质谱对照的制作方法

质谱对照
1.本发明涉及免疫纯化和表征分析物的方法以及用于这种方法的试剂盒。
2.质谱在体外诊断中用于定量分析物，例如蛋白质，包括免疫球蛋白的应用通常在本领域中是公知的。例如，wo2015/154052(其全文并入本文)公开了使用质谱(ms)检测免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链或其混合物的方法。对包含免疫球蛋白轻链、重链或混合物的样品进行免疫纯化并进行质谱分析以获得样品的质谱。这可用于例如检测来自患者的样品中的单克隆蛋白。其也可用于指纹、同种型和鉴定单克隆抗体中的二硫键。
3.ms用于通过质量和电荷分离例如样品中的λ和κ链。它也可以用于检测免疫球蛋白的重链成分，例如，在使用还原剂还原重链和轻链之间的二硫键之后。ms也描述于例如wo2015/131169中，其全文整体并入本文中。
4.样品中分析物的纯化通常使用抗分析物特异性抗体。这些通常通过本领域通常已知的技术结合到基底，例如纳米或微珠上。将含有分析物的样品与附着于珠粒的抗体混合或孵育，分析物与抗体结合，并洗去未结合的材料。然后将分析物从珠粒上洗去，脱离或洗脱，并通过质谱分析。在用于定量例如血清蛋白的体外诊断中，与质谱有关的一个问题是，它在报告结果的精确性和准确性方面提出了挑战。
5.迄今为止的解决方案包括，例如，在程序的各个具体步骤中使用对照。例如，在maldi-tof中，可以在制备靶标的点时将对照包含在基底中，从而控制结晶过程和随后的激光电离。然而，这将不会考虑到在其上游引入的可变性。在质谱中使用的许多采集前纯化技术中，通过免疫沉淀纯化分析物。这需要在纯化过程的每个步骤中使用具有已知量的靶蛋白的对照来估计在该过程的每个步骤中损失的分析物的量。然而，这不能控制例如样品沉淀和此后的制备步骤中的变化，例如由于移液误差。
6.申请人已经认识到，使用结合到珠粒或其它基底(例如固体表面)上的可释放的对照物质(例如蛋白质或肽、杂聚物或抗体)，其在纯化或富集步骤中沉淀，将确保可释放的对照物质可用作纯化过程，直到通过质谱的检测步骤中的对照。由于珠粒上的量是已知的，因此这可以用于控制该步骤中的任何损失或后续步骤中的变化。由于对照例如来自靶向分析物本身的抗体，因此质谱光谱中测量的对照的量与相同光谱中测量的目标分析物的量存在直接的关联。沉淀/富集步骤中的对照的量是已知的，因此可以将值赋予原始样品中目标分析物的水平。
7.例如，特异于分析物的捕获抗体，或者实际上另一种抗体，可以结合到基底上，例如通过重链的恒定区结合，当结合到捕获抗体的分析物被洗脱，例如通过酸洗脱时，轻链可以从捕获抗体或其它抗体中释放，并且那些轻链可以通过质谱检测。
8.通过选择捕获抗体或其它抗体的轻链，使得它们比分析物的轻链更重或更轻，可以增强区分那些轻链和例如免疫球蛋白是分析物的轻链的能力。这可以通过例如选择单克隆抗体并通过添加一个或多个氨基酸，特别是1-5个氨基酸至轻链来改变单克隆抗体的轻链来实现。
9.申请人已经认识到，可以使用其它对照，例如杂聚物，其中通过例如酸洗脱释放亚基的可检测部分。例如，可以使用包含一个或多个亚基的非免疫球蛋白性蛋白，其中通过洗
s.和stenzel m.h.chem comm(2013),49,2082-2102)。
27.对照物质通常是聚合大分子，例如肽或蛋白质，但可能是任何可检测的化合物，包括核酸，例如dna或rna。
28.对照物质可以是杂聚物的一部分。这可能是具有两个或更多个亚基的任何化合物，其中一个亚基连接到基底上，而第二个亚基(作为对照物质)可通过酸洗脱分离，然后被检测为第二个峰。通常选择与分析物具有基本上相同的电离特性，并且通常具有与被检测的分析物相似但不相同的质量的第二亚基。因此，选择第二亚基以产生一个或多个质谱峰，所述质谱峰基本上不与分析物的质谱峰重叠，从而可以区分和测量分析物的第一个峰和杂聚物的至少一部分的第二个峰。
