一种一次性成苗培养基及其应用

1.本发明涉及植物培植技术领域，具体地，涉及一种一次性成苗培养基及其应用。


背景技术：

2.血叶兰的学名为：ludisia discolor(ker-gaw1.)a.rich.，为兰科血叶兰属植物，全属4种，分布于印度、马来西亚和印度尼西亚，原产于我国海南岛。血叶兰外形漂亮，锦叶玉花，十分精美，具有极高的观赏价值，其根茎匍匐，茎节明显，如蚕卧于石上，又名叫“石蚕”或“石上藕”。血叶兰先端急尖或短尖，上表面黑绿色，具有5条金红色有光泽的脉，背面淡红色，着生方式等独特，是极具观赏价值的观叶类兰科植物之一。
3.此外，血叶兰也是民间传统的中草药，全草可入药，有滋阴润肺、清热凉血的功效，治疗肺结核咯血等症的疗效，具有极高的药用价值，血叶兰味甘、性凉，滋阴润肺、健脾、安神，主治肺痨咯血、食欲不振、神经衰弱等症，其药用功效在南方作为民间中草药被广为采用。
4.血叶兰用途广泛，但其种子微小且在野生状态下难以繁殖，远不能满足市场需求，再加上人为过度开采，导致濒临灭绝，被列为国家二级保护植物。
5.目前，现有的血叶兰种苗培植方法主要包括分株繁殖方法、扦插繁殖方法、组织培养方法(茎段、顶芽、未开裂的果实作为外植体)、人工授粉辅助的种子无菌繁殖方法等。其中，分株繁殖和扦插繁殖所需母体材料多，成活率低、繁殖速度慢，周期长，难以满足规模化种植需求；组织培养则是从选取茎段、顶芽、未开裂果实等作为外植体，经诱导产生类原始球茎、类原始球茎增殖、类原始球茎分化及壮苗、生根培养、炼苗等繁杂步骤，对设备和操作人员素养要求极高，移植无菌苗成活率低，且存在分化率不高、增殖倍数低、变异等风险，不利于血叶兰功效的保持和大范围推广；人工授粉辅助的种子无菌繁殖法要求提前采集血叶兰花粉和无菌操作，但实际情况是血叶兰花期短，提前采集花粉比较困难，花粉经储存后活力降低，后期的种子无菌发芽培养对设施设备要求高，增加了生根培养、炼苗培养等步骤，实际应用时成本高，且繁殖得苗率低。
6.因此，目前急需一种繁殖率高的血叶兰组培快速繁育方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种一次性成苗培养基及其应用。
8.本发明的第一目的是提供一种一次性成苗培养基。
9.本发明的第二目的是提供上述一次性成苗培养基在诱导血叶兰一次性成苗中的应用。
10.本发明的第三目的是提供一种诱导血叶兰一次性成苗的方法。
11.本发明的第四目的是提供上述方法在诱导血叶兰一次性成苗中的应用。
12.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
13.一种一次性成苗培养基，所述一次性成苗培养基包括ms培养基、1.0～1.25mg/l的6-ba、1.5～2.0mg/l的naa、100～200g/l的土豆泥、20～30g/l的蔗糖、6.5～7.5g/l的琼脂和1.0～1.5g/l的活性炭；所述一次性成苗培养基的ph为5.6～5.8。
14.优选地，所述一次性成苗培养基包括ms培养基、1.0mg/l的6-ba、1.5mg/l的naa、100g/l的土豆泥、25g/l的蔗糖、6.5g/l的琼脂和1.5g/l的活性炭。
15.更优选地，所述土豆泥的制备方法为：将土豆捣碎，即得。
16.本发明还请求保护上述任一所述的一次性成苗培养基在诱导血叶兰一次性成苗中的应用。
17.一种诱导血叶兰一次性成苗的方法，包括以下步骤：
18.s1.取血叶兰的茎段进行消毒，分割消毒后的茎段，使得每个茎段长2.5～3cm，并带1～2个节，得到处理好的茎段；
19.s2.将步骤s1得到的处理好的茎段接种到权利要求1所述的一次性成苗培养基中，放入培养室中培养至茎段长至7～10cm高，并长出4～5片叶子时，得到组培苗；
20.s3.将步骤s2得到的组培苗炼苗，使用杀菌剂浸泡，得到处理好的组培苗；
21.s4.将步骤s3得到的处理好的组培苗移植至培养土中培养。
