利用Na2SO4提升EOPO-水两相体系分离生物产品的工业应用性能

利用na2so4提升eopo-水两相体系分离生物产品的工业应用性能
技术领域
1.本发明涉及两水相萃取技术领域，更具体地，涉及可再生型两水相萃取技术领域，特别是指在单一温敏聚合物构建的可回收型两水相体系中，通过添加无机盐降低纯化后目标分子溶液中聚合物含量。


背景技术：

2.利用热响应型聚合物构建两水相体系，通过将热响应型聚合物的高效回收，实现两水相体系的重复再利用，降低聚合物水溶性，消除终产品中聚合物残留。
3.可再生两水相体系其含水量高，聚合物可被高效回收。当聚合物水溶液加热到一定温度时出现浑浊现象，这一温度称为两水相体系的浊点温度。浊点温度主要受聚合物组成、聚合物与水的比例以及体系中其他物质如无机盐的影响。聚合物水溶液中存在盐时，聚合物链排斥盐离子形成缺盐区域，并与水形成一层水化膜，这种结构不断扩展使盐离子全被排斥到水溶液中并引起系统相互作用自由能变化，从而使系统浊点降低。当体系温度越是高于浊点温度，两相分离更加彻底，聚合物相的水含量更少，水相中聚合物的含量也更少。
4.环氧乙烷(eo)-环氧丙烷(po)无规共聚物(eopo)是一种热响应型聚合物，可根据环氧乙烷与环氧丙烷的比例，调节其亲疏水性合成不同浊点的热响应型聚合物，常用包括无规共聚型eo
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po
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(cn112321704a)、eo
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po
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，及嵌段共聚型eopo108(cn112375109a)，并可根据分离目标物质的性质选择合适浊点的eopo。其中，eo含量越高，浊点温度越高。而eo
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po
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与水组成的单一两水相体系浊点温度通常约为25℃，使得绝大多数生物分子可在其浊点以上10℃保持稳定。
5.可再生型两水相萃取技术在生物分子类药物生产方面具有独特优势与较好的应用前景，但在通常的分离方法中，由两水相体系纯化所得生物分子溶液中聚合物含量较高，从而影响了下一步过程，如提高柱层析的工作压力且降低了过程的分辨率，或是造成冻干过程有粘稠物质残留，限制了两水相技术在工业上的发展与应用。
6.因此，通过添加无机盐降低可再生型两水相体系中水相聚合物含量，使目标物质在被两水相体系萃取的同时，纯化所得样品溶液中聚合物含量大幅降低，并降低聚合物对后续工艺过程造成的影响，成为该领域所需解决的一个关键问题。


