一种甘蔗内生真菌提取物及其在制备甘蔗病原菌治疗剂中的应用

1.本发明涉及天然产物技术领域，具体涉及一种甘蔗内生真菌提取物及其在制备甘蔗病原菌治疗剂中的应用。


背景技术：

2.甘蔗是我国乃至世界重要的糖料作物和理想的能源植物，甘蔗产业的稳定发展对蔗农增收和国家能源安全保障具有重要意义。然而，在甘蔗生长过程中会遭遇甘蔗黑穗病、白条病、花叶病、宿根艾华病和稍腐病等病害的侵染，不仅甘蔗品质和产量受到严重影响，还缩短宿根年限，甚至造成品种种性退化，甘蔗病害已成为制约我国甘蔗生产的一个重要因素。因此，有效防止甘蔗病原菌的危害是一个极为重要的工作，在生产实践中具有重要的意义。
3.传统甘蔗病原菌防治技术存在成本高、有效期短、目标针对性差，可能会对环境产生危害等问题，开发新型无公害防治技术具有重要的理论和现实意义。借助分布广泛、资源量大的内生真菌开发相关防止技术，不仅是一种新的尝试，而且原料来源充足，技术路线可行，具备在生产实践中应用的基础。
4.内生真菌最早由de bary于1984年提出，最初用来定义生长在植物组织中的任何有机体。近年来，内生菌被定义为一类寄生在植物活体内部组织中且不对寄生植物造成任何直接的、明显的负面影响的微生物。内生真菌与其寄生植物之间的关系可能从潜在的植物病原发生到互惠共生。全球近30万种植物是各种内生真菌的宿主。此外，内生微生物群落的分布与宿主分布不同，因此造就了巨大的生物多样性。而且作为一个稍微开放的特殊生物资源库，内生真菌已被证明是结构新颖、具有生物活性的次生代谢产物的优秀生产者，入生物碱，吡啶类药物，多酚，多肽，吲哚和异香豆素衍生物，然而，对于甘蔗内生真菌发酵提取物是否含有抗甘蔗病原菌的有效成分以及能否将其应用于甘蔗病原菌防治领域等方面的内容，目前未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种甘蔗内生真菌提取物及其在制备甘蔗病原菌治疗剂中的应用。所述的甘蔗内生真菌提取物能有效防治甘蔗黑穗病菌、甘蔗白条病菌或水稻稻瘟菌，具有良好的应用前景。
6.本发明的第一个目的是提供一种甘蔗内生真菌提取物，所述的甘蔗内生真菌提取物是从甘蔗内生真菌fusarium proliferatum 15的发酵液中提取获得。
7.优选的，所述的甘蔗内生真菌提取物的制备步骤为：
8.(1)将甘蔗内生真菌fusarium proliferatum 15进行发酵，收集其发酵液；
9.(2)发酵液用甲醇浸泡，减压浓缩，水相再用乙酸乙酯和正丁醇分别萃取，将萃取有机相减压浓缩得到总浸膏；
10.(3)将总浸膏用色谱柱分离，采用洗脱剂乙酸乙酯/石油醚按0～15:15～0体积比进行梯度洗脱，合并乙酸乙酯/石油醚按30:70、40:60、50:50、60:40、70:30体积比洗脱得到的组分,再用葡聚糖凝胶sephadex lh-20色谱柱以meoh/ch2cl2按1:1体积比进行洗脱，除去色素，收集洗脱液，经浓缩干燥，即得到甘蔗内生真菌提取物。
11.本发明的第二个目的是提供所述的甘蔗内生真菌提取物在制备甘蔗病原菌或水稻稻瘟菌的生物防治剂中的应用。
12.优选的，所述的甘蔗病原菌为甘蔗黑穗病菌或甘蔗白条病菌。
13.优选的，所述的甘蔗内生真菌提取物用于防治甘蔗病原菌或水稻稻瘟菌的浓度为1mg/ml。
14.本发明的第三个目的是提供一种生物防治剂，其包含有效量的作为活性成分的甘蔗内生真菌提取物。
15.优选的，所述的生物防治剂还包含药学上可接受的辅料。
16.本发明的第四个目的是提供所述的生物防治剂在防治甘蔗病原菌或水稻稻瘟菌中的应用。
17.优选的，所述的甘蔗病原菌为甘蔗黑穗病菌或甘蔗白条病菌。
18.本发明提供了一种甘蔗内生真菌提取物，该甘蔗内生真菌提取物是从甘蔗内生真菌fusarium proliferatum 15的发酵液中提取获得。本发明研究发现，该甘蔗内生真菌提取物对甘蔗黑穗病菌、甘蔗白条病菌、水稻稻瘟菌的mic抑菌浓度分别为31.2500μg/ml、7.8125μg/ml、15.6250μg/ml，具有良好的抑菌活性，可应用于防治甘蔗黑穗病菌、甘蔗白条病菌或水稻稻瘟菌，具有很好的应用前景。
19.本发明的甘蔗内生真菌fusarium proliferatum 15，于2021年11月10日保藏于保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，保藏编号为：gdmcc no:62048。该菌株公开于专利申请号：cn202111601324.7，发明名称：一株甘蔗内生真菌及其在生产多酚和抑菌方面的应用。