29.杂聚物通常是蛋白质。亚基可以是，例如，通过一个或多个二硫键连接的亚基，所述二硫键可以通过酸洗脱步骤断裂以释放一个或多个亚基。
30.杂聚物可以是抗体或任何抗体的片段。它可以包含至少一条重链或其片段以及至少一条轻链或其片段，其通常通过一个或多个二硫键连接。
31.抗体或抗体片段本身可以是分析物特异性抗体或片段(例如f(ab')2)或轻链，然后其一部分被检测为第二个峰。在这种情况下通常不使用任选的另外的分析物特异性抗体。
32.在使用抗体或片段的情况下，可以通过在c末端添加或缺失一个或多个(例如至多5个)氨基酸来修饰轻链，以增加轻链的质量。
33.抗体或片段也可以通过添加化学修饰剂来修饰，以增加轻链的质量。例如；n-琥珀酰亚胺基3-(4-羟基苯基)丙酸酯和6-生物素氨基己酸n-琥珀酰亚胺基酯、生物素-peg36-五氟苯基-酯和nhs-peg4-生物素。
34.已经发现κ轻链优先被一些化学修饰剂结合，包括用生物素-pfp在例如iggκ上并且与λ轻链相比也优先的那些。可以控制与κ轻链的结合水平。申请人也观察到λ轻链修饰。
35.可以通过在不存在分析物的情况下进行步骤(i)至(v)中的每一个来计算预先确定的校准值。也就是说，与至少一种基底结合的预先确定量的对照物质不与抗体或片段接触，而是在不存在分析物的情况下与对照物质溶液接触，洗涤步骤和酸洗脱步骤(iii)和(iv)以与上述相同的方式进行。然后定量洗脱的对照物质的量。这可以例如通过液相色谱-质谱(lc-ms)进行。
36.洗脱的抗体的量可用于确定该样品的校准值。
37.校准步骤可以基本上在用分析物进行纯化和表征步骤的同时进行。可选地，可以在例如供应与基底结合的分析物特异性抗体之前，在供应商实验室进行。然后可以用每批结合到基底上的分析物特异性抗体来提供校准值。该预先确定的值提供了一个常数，可以根据该常数利用分析物计算纯化过程中的变化。
38.分析物可以是，例如，血清蛋白，如免疫球蛋白或其片段，或其它血清蛋白，如清蛋白、凝血因子、调节蛋白、β2-微球蛋白、c反应蛋白，α-1抗胰蛋白酶、α-1胎蛋白等。
39.抗体的实例包括来自绵羊，牛，马，大鼠，小鼠，兔，骆驼的多克隆和单克隆抗体、或者重组的和合成的抗体。
40.抗体或其片段可以是完整的抗体或例如f(ab')2片段。
41.与洗涤，酸洗脱和进行质谱相关的缓冲液在本领域中通常是已知的。通常(但不排
它地)，酸洗脱步骤的ph为ph7或小于7，通常小于5或大于1.5，例如2-3。此类缓冲液通常与质谱，例如maldi-tof相容，包括：
42.下面用典型的最大浓度显示了适合与maldi-tof以及例如肽或蛋白质一起使用的缓冲液。
43.最大允许浓度(大约)
44.(j.chromat.a 894(2000)345-355)
[0045][0046]
*当乙酸铵与sds或brij 35联合使用时，这些洗涤剂的最大浓度可以达到30mm。在任何其它缓冲液中，brij 35和sds通常与maldi分析不相容，并且必须完全去除。
[0047]
maldi-tof的洗涤剂/表面活性剂耐受性(特别是对于生物样品：肽、蛋白质)
[0048]
[0049][0050][0051]
*当乙酸铵与sds或brij 35联合使用时，这些洗涤剂的最大浓度可以达到30mm。在任何其它缓冲液中，brij 35和sds通常与maldi分析不相容，并且必须完全去除。
[0052]
典型地，maldi-tof质谱用于产生分析物(如果存在)的至少一个峰和与在纯化步骤中使用的对照物质的至少一个片段相关的第二个峰。
