碱性蛋白酶37017的酶解条件为：酶温度20-65℃，ph＝7-10，反应时间为6-13h；该过程中实时用0.05-0.5mol/l的naoh和hcl来调节反应体系的ph值，控制 ph值在ph
±
0.05之内，水解后，在90-100℃的水浴中灭酶10-30min，冷却到室温后在5000-10000r/min下离心5-30min后取上清液，得到三种酶解液；
31.s4：用装有截留分子量为3kda超滤膜的amiconultra-15离心超滤管对三种酶解液产物进行分离，离心机转速为8000rpm，离心时间25min，收集超滤液；
32.s5：采用biotage快速制备液相色谱全自动纯化系统对超滤液分离纯化，色谱柱为sephadexg-15，洗脱液为0.1mol/l的nacl，流速1ml/min，检测波长 280nm，三种酶解产物经
sephedax g-25色谱柱层析后共得到9个多肽组分，即得抗肿瘤多肽。
33.所述抗肿瘤多肽在抗肝癌药物中的应用，用于抑制人肝癌细胞hepg2的增殖。
34.本发明的表明对人肝癌细胞hepg2的增殖具有较强的抑制作用，当浓度达到150μg/ml时，其抑制率达到了92％以上，基本接近抗癌药紫杉醇的抑制效果。本发明所涉及的抗肿瘤多肽来源于天然植物杭白芷和金藿斛，对人体无毒无副作用，因此可作为抗癌药物做临床应用研究。
35.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。