具体实施方式
20.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
21.实施例1：甘蔗内生真菌提取物的制备
22.(1)将甘蔗内生真菌fusarium proliferatum 15进行活化，从-80℃取甘油菌，吸取100μl菌液移入到含50ml pdb培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)的250ml三角锥形瓶中，在25℃，150rpm条件下培养3d，按体积分数1％接种量转接到含500ml pdb培养基的1000ml三角锥形瓶中，在25℃，150rpm条件下培养10d，得到发酵混合物。
23.(2)将发酵混合物于10000rpm，4℃下离心20min，收集发酵液；发酵液用甲醇浸泡3次，减压浓缩，水相再用乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次，将萃取有机相在55℃下减压浓缩得到总浸膏；
24.(3)将总浸膏用色谱柱分离，采用洗脱剂乙酸乙酯/石油醚按0～15:15～0体积比进行梯度洗脱，得到30个组分；
25.(4)合并乙酸乙酯/石油醚按30:70、40:60、50:50、60:40、70:30体积比洗脱得到的组分,再用葡聚糖凝胶sephadex lh-20色谱柱以meoh/ch2cl2按1:1体积比进行洗脱，除去色
素，收集洗脱液，经浓缩干燥，即得到甘蔗内生真菌提取物。
26.实施例2：甘蔗内生真菌提取物对甘蔗黑穗病菌的抑制活性检测
27.采用微量液体稀释法测试甘蔗内生真菌提取物对甘蔗黑穗病菌，即甘蔗鞭黑粉菌(sporisorium scitanmineum)的抑制情况。
28.甘蔗内生真菌提取物(工作液)的制备：将实施例1制得的甘蔗内生真菌提取物采用无菌去离子水进行稀释，制成浓度为1mg/ml的工作液；
29.培养基为pdb培养基；
30.待测试甘蔗黑穗病菌菌液的制备：将甘蔗鞭黑粉菌菌液储备液进行稀释，制成浓度为1
×
103～5
×
103个/ml的工作液。
31.甘蔗内生真菌提取物/药敏板的制备：在96孔u型板每个孔中加入pdb培养基100μl；在a/b/c三排的第一孔加配好的甘蔗内生真菌提取物药液100μl，然后对药物进行二倍稀释。即第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打(至少3次以上)使药物与肉汤充分混匀，然后吸取100μl加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后一孔，第12孔吸出100μl扔掉；再在每一孔中加入稀释好的菌液100μl，重复3次；在同一块板上的g排上做一排阴性对照(仅加空白pdb培养基不加菌液)和在h排上做一排阳性对照(加菌液不加甘蔗内生真菌提取物药液)；将96孔板放入28℃恒温培养箱培养24小时后，观察结果。
32.观察前，可在酶标仪器上轻轻震摇孔板，使终点判读更容易。结果判读以生长对照孔作为标准，将生长情况进行评分：
33.0：完全透明清澈；
34.1：轻度浑浊；
35.2：浊度较生长对照明显下降；
36.3：浊度较生长对照轻度下降；
37.4：浊度与生长对照一致。
38.从96孔u型板上可看出，受试菌株在a1-a5，b1-b5，c1-c5，d1-d5，e1-e5，f1-f5评分等级是1：轻度浑浊；a6-a12，b6-b12，c6-c12，d6-d12，e6-e12，f6-f12评分等级是0：完全透明清澈。g1-g12评分等级是0：完全透明清澈。h1-h12评分等级是4：浊度与生长对照一致。
39.甘蔗内生真菌提取物抑制甘蔗黑穗病菌的mic值见表1所示：
40.表1.甘蔗内生真菌提取物抑制甘蔗黑穗病菌的mic值(μg/ml)
41.受试菌株mic值(μg/ml)甘蔗黑穗病菌株31.2500
42.实施例3：甘蔗内生真菌提取物对甘蔗白条病菌的抑制活性检测
43.采用微量液体稀释法测试甘蔗内生真菌提取物对甘蔗白条病菌，即白条黄单胞杆菌(xanthomonas albilineans)的抑制情况。
44.甘蔗内生真菌提取物(工作液)的制备：将实施例1制得的甘蔗内生真菌提取物采用无菌去离子水进行稀释，制成浓度为1mg/ml的工作液；