22.优选地，步骤s1中所述消毒的具体步骤为：将去除叶片和根系后的血叶兰茎段用体积分数为10～20％的洗衣粉溶液冲洗3～5min，然后流水冲洗3～5遍，接着用体积分数为75～95％的酒精处理20～30s，然后用体积分数为0.01～0.03％的hgcl2处理5～7min，无菌水冲洗4～5次。
23.更优选地，所述酒精为体积分数为75％的酒精，所述hgcl2为体积分数为0.01％的hgcl2。
24.优选地，步骤s2中所述培养具体为：接种后第1周置于黑暗培养，第2～4周光照时间为6～8h/d，第2个月光照时间为8～10h/d，第3个月开始光照时间为10～12h/d；所述光照强度1500～2000lx。
25.更优选地，步骤s2中所述培养具体为：接种后第1周置于黑暗培养，第2～4周光照时间为8h/d，第2个月光照时间为10h/d，第3个月开始光照时间为12h/d。
26.优选地，步骤s3中所述炼苗时间为5～7天。
27.优选地，所述杀菌剂为多菌灵。
28.更优选地，所述多菌灵的浓度的体积分数为1～3％。
29.优选地，所述培养土为经过消毒剂消毒后的培养土。
30.更优选地，所述消毒剂为高锰酸钾。
31.优选地，步骤s4中所述培养土为泥炭土、珍珠岩和松树皮按照体积比＝2～3：1～2：1～3混合而成。
32.更优选地，所述培养土为泥炭土、珍珠岩和松树皮按照体积比＝3：1：1混合而成。
33.优选地，步骤s4中所述培养具体为：在25～28℃，光照强度为2800～3000lx，湿度为70～75％的环境下培养。
34.更优选地，所述光照强度为3000lx，湿度为75％。
35.本发明还请求保护上述任一所述的方法在诱导血叶兰一次性成苗中的应用。
36.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
37.本发明提供了一种一次性成苗培养基，所述一次性成苗培养基包括ms培养基、1.0～1.25mg/l的6-ba、1.5～2.0mg/l的naa、100～300g/l的土豆泥、20～30g/l的蔗糖、6.0～7.5g/l的琼脂和1.0～1.5g/l的活性炭；所述一次性成苗培养基的ph为5.6～5.8。利用本发明所述一次性成苗培养基，以血叶兰茎段作为外植体，诱导其进行一次性成苗，不仅解决了血叶兰自身繁殖能力差的问题，同时还解决了组培繁育苗培育周期长且生长弱小、成活率低等问题，对提高血叶兰组培产品品质和产品有重要的实践意义，在保证血叶兰产业化生产满足市场需求的同时，可以有效保护血叶兰野生种质资源。
具体实施方式
38.下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
39.实施例1一种诱导血叶兰一次性成苗的方法
40.1、实验方法
41.(1)材料选取和处理：选取健壮且无病害的血叶兰植株，将血叶兰植株在流水下冲洗干净，剪去血叶兰植株的叶片和根系，得到血叶兰无根茎段；将血叶兰无根茎段用体积分数为10～20％的洗衣粉溶液冲洗3min，然后用流水冲洗3遍，将血叶兰无根茎段放置于超净台上，用体积分数为75％的酒精处理血叶兰无根茎段1min，用体积分数0.01％的hgcl2消毒5min，接着用无菌水冲洗4遍，得到消毒后的血叶兰无根茎段。
42.将消毒后的血叶兰无根茎段放置于超净工作台上，并将其两端各切除0.3cm，接着切成2.5cm的茎段且保证每个茎段上均带1个节，得到处理好的茎段，共得到200段血叶兰茎段(m)。
43.(2)接种：将步骤(1)得到的处理好的茎段接种到经高压灭菌的一次性成苗培养基中，并将处理好的茎段有序平放至一次性成苗培养基中。
44.其中，一次性成苗培养基包括ms培养基、1.0mg/l的6-ba、1.5mg/l的naa、100g/l的土豆泥、25g/l的蔗糖、6.5g/l的琼脂和1.5g/l的活性炭；一次性成苗培养基的ph为5.6～5.8。
45.所述土豆泥的制备方法为：将土豆捣碎，即得。