[0053]
第二个峰通常是抗体的轻链或轻链的片段。如果例如通过质谱过程产生多个带电的抗体片段或抗体，可以存在两个或更多个峰。酸洗脱通常从抗体的轻链解离重链。
[0054]
当使用单独的对照物质并且分析物是免疫球蛋白时，分析物特异性抗体可以交联以防止与重链结合的轻链的释放，并且因此防止例如从分析物特异性抗体或其片段释放的轻链多样品的干扰。
[0055]
因此，分析物特异性抗体或其片段可以用例如在酸洗脱相关性下稳定的键交联。
[0056]
wo2006/099481a描述了在宽范围的大分子中使用的链内和链间硫醚交联，所述大分子包括多肽如多克隆抗体、单克隆抗体、fab、f(ab)和f(ab')2片段、单链抗体、人抗体，人源化或嵌合的抗体以及表位结合片段。该文献描述了交联的目的是增强抗体或片段的稳定
性以及药物和功能特性。特别地，目的是交联，例如，不同单克隆抗体，例如抗病毒抗原抗体，包括抗rsv抗体的重链和轻链。所述目的是改善抗体的药学特性。
[0057]
wo00/44788描述了使用硫醚交联不同特异性的不同抗体分子以产生改进的治疗剂。类似地，具有不同特异性的双特异性或三特异性f(ab)3或f(ab)4缀合物显示在wo91/03493中。
[0058]
已经在治疗性抗体中观察到储存水平增加的硫醚(zhang q等人manuscript(2013)m113.468367)。轻链-重链二硫化物(lc214-hc220)可以转化为硫醚键。观察到一种igg1k治疗性抗体在血液中循环的同时以每天0.1％的速率在该位置转化为硫醚。还观察到在健康人类受试者中形成内源性抗体。zhang等人在体外重复了硫醚形成。这用于帮助评估硫醚键对治疗性单克隆抗体的安全性影响。
[0059]
交联通常在同一抗体的链之间是分子内的。
[0060]
交联通常包含硫醚键。
[0061]
硫醚交联包含硫醚键。这是抗体的残基之间的连接，其中所述连接具有单个硫键而不是二硫酸酯键。也就是说，硫醚交联不包括包含多于一个硫原子的连接，例如本领域技术人员熟悉的二硫桥。而是，硫醚交联包含单个硫键，其桥接大分子的残基。一个或多个另外的非硫原子可以另外形成连接。
[0062]
通过硫醚交联连接的残基可以是天然残基或非天然残基。如本领域技术人员将认识到的，硫醚交联的形成可以导致来自残基的原子损失。例如，在两个半胱氨酸残基的侧链之间形成硫醚交联可导致硫原子和氢原子从残基中损失，然而所得到的硫醚交联将被本领域技术人员认为连接半胱氨酸残基。
[0063]
硫醚交联可以连接抗体的任何两个残基。一个或多个残基可选自，例如，半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸。两个残基可以选自半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸。更通常地，两个残基是半胱氨酸残基。通常，在重链和轻链之间仅有一个硫醚交联。可选择地，可以使用两个、三个或更多个硫醚交联。抗体的重链对或其片段也可以通过一个或多个非二硫化物交联，如硫醚键连接。
[0064]
硫醚交联描述于例如wo2006/099481和zhang等人(2013)j.biol.chem.vol 288(23),16371-8和zhang&flynn(2013)j.biol.chem，vol 288(43),34325-35，通过引用并入本文中。
[0065]
可以使用膦和亚磷酸酯。此处，“膦”是指含有至少一个具有通式r3p(其中p＝磷且r＝任何其它原子)的官能单元的任何化合物。在亚磷酸酯中，r位置具体地被氧原子占据。含r3p的化合物充当能够攻击二硫键的强亲核试剂。这可导致二硫化物的还原，然而在某些条件下，也可导致硫醚键的形成。