45.培养基为pdb培养基；
46.待测试甘蔗白条病菌菌液的制备：将白条黄单胞杆菌菌液储备液进行稀释，制成浓度为1
×
103～5
×
103个/ml的工作液。
47.甘蔗内生真菌提取物/药敏板的制备：在96孔u型板每个孔中加入pdb培养基100μ
l；在a/b/c三排的第一孔加配好的甘蔗内生真菌提取物药液100μl，然后对药物进行二倍稀释。即第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打(至少3次以上)使药物与肉汤充分混匀，然后吸取100μl加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后一孔，第12孔吸出100μl扔掉；再在每一孔中加入稀释好的菌液100μl，重复3次；在同一块板上的g排上做一排阴性对照(仅加空白pdb培养基不加菌液)和在h排上做一排阳性对照(加菌液不加甘蔗内生真菌提取物药液)；将96孔板放入28℃恒温培养箱培养24小时后，观察结果。
48.观察前，可在酶标仪器上轻轻震摇孔板，使终点判读更容易。结果判读以生长对照孔作为标准，将生长情况进行评分：
49.0：完全透明清澈；
50.1：轻度浑浊；
51.2：浊度较生长对照明显下降；
52.3：浊度较生长对照轻度下降；
53.4：浊度与生长对照一致。
54.从96孔u型板上可看出，受试菌株在a1-a7，b1-b7，c1-c7，d1-d7，e1-e7，f1-f7评分等级是1：轻度浑浊；a8-a12，b8-b12，c8-c12，d8-d12，e8-e12，f8-f12评分等级是0：完全透明清澈。g1-g12评分等级是0：完全透明清澈。h1-h12评分等级是4：浊度与生长对照一致。
55.甘蔗内生真菌提取物抑制甘蔗白条病菌的mic值见表2所示：
56.表2.甘蔗内生真菌提取物抑制甘蔗白条病菌的mic值(μg/ml)
57.受试菌株mic值(μg/ml)甘蔗白条病菌株7.8125
58.实施例4：甘蔗内生真菌提取物对水稻稻瘟病菌的抑制活性检测
59.采用微量液体稀释法测试甘蔗内生真菌提取物对水稻稻瘟病菌(pyricularia oryzae)的抑制情况。
60.甘蔗内生真菌提取物(工作液)的制备：将实施例1制得的甘蔗内生真菌提取物采用无菌去离子水进行稀释，制成浓度为1mg/ml的工作液；
61.培养基为pdb培养基；
62.待测试水稻稻瘟病菌菌液的制备：将菌液储备液进行稀释，制成浓度为1
×
103～5
×
103个/ml的工作液。
63.甘蔗内生真菌提取物/药敏板的制备：在96孔u型板每个孔中加入pdb培养基100μl；在a/b/c三排的第一孔加配好的甘蔗内生真菌提取物药液100μl，然后对药物进行二倍稀释。即第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打(至少3次以上)使药物与肉汤充分混匀，然后吸取100μl加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后一孔，第12孔吸出100μl扔掉；再在每一孔中加入稀释好的菌液100μl，重复3次；在同一块板上的g排上做一排阴性对照(仅加空白pdb培养基不加菌液)和在h排上做一排阳性对照(加菌液不加甘蔗内生真菌提取物药液)；将96孔板放入28℃恒温培养箱培养24小时后，观察结果。
64.观察前，可在酶标仪器上轻轻震摇孔板，使终点判读更容易。结果判读以生长对照孔作为标准，将生长情况进行评分：
65.0：完全透明清澈；
66.1：轻度浑浊；
67.2：浊度较生长对照明显下降；
68.3：浊度较生长对照轻度下降；
69.4：浊度与生长对照一致。
70.从96孔u型板上可看出，受试菌株在a1-a6，b1-b6，c1-c6，d1-d6，e1-e6，f1-f6评分等级是1：轻度浑浊；a7-a12，b7-b12，c7-c12，d7-d12，e7-e12，f7-f12评分等级是0：完全透明清澈。g1-g12评分等级是0：完全透明清澈。h1-h12评分等级是4：浊度与生长对照一致。
71.甘蔗内生真菌提取物抑制水稻稻瘟病菌的mic值见表3所示：
72.表3.甘蔗内生真菌提取物抑制水稻稻瘟病菌的mic值(μg/ml)
73.受试菌株mic值(μg/ml)水稻稻瘟病菌株15.6250
74.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。