46.(3)接种后管理：将步骤(2)接种有处理好的茎段的一次性成苗培养基转移至温度为23℃的培养室中培养4个月，并控制光照时间，光照时间随着接种时间推移而增加，具体为：接种后第一周置于黑暗培养，第2～4周光照时间控制为8h/d，第2个月光照时间控制为10h/d，第3个月开始光照时间为12h/d，光照强度均为1500lx。
47.待茎段培养长至7～10cm高，并长出4～5片叶子时，得到组培苗。
48.(4)炼苗：将步骤(3)得到的组培苗放在自然光下炼苗(夏季用黑色遮荫网搭建炼苗棚)，炼苗10天后将组培苗从一次性成苗培养基中取出，用流水清洗组培苗根部残留的一次性成苗培养基，将清洗干净的组培苗放入竹筐中，置于阴凉处，待组培苗不再滴出水分后，用体积分数为1～3％的多菌灵浸泡处理5min，备用。
49.(5)移栽：将步骤(4)用体积分数为1～3％的多菌灵处理的组培苗按照株距3cm
×
3cm移植至经高锰酸钾消毒3～5d的培养土中，移植时需控制培养土盖过组培苗基部1节，在
25～28℃，光照强度为3000lx，湿度为75％的环境下培养，得到血叶兰驯化苗。
50.其中，培养土为泥炭土、珍珠岩和松树皮按照体积比＝3：1：1混合而成。
51.(6)数据记录：培养1.5个月后，记录存活的血叶兰驯化苗数目(n)，并根据公式i计算存活率。
52.公式i：存活率＝(n
÷
m)
×
100％。
53.其中n为步骤(6)记录的存活的血叶兰驯化苗数目，m为步骤(1)得到的血叶兰茎段数目。
54.2、实验结果
55.本实施例所述诱导血叶兰一次性成苗的方法在诱导过程中，长势良好的血叶兰驯化苗的成活数量为196株，血叶兰的存活率为98％。
56.实验结果说明该方法诱导血叶兰成苗的存活率较好，解决了血叶兰自身繁殖能力差，组培繁育苗存活率低的问题。
57.实施例2一种诱导血叶兰一次性成苗的方法
58.1、实验方法
59.(1)材料选取和处理：选取健壮且无病害的血叶兰植株，将血叶兰植株在流水下冲洗干净，剪去血叶兰植株的叶片和根系，得到血叶兰无根茎段；将血叶兰无根茎段用体积分数为10～20％的洗衣粉溶液冲洗4min，然后用流水冲洗4遍，将血叶兰无根茎段放置于超净台上，用体积分数为75％的酒精处理血叶兰无根茎段1min，用体积分数0.01％的hgcl2消毒5min，接着用无菌水冲洗4遍，得到消毒后的血叶兰无根茎段。
60.将消毒后的血叶兰无根茎段放置于超净工作台上，并将其两端各切除0.4cm，接着切成2.7cm的茎段且保证每个茎段上均带1个节，得到处理好的茎段，共得到200段血叶兰茎段(m)。
61.(2)接种：将步骤(1)得到的处理好的茎段接种到经高压灭菌的一次性成苗培养基中，并将处理好的茎段有序平放至一次性成苗培养基中。
62.其中，一次性成苗培养基包括ms培养基、1.0mg/l的6-ba、1.5mg/l的naa、100g/l的土豆泥、25g/l的蔗糖、6.5g/l的琼脂和1.5g/l的活性炭；一次性成苗培养基的ph为5.6～5.8。
63.所述土豆泥的制备方法为：将土豆捣碎，即得。
64.(3)接种后管理：将步骤(2)接种有处理好的茎段的一次性成苗培养基转移至温度为24℃的培养室中培养4个月，并控制光照时间，光照时间随着接种时间推移而增加，具体为：接种后第一周置于黑暗培养，第2～4周光照时间控制为8h/d，第2个月光照时间控制为10h/d，第3个月开始光照时间为12h/d，光照强度均为1700lx。
65.待茎段培养长至7～10cm高，并长出4～5片叶子时，得到组培苗。
66.(4)炼苗：将步骤(3)得到的组培苗放在自然光下炼苗(夏季用黑色遮荫网搭建炼苗棚)，炼苗10天后将组培苗从一次性成苗培养基中取出，用流水清洗组培苗根部残留的一次性成苗培养基，将清洗干净的组培苗放入竹筐中，置于阴凉处，待组培苗不再滴出水分后，用体积分数为1～3％的多菌灵浸泡处理7min，备用。
67.(5)移栽：将步骤(4)用1～3％多菌灵处理的组培苗按照株距3cm
×
3cm移植至经高锰酸钾消毒3～5d的培养土中，移植时需控制培养土盖过组培苗基部1节，在25～28℃，光照