[0066]
化合物包括：
[0067]
三(二甲基氨基)膦(cas号1608-26-0)
[0068]
三(二乙基氨基)膦(cas号2283-11-6)
[0069]
三甲基膦(cas号121-45-9)
[0070]
三丁基膦(cas号998-40-3)
[0071]
参考文献：bernardes等人(2008)angew.chem.int.ed.,vol 47,2244-2247，其通过引用并入本文
[0072]
交联还可以包括交联剂，例如马来酰亚胺交联剂，其与游离硫醇反应以交联到抗体分子的链上。如wo00/44788中所述，可以使其结合在硫醇基团的一侧和另外结合在另一部分如赖氨酸羧基上。
[0073]
可以使用包含两个通过接头，尤其是柔性接头连接在一起的反应性部分的双官能交联剂。接头可包含一个或多个一起共价结合在链中的碳，例如取代或未取代的烷基。接头尤其是c1-c10，最通常地是c2-c6或c3-c6接头。申请人已经发现，含有c2-c6的交联剂如α,α
’‑
二溴-间二甲苯、bmoe(双马来酰亚胺乙烷)或bmb(双马来酰亚胺丁烷)特别可用于相对高水平的交联蛋白的回收。
[0074]
可以通过质谱预先选择抗体或其片段的大小以产生一个或多个峰，所述一个或多个峰被与分析物相关的一个或多个峰分开。例如，这可以通过选择抗体或片段的大小，或可选地，抗体或片段的电荷来实现。
[0075]
在使用maldi-tof质谱的情况下，峰通常是m/z强度。
[0076]
加入到系统中的对照物质如初始抗体的量是已知的。由于校准值，预期不使用分析物的抗体的量也是已知的。因此，在具有分析物的峰中的抗体的量可以通过校准值来校正，以考虑材料的任何损失或例如移液误差。靶标和抗体之间的m/z峰强度的比率可以控制例如样品损失，基底损失，靶标捕获，分析物洗脱，分析物点样和电离。
[0077]
将已知质量的抗体精确地偶联到珠粒上的能力，使得其随后的洗脱和m/z峰强度可用于定量(通过与目标峰比较)。这提高了精确性和准确性，从而可以用于常规的临床操作。
[0078]
基底通常是珠粒，例如磁珠、乳胶珠、陶瓷珠、聚苯乙烯或其它基底。
[0079]
磁珠和顺磁珠通常在本领域中是已知的
[0080]
基底如珠粒对抗体的吸收在本领域中也是已知的。通常，它们通过氨基，羧基，环氧基或硫醇活化的基团共价键合。也可以使用被动吸附。
[0081]
在使用磁珠的情况下，有可能在含有分析物的样品中将珠粒与结合的抗体混合，并使用磁体沉淀珠粒。抗体或其片段可以是单克隆抗体或多克隆抗体或其混合物。
[0082]
通常，抗体或片段在纯化分析物后不被酶促消化。
[0083]
分析物可能是任何合适的分析物。通常，当应用于质谱靶标时，分析物和免疫球蛋白以基本上相同的方式共结晶和离子化。
[0084]
样品可以来自植物或动物，例如哺乳动物或通常是人。它可以是组织或体液的样品，例如血液、血清、血浆、汗液、唾液、csf或尿液。
[0085]
分析物可以是免疫球蛋白或其片段。例如，免疫球蛋白或片段可以是人igg、iga、igm、λ轻链或κ轻链。
[0086]
分析物可以是人类分析物。
[0087]
通常，当分析物是免疫球蛋白时，抗体或其片段是单克隆抗体或其片段。这是因为单克隆抗体的大小可以定制，例如通过选择单克隆抗体的大小，或者可选地通过缺失抗体片段或向抗体中添加氨基酸来调节质量，以确保抗体或其片段不与靶标的大小重叠，例如不与分析物观察到的m/z峰重叠。
[0088]
免疫球蛋白本质上是非常可变的。因此，一些单克隆抗体的一个潜在问题是它们可能不能检测分析物，例如单克隆抗体的所有变体。这可以通过例如用预先确定量的单克