技术实现要素：

7.本发明主要针对上面的问题，提供了一种在eopo/水两水相中加入na2so4的工艺方法，该两水相体系成相聚合物为热响应型液态聚合物eo
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po
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和eopo108，分子量为3kda，其单独与水组成的体系浊点约为27℃，在本工艺方法最后一步加料中添加200-300mm的na2so4可以显著降低成相所需时间，省去成相后的离心过程，并在保证目标分子回收率与活性的同时，显著降低纯化后的目标分子溶液中eo
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po
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或eopo108含量。
8.为了实现上述的目的，本发明提供了一种eopo/水两水相分离纯化生物分子过程中加入的na2so4方法，其主要特点是，所述的方法包括：
9.eo
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/水两水相体系分离单克隆抗体的萃取过程：将待纯化液、na2so4溶液、eo
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混合均匀，并调节ph至8.4-8.6，分成上下两相，将上相萃余液去除，加入乙酸钠和na2so4溶液，分成上下两相，将上相取出，获得纯化后溶液。
10.具体地，将单克隆抗体细胞培养液微滤除去细胞，用50kd超滤膜超滤换液至1.5mm甘氨酸 20mm na2so4溶液，将其与eo
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按照3:1的体积比混合均匀，并调节ph至8.4-8.6，静置于37℃水浴锅30分钟后，即可分成上下界面清晰的两相，取出离心，并将上相萃余液去除，接着加入3倍下相体积ph为5.5的20mm乙酸钠 200-300mm na2so4溶液，静置于37℃水浴锅30分钟后，即可分成上下界面清晰的两相，取出离心，并将上相取出，获得eo
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含量低的纯化后的单抗溶液。
11.eopo108/水两水相体系分离螺旋霉素的过程：将待纯化液、eopo108混合均匀，并调节ph至9.0，分成上下两相，将上相萃余液去除，加入na2so4溶液，调节ph至5.0，形成上下两相，收集上相，即可得到纯化后溶液。
12.具体地，将聚合物eopo108与螺旋霉素发酵液以1:5的体积比混合均匀，用naoh调节ph至9.0，静置于60℃水浴锅中1h，即可分成上下界面清晰的两相，取出离心，并将上相萃余液去除；向正萃下相中加入其体积一半的200mm na2so4溶液，混合均匀并利用hcl调节ph至5.0，静置于50℃水浴锅中1h，形成上下界面清晰的两相，离心后收集反萃上相，即可得到螺旋霉素水溶液。
13.在上述纯化过程中，所述的单克隆抗体为依据利妥昔和曲妥珠单克隆抗体氨基酸序列，利用cho系统表达生产的两种单克隆抗体。
14.水相中聚合物含量测定：采用液相色谱系统，使用acquity uplc蛋白beh sec柱和corona cad检测器。流动相为50mm醋酸铵 100mm乙腈，ph 7.0。运行时间为10min，流速为0.4l/min。根据峰面积与标准聚合物溶液进行比较，计算浓度。
15.本发明中所用的热响应型聚合物eo
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及eopo108为市售品。
16.本发明的有益效果具体为：本发明设计了一种在热响应型可再生eopo/水两水相体系分离纯化生物分子过程中加入na2so4以降低纯化后生物分子溶液中eopo的方法。其关键是，纯化后的生物分子溶液中聚合物eo
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或eopo108含量被显著降低，且易于分相，目标分子分配系数及活性也很高，满足工业使用要求。本发明提供了单克隆抗体的分离纯化工艺，eo
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与水相可控制在30分钟之内形成两相，纯化后的单抗溶液中eo
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质量分数降低至约0.6％；提供了螺旋霉素萃取工艺，eopo108与水相可控制在60分钟之内形成两相纯化后的螺旋霉素溶液中eopo108质量分数降低至约0.70％。因此，通过控制na2so4的添加可快速形成两水相体系并降低了最终样品中的聚合物含量，大大降低了聚合物对后续工艺产生的负面影响，且成相时间短，操作便捷，易于工艺化应用。
具体实施方式
17.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。
18.实施例1
19.在eo
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/水两水相分离纯化利妥昔单克隆抗体过程加入na2so4的方法
20.将单克隆抗体细胞培养液将单克隆抗体细胞培养液微滤除去细胞，用50kd超滤膜超滤换液至1.5mm甘氨酸 20mm na2so4溶液，，过滤离心后备用，首先在10ml离心管中加入2ml eo
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po
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，再在其中加入6ml单克隆抗体细胞培养液并振荡混合均匀，调节溶液ph至9.0，并将其静置于40℃水浴锅中静置30分钟即可成相，取出后，用离心机以6000rpm离心3min；
21.离心管中的上相萃余液去除，并加入与eo
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po
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等体积的25mm柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系，并加入正向萃取步骤中加入的eo
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po
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等体积的水，将其振荡混合均匀后，调节ph至4.5，并将其静置于40℃水浴锅中静置30分钟可形成两相，取出后，用离心机以6000rpm离心3min；
22.用移液枪分别吸取上、下相100μl，并将其用超纯水稀释10倍至1ml，并用hplc检测上下两相中利妥昔单克隆抗体浓度及eo
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po
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含量。
23.利妥昔单克隆抗体在热响应型可再生eo
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/水两水相中总回收率为101.2
±
1.93％。eo
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po
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在上相中的质量分数为0.63％，未添加na2so4的上相中eo
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质量分数为7.37％。
24.实施例2
25.在eo
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po
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/水两水相分离纯化曲妥珠单克隆抗体过程加入na2so4的方法
26.将单克隆抗体细胞培养液将单克隆抗体细胞培养液微滤除去细胞，用50kd超滤膜超滤换液至1.5mm甘氨酸 20mm na2so4溶液，，过滤离心后备用，首先在10ml离心管中加入1ml eo
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po
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，再在其中加入3ml单克隆抗体细胞培养液并振荡混合均匀，调节溶液ph至8.4，并将其静置于37℃水浴锅中静置30分钟即可成相；
27.将离心管中的上相萃余液去除，并加入eo
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po
80 3倍体积的20mm乙酸-乙酸钠 200mm硫酸钠缓冲液，将其振荡混合均匀后，调节ph至5.5，并将其静置于37℃水浴锅中静置30分钟可形成两相；
28.用移液枪吸取上20μl，并用hplc检测上下两相中利妥昔单克隆抗体浓度及eo
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po
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含量。
29.曲妥珠单克隆抗体在热响应型可再生eo
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po
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/水两水相中总回收率为97.88
±
0.97％。eo
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po
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在上相中的质量分数为0.59％，未添加na2so4的上相中eo
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po
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质量分数为4.83％。
30.实施例3
31.在eopo108/水两水相分离纯化螺旋霉素过程加入na2so4的方法
32.螺旋霉素发酵液经过预处理，离心后备用。向20ml发酵液中加入4ml e108，混合均匀后用naoh调节溶液ph至9.0，静置于60℃水浴锅中1h即可成相，取出后用离心机以5000rpm离心5min；
33.将上相萃余液去除，向下相中加入其体积一半的200mm na2so4溶液，混匀后用hcl调节ph至5.0，静置于50℃水浴锅中1h即形成清晰的两相，取出后用离心机于5000rpm离心5min；
34.移液枪分别吸取上、下相200μl，用超纯水分别稀释上、下相50倍至10ml，并用hplc
检测上下两相中螺旋霉素浓度及eopo108含量。
35.螺旋霉素在热响应型可再生e108/水两水相体系中总回收率为84.44％。eopo108在上相中的质量分数为0.70％，未添加na2so4的上相中eopo108质量分数为1.71％。
36.综上所述，本发明的在热响应型可再生eopo/水两水相体系中添加na2so4的方法具有成相时间短、目标分子回收率高，且活性好、纯化后的目标分子溶液中聚合物含量低，具备良好的工业应用前景。此方法可大大降低工业中经两水相体系粗纯后聚合物残留，确保进一步精纯的效果，如提高单克隆抗体的阳离子层析、疏水层析的分辨率并降低柱反压，抗生素溶液活性炭脱色时同步消除残留聚合物，成功获得满足质量要求的结晶效果，冻干粉末中目标物纯度符合质量标准，且无聚合物残留等，适用于大规模的工业应用。
37.在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。