强度为3000lx，湿度为75％的环境下培养，得到血叶兰驯化苗。
68.其中，培养土为泥炭土、珍珠岩和松树皮按照体积比＝3：1：1混合而成。
69.(6)数据记录：培养1.5个月后，记录存活的血叶兰驯化苗数目(n)，并根据公式i计算存活率。
70.公式i：存活率＝(n
÷
m)
×
100％。
71.其中n为步骤(6)记录的存活的血叶兰驯化苗数目，m为步骤(1)得到的血叶兰茎段数目。
72.2、实验结果
73.本实施例所述诱导血叶兰一次性成苗的方法在诱导过程中，长势良好的血叶兰驯化苗的成活数量为193株，血叶兰的存活率为96.5％。
74.实验结果说明该方法诱导血叶兰成苗的存活率较好，解决了血叶兰自身繁殖能力差，组培繁育苗存活率低的问题。
75.实施例3一种诱导血叶兰一次性成苗的方法
76.1、实验方法
77.(1)材料选取和处理：选取健壮且无病害的血叶兰植株，将血叶兰植株在流水下冲洗干净，剪去血叶兰植株的叶片和根系，得到血叶兰无根茎段；将血叶兰无根茎段用体积分数为20～30％的洗衣粉溶液冲洗5min，然后用流水冲洗5遍，将血叶兰无根茎段放置于超净台上，用体积分数为75％的酒精处理血叶兰无根茎段1min，用体积分数0.01％的hgcl2消毒7min，接着用无菌水冲洗5遍，得到消毒后的血叶兰无根茎段。
78.将消毒后的血叶兰无根茎段放置于超净工作台上，并将其两端各切除0.5cm，接着切成3cm的茎段且保证每个茎段上均带2个节，得到处理好的茎段，共得到200段血叶兰茎段(m)。
79.(2)接种：将步骤(1)得到的处理好的茎段接种到经高压灭菌的一次性成苗培养基中，并将处理好的茎段有序平放至一次性成苗培养基中。
80.其中，一次性成苗培养基包括ms培养基、1.0mg/l的6-ba、1.5mg/l的naa、100g/l的土豆泥、25g/l的蔗糖、6.5g/l的琼脂和1.5g/l的活性炭；一次性成苗培养基的ph为5.6～5.8。
81.所述土豆泥的制备方法为：将土豆捣碎，即得。
82.(3)接种后管理：将步骤(2)接种有处理好的茎段的一次性成苗培养基转移至温度为25℃的培养室中培养4个月，并控制光照时间，光照时间随着接种时间推移而增加，具体为：接种后第一周置于黑暗培养，第2～4周光照时间控制为8h/d，第2个月光照时间控制为10h/d，第3个月开始光照时间为12h/d，光照强度均为2000lx。
83.待茎段培养长至7～10cm高，并长出4～5片叶子时，得到组培苗。
84.(4)炼苗：将步骤(3)得到的组培苗放在自然光下炼苗(夏季用黑色遮荫网搭建炼苗棚)，炼苗5天后将组培苗从一次性成苗培养基中取出，用流水清洗组培苗根部残留的一次性成苗培养基，将清洗干净的组培苗放入竹筐中，置于阴凉处，待组培苗不再滴出水分后，用1～3％的多菌灵浸泡处理10min，备用。
85.(5)移栽：将步骤(4)用1～3％多菌灵处理的组培苗按照株距3cm
×
3cm移植至经高锰酸钾消毒3～5d的培养土中，移植时需控制培养土盖过组培苗基部2节，在25～28℃，光照
强度为3000lx，湿度为75％的环境下培养，得到血叶兰驯化苗。
86.其中，培养土为泥炭土、珍珠岩和松树皮按照体积比＝3：1：1混合而成。
87.(6)数据记录：培养1.5个月后，记录存活的血叶兰驯化苗数目(n)，并根据公式i计算存活率。
88.公式i：存活率＝(n
÷
m)
×
100％。
89.其中n为步骤(6)记录的存活的血叶兰驯化苗数目，m为步骤(1)得到的血叶兰茎段数目。
90.2、实验结果
91.本实施例所述诱导血叶兰一次性成苗的方法在诱导过程中，长势良好的血叶兰驯化苗的成活数量为198株，血叶兰的存活率为98.5％。
92.实验结果说明该方法诱导血叶兰成苗的存活率较好，解决了血叶兰自身繁殖能力差，组培繁育苗存活率低的问题。
93.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。