隆抗体或其片段以及另外地，多种另外的分析物特异性抗体或其片段(例如多克隆抗体)包被基底来改进。这允许例如在提供具有已知峰或m/z大小的预先确定的抗体或片段的同时实现分析物捕获的广泛特异性。可使用例如10-20％预先确定的单克隆抗体(或片段)与90-80％多克隆抗体的比率。
[0089]
抗体或其片段可以是重链类特异性的，轻链类特异性的，游离轻链特异性的或重链类轻链型特异性的。
[0090]
所述方法可用于通过检测分析物的存在或例如样品中分析物的浓度来检测或预测疾病。所述疾病可以是通过使用分析物特异性抗体可以纯化分析物的任何疾病。例如，b细胞相关疾病或其它免疫球蛋白相关疾病。其它实例可包括急性期标志物、肝病和肺癌生物标志物。
[0091]
存在许多与抗体产生细胞有关的增殖性疾病。
[0092]
在许多这样的增殖性疾病中，浆细胞增殖形成相同浆细胞的单克隆肿瘤。这导致产生大量相同的免疫球蛋白，并且被称为单克隆丙种球蛋白病。
[0093]
疾病如骨髓瘤和原发性全身性淀粉样变性(al淀粉样变性)分别占英国癌症死亡的约1.5％和0.3％。多发性骨髓瘤是非霍奇金淋巴瘤后的第二种常见形式的血液恶性肿瘤。在高加索人群体中，发病率约为每年每百万人中有40人。常规地，多发性骨髓瘤的诊断基于骨髓中过量的单克隆浆细胞，血清或尿液中的单克隆免疫球蛋白以及相关器官或组织损伤如高钙血症、肾功能不全、贫血或骨损伤的存在。骨髓的正常浆细胞含量为约1％，而在多发性骨髓瘤中，该含量通常大于10％，经常大于30％，但可以大于90％。
[0094]
al淀粉样变性是一种蛋白质构象紊乱，其特征在于作为淀粉样蛋白沉积物的单克隆游离轻链片段的积累。通常，这些患者存在心脏或肾衰竭，但也可能涉及外周神经和其它器官。
[0095]
有许多其它疾病可以通过患者的血流或实际上尿液中单克隆免疫球蛋白的存在来鉴定。这些包括浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤，一种在骨髓外出现并可在任何器官中发生的浆细胞肿瘤。当存在时，单克隆蛋白通常是iga。多发性孤立性浆细胞瘤可以在有或没有多发性骨髓瘤证据的情况下发生。瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症是一种与单克隆igm的产生有关的低级淋巴组织增生性病症。在美国每年有大约1,500例新病例，而在英国有大约300例新病例。血清igm定量对于诊断和监测都是重要的。b细胞非霍奇金淋巴瘤在uk中引起约2.6％的所有癌症死亡，并且已经使用标准电泳方法在约10-15％的患者的血清中鉴定了单克隆免疫球蛋白。最初的报道表明，在60-70％的患者的尿液中可以检测到单克隆游离轻链。在b细胞中，已经通过游离轻链免疫测定鉴定了慢性淋巴细胞白血病单克隆蛋白。
[0096]
另外，存在所谓的mgus病况。这些都是具有不确定意义的单克隆丙种球蛋白病。该术语表示在没有多发性骨髓瘤，al淀粉样变性，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症等证据的个体中意外存在单克隆完整免疫球蛋白。mgus可以在50岁以上的1％的人群中发现，在70岁以上的3％的人群中发现，在80岁以上的10％的人群中发现。这些当中的大多数是igg或igm相关的，尽管更少见的是iga相关的或双克隆的。尽管大多数患有mgus的人死于不相关的疾病，mgus可以转化成恶性单克隆丙种球蛋白病。
[0097]
在至少一些上述疾病的病例中，所述疾病存在异常浓度的单克隆免疫球蛋白或游离轻链。当疾病产生浆细胞的异常复制时，这经常导致该类型的细胞产生更多的免疫球蛋
白，因为该“单克隆”繁殖并在血液中出现。
[0098]
用于根据本发明的方法的包含至少一种基底的试剂盒还包含用于校准待校准的分析物的预先确定的校准值，所述基底包含预先确定量的多种对照物质和任选的分析物特异性抗体或其片段。也就是说，所述试剂盒与参考值结合提供，所述参考值可以是要编程到例如计算机中的数值的形式，或者可选地提供在用于装载到计算机中的自动芯片系统上。可选地，这可以作为用于上载到测定装置上的条形码或qr代码来提供。可以如上所述确定该校准值。在这样的试剂盒中，对照物质抗体或其片段可以如上定义。
[0099]
本发明的另一方面提供了一种具有执行本发明的步骤(v)和(vi)的装置的质谱仪。还提供了一种计算机程序，其包括使质谱仪执行本发明的步骤(v)和(vi)的指令。
[0100]
还提供了包括指令的计算机可读介质，所述指令在一个或多个处理器上执行时将通过本发明的方法获得的第二个峰值的大小或面积与预先确定的校准值进行比较。该介质还可以比较例如第二个峰的峰大小或m/z值与分析物峰的比率。
[0101]
基底和将抗体结合到基底上并随后洗脱和检测分析物和对照物质(例如杂聚物，例如抗体峰)的方法在本领域中通常是已知的。多克隆抗免疫球蛋白抗体，例如抗轻链，抗游离轻链，抗重链和抗重链类-轻链型抗体可得自例如the binding site group limited,birmingham,united kingdom。单克隆抗重链和抗轻链抗体是本领域已知的。
[0102]
现在将仅通过示例并参考以下附图来描述本发明。
[0103]
图1显示了利用附着于珠粒的抗体，然后酸洗脱和maldi-tof的原理。在该实例中，不存在抗原，并且通过色谱-质谱检测从基底洗脱的抗体的浓度并定量。还显示了来自抗体的轻链在maldi-tof上的质谱。
[0104]
图2显示了结合的单克隆抗体在maldi-tof上检测蛋白如β2m的用途。
[0105]
图3显示了使用具有轻链特异性的单克隆抗体来检测和定量来自样品的轻链的实例。
[0106]
图4使用pfp-生物素的达雷木单抗(iggκcd38特异性单克隆抗体)的进行性生物素化和质量移位。
[0107]
图5来自健康人血清的多克隆iga(左图)或多克隆igm(右图)的生物素化和质量移位。
[0108]
图6使用生物素-peg36-pfp的来自多克隆iga和igm的κ轻链的生物素化和质量移位的时间过程。
[0109]
图7使用生物素-peg36-pfp对达雷木单抗κ轻链的质量修饰。使用单剂量的试剂进行标记2小时(图7a)或在2小时后加入第二剂量的试剂进行标记6小时(图7b)。
[0110]
图8单克隆蛋白的质量修饰和光谱位移。使用生物素-peg36-pfp标记igak(a1k20，图8a)和igg2k(g2k14，图8b)。
[0111]
图9增加生物素-peg24-tfp的量和反应时间(3小时或过夜)对健康血清中多克隆免疫球蛋白κ轻链的质量修饰的影响。
[0112]
图10使用生物素-peg36-pfp对达雷木单抗κ轻链的质量修饰以用作质量标准。
[0113]
图11质量修饰的(下图)和未修饰的(上图)κ轻链的maldi-tof信号强度和达雷木单抗浓度的剂量响应数据。
[0114]
图12将质量修饰的达雷木单抗掺入来自多发性骨髓瘤患者的单克隆igal(a1l20)
临床样品的qip-ms(免疫沉淀)反应中。
[0115]
图13将质量修饰的达雷木单抗掺入健康iga(unp001)临床样品的qip-ms(免疫沉淀)反应中。
[0116]
图1是仅通过实例的方式显示附着于基底如珠粒的抗体的示意图。抗体可以通过已知的技术附着。
[0117]
在不存在分析物的情况下，或者可选地在将其用于产生对照校准值的情况下，可以通过酸洗脱来洗脱抗体，并且通过lc-ms来定量检测到的抗体的量。在这种情况下，质谱仪基于来自洗脱抗体的轻链的电荷和质量产生两个峰。
[0118]
在图2中，将抗体与患者样品一起孵育以结合分析物，例如β2m。酸洗脱后，分离抗体和抗原，并使用maldi-tof检测。在该实例中，轻链与重链分离，检测轻链并与分析物样品的峰进行比较。分析物的量可以由于在没有抗体的情况下通过酸洗脱产生的已知量的轻链来校正，所述抗体已经用于产生预先确定的校准值。
[0119]
图3显示了检测来自患者样品的轻链的单克隆抗体的实例。在这种情况下，单克隆抗体的大小比待检测样品的轻链大。这可以通过选择单克隆抗体中轻链的大小或者可选地使单克隆抗体更重来产生，例如通过添加一个或多个另外的氨基酸，例如在单克隆抗体轻链残基的n或c末端。产生这种更重的单克隆抗体轻链的技术，或者实际上产生单克隆重链的技术(如果它们是通过maldi-tof检测的峰的话)，在本领域中通常是已知的。
[0120]
也可以以类似的方式使用其它对照物质，例如上述的那些。
[0121]
实验实施例
[0122]
背景
[0123]
质谱(ms)允许通过质荷比(m/z)分离分析物。多克隆免疫球蛋白轻链具有不同的质量组，因此通常产生m/z对信号强度的正常分布的钟形曲线。单克隆轻链分解为延伸出钟形曲线的尖峰。我们先前已经观察到双电荷(轻链离子([m 2h]
2
)通过maldi-tof在m/z 10900至12300的范围内产生最佳分辨率。所示例的exent qip-ms免疫测定预分析阶段有三个主要步骤：(1)用磁珠免疫捕获分析物，(2)同时洗脱和还原分析物，和(3)将分析物点样到maldi-tof目标板上。我们选择了包括附着于磁珠的质量修饰蛋白标准物作为例子，该磁珠可以在步骤1中加入，以便在步骤2之前与分析物合并，并可以与之同时点样。这是重要的，因为这可用于控制步骤1中的变化，并且随后标准化或控制从maldi-tof质谱仪获得的所得分析物光谱信号。
[0124]
方法
[0125]
免疫球蛋白的质量修饰
[0126]
使用生物素或生物素化-peg分子通过五氟苯基酯(pfp)或四氟苯基酯(tfp)交联剂修饰免疫球蛋白。这些靶向蛋白质中的伯胺和仲胺，并且比更常用的交联剂的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯基团更具反应性且更稳定。已经显示它们适合用于蛋白质和氨基酸的生物素标记，并且是可商购的(例如e ez-link
tm pfp-biotin,cat no.21218,thermo fisher scientific，以及biotin-peg36-pfp ester,cat no.bp-24318,broadpharm)。将在pbs中的5mg/ml的免疫球蛋白与溶解在dmso中的不同量的pfp或tfp交联剂在室温下在振荡器上孵育不同的持续时间(数小时至数天)。通过加入甘氨酸(1:1摩尔)淬灭反应，然后透析以去除未缀合的交联剂。
[0127]
质谱标准颗粒或珠粒的制备
[0128]
为了制备质谱标准珠粒，用pbs-tween将10μl修饰的免疫球蛋白稀释至50μl，并与抗人igg顺磁微粒孵育15分钟。将珠粒沉淀在磁性支架上，去除上清液，用pbs-tween洗涤珠粒三次，用水洗涤一次，并储存直至使用。
[0129]
exent qip-ms免疫测定
[0130]
血清样品或纯蛋白被稀释，并在exent qip-ms免疫测定过程中使用含有人免疫球蛋白重链和轻链特异性抗体(抗igg、iga、igm、总κ和总λ)的顺磁微粒捕获。将这些微粒与稳定的绵羊多克隆抗体或重组骆驼vh结构域抗体(thermo fisher scientific)缀合。将珠粒沉淀并用pbs-tween依次洗涤。将质谱标准颗粒珠加入到混合物中，沉淀并用水洗涤一次。将其用含有还原剂和离子化对照蛋白的酸性缓冲溶液洗脱(参见例如wo2021/019211)。随后将洗脱物在具有maldi基质(α-氰基-4-羟基肉桂酸)的夹层中点样到maldi-tof目标板上并干燥。质谱在bruker microflex maldi-tof-ms上以正离子模式获得，其覆盖5000至30,000的m/z范围，包括分析物的双电荷([m 2h]
2
，m/z 10900-12300)离子(人κ或λ轻链)和质谱标准的那些。
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结果
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免疫球蛋白的质量修饰
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为了产生可用于exent qip-ms系统的质量位移分子，需要满足两个参数；(1)对免疫球蛋白轻链的修饰，其不干扰分子的免疫沉淀或免疫捕获，和(2)添加(或实际上可选地去除)可被检测为m/z位移的质量。使用pfp交联将生物素加入到治疗性单克隆iggk达雷木单抗(daratumumab)中，用于显示通过maldi-tof可以观察到对完整免疫球蛋白的修饰，其中免疫球蛋白轻链的m/z具有相应的质量位移(图4)。图5显示了由于生物素化引起的这种质量位移也可用于多克隆iga和igm样品。在所有3种情况下，通过骆驼抗体珠粒对这些质量修饰的蛋白质的免疫沉淀是不受影响的。单独用生物素观察到的质量增加不足以使质量位移超过 2电荷态离子的预期生物范围；10900至12300da；为了实现这一点，需要更大的分子。将生物素-peg36-pfp加入到多克隆iga和igm中，并通过绵羊抗κ轻链珠粒捕获分子。时间过程显示4小时反应时间足以将κ轻链的质量从平均m/z 11700修饰为12650(图6)。使用达雷木单抗单克隆蛋白的生物素-peg36-pfp修饰扩展该工作(图7)。与具有2小时持续时间的单个步骤(图7a)相比，修饰物质的6小时2步添加几乎位移了κ轻链的所有质量(图7b)。生物素-peg36-pfp也可用于对骨髓瘤衍生的单克隆免疫球蛋白igak(图8a)和igg2k(图8b)上的轻链进行质量位移。使用相关的交联剂(生物素-peg24-tfp)在3h或过夜内可以获得人血清中多克隆免疫球蛋白κ轻链的类似的质量位移(图9ab)。
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exent qip-ms标准
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为了说明质量-修饰的免疫球蛋白作为原位ms对照的用途，用生物素-peg36-pfp标记达雷木单抗3天。当使用exent qip-ms免疫测定使用绵羊抗igg珠粒进行分析时，得到的轻链的m/z表明单一位点已经被修饰(图10和11)。该单位点修饰足以将 2 m/z从11700增加到12600，而不影响iggk免疫球蛋白被抗igg珠粒免疫捕获的能力。该分子在10倍范围内的稀释系列显示浓度与ms信号强度正相关(图11)。
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将与抗igg珠粒结合的质量修饰的达雷木单抗掺入到exent qip-ms免疫沉淀iga测定中，表明可同时获得分析物的洗脱和质量修饰的分子。后者的质量修饰的轻链 2峰明
显区别于从骨髓瘤igal患者(图12)或健康样品中存在的多克隆iga(图13)获得的轻链 2峰。