一种供化妆品用的具有舒缓抗敏功效的植物组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种供化妆品用的具有舒缓抗敏功效的植物组合物及其制备方法。


背景技术：

2.近年来随着工业的发展，空气、水源和土壤的环境污染日益加重，以及各类工业添加剂滥用和人们生活方式以及饮食习惯的改变等原因，导致人自身对外部环境的抵御能力下降，敏感性皮肤的人群逐年增加。皮肤屏障受损是形成敏感性皮肤的重要原因，是一种高度敏感的皮肤亚健康状态，处于这种状态的肌肤易受到各种物理化学因素的刺激而产生刺痛、烧灼、紧绷、瘙痒等感觉，皮肤过敏已成为影响人类健康的一大因素。
3.爱美之心人皆有之，伴随化妆品的使用人群越来越广泛，市场上开发出了各种针对女士、男士、中老年人，以及婴童类等化妆品，化妆品已经成为人们日常生活的一部分。这些化妆品在制备过程中，除了配方中的增稠体系、功效成分外，还会添加防腐剂、香精、色素和表面活性剂等化学物质，这类物质易成为皮肤过敏的致敏源，再加上部分人群的皮肤屏障功能受到损坏，往往更容易引起皮肤过敏，比如出现刺痛、烧灼、紧绷、瘙痒、脱屑、红肿等过敏症状。化妆品过敏不仅影响了正常的工作和学习，严重时可引起并发症。近年来我国化妆品不良反应监测资料分析显示，化妆品过敏或刺激导致的接触性皮炎约占化妆品皮肤病的 90%以上。
4.为了降低化妆品中的过敏性物质对皮肤的刺激性，化妆品配方中往往需要加入抗敏剂。常用的化妆品抗敏剂有红没药醇、尿囊素、丹皮酚、黄芩提取物、卡瓦提取物、紫草提取物等。这些抗敏剂均具有一定的缺陷，往往存在产品功效作用靶点单一，即通过抑制过敏性介质的释放而起到抗敏作用，而未能在皮肤屏障的修复和皮肤信号传导的调控等方面起作用，导致抗敏功效较弱或过敏症状容易反复发作。有些抗敏剂存在稳定性较差，或者溶解性低，甚至产生刺激反应等方面的缺点。比如：尿囊素对皮肤有一定的收敛作用，其添加量限制在0.1～0.2%，加多了反而产生刺激反应；红没药醇通过抑制白三烯与白介素-1过敏介质的释放，从而缓解皮肤炎症，但其不具有皮肤屏障修复和重构之功效；丹皮酚水溶性差，而且有不愉悦的气味，限制了其在化妆品中的应用；黄芩提取物中的活性成分黄芩苷存在溶解度低、颜色深的缺点，不利于在化妆品中的应用；卡瓦提取物有一定的舒缓和镇静作用，但有一定的毒性，被世界卫生组织国际癌症研究机构列入2b类致癌物；紫草提取物有较好的消炎和褪红功效，但在光照情况下容易褪色分解而失去活性。
5.鉴于此，提供一种具有多靶点抗敏功效的化妆品添加剂，并保证其较好的稳定性、安全性和兼容性是化妆品行业亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处，提供一种供化妆品用的具有舒
缓抗敏功效的植物组合物及其制备方法，该植物组合物具有抑制过敏性介质的释放、修复皮肤屏障和调控皮肤信号传导的多靶点功效，并有较好的稳定性、安全性和兼容性，能够有效提高化妆品的抗敏性和舒缓性，使化妆品更加安全、有效。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种供化妆品用的具有舒缓抗敏功效的植物组合物，由下述重量百分比的组分制成：植物提取物25-35％，1,3-丁二醇55-65％，余量为水。该植物组合物的活性物含量按重量百分比分别如下：柚皮苷1-2%，总糖1-3%，总生物碱0.5-1.5%，总多酚0.2-1.0%。
8.优选地，所述一种供化妆品用的具有舒缓抗敏功效的植物组合物由以下重量百分比制成：植物提取物30％，1,3-丁二醇60％，水10%。
9.优选地，所述一种供化妆品用的具有舒缓抗敏功效的植物组合物其活性成分由以下重量百分比组成：柚皮苷1.2%，总糖2.0%，总生物碱0.9%，总多酚0.4%。
10.所述的植物提取物主要由下述重量份的药材制成：香橼32-36份，关黄柏24-28份，燕麦18-22份，甘草16-20份，粉防己11-15份，铁皮石斛8-12份。
11.优选地，所述的植物提取物优先为下述重量份的药材制成：香橼34份，关黄柏26份，燕麦20份，甘草18份，粉防己13份，铁皮石斛10份。
12.所述的一种供化妆品用的具有舒缓抗敏功效的植物组合物的制备方法，包括以下步骤：步骤1：按重量百分比分别称取1,3-丁二醇55-65％，去离子水5-15％；将1,3-丁二醇和去离子水搅拌混合均匀；步骤2：按重量百分比，称取植物提取物25-35%，加入到步骤1制备的物质中，搅拌分散均匀，即得。
13.所述的植物提取物制备方法包括以下步骤：步骤1：按重量份分别称取香橼32-36份，关黄柏24-28份，燕麦18-22份，甘草16-20份，粉防己11-15份，铁皮石斛8-12份；步骤2：将步骤1所述的药材，分别粉碎至60-100目，将粉碎后的药材粉混合均匀；步骤3：按重量比，往步骤2的药材粉混合物加入20-30倍的去离子水，搅拌转速为60-100rpm，提取温度为20-60℃，提取时间为60-120min。所得的提取物料采用离心或过滤的方式进行固液分离，收集提取液；步骤4：按重量比，往步骤3的所得的提取液中加入0.2-1.0%壳聚糖，充分搅拌溶解均匀后，澄清120-180min，采用离心或过滤的方式进行固液分离，收集澄清液；步骤5：将步骤4收集到的澄清液分别用孔径200nm的陶瓷膜进行分离，孔径8000dal的超滤膜进行纯化，孔径80dal的纳滤膜进行浓缩。按重量比，所得浓缩液是步骤2药材粉混合物的1倍，即得植物提取物。
14.所述的一种供化妆品用的具有舒缓抗敏功效的植物组合物，其作为具有舒缓抗敏功效的化妆品的添加剂，可以用于脸部、身体或头皮的护理品中，添加量为占化妆品配方总质量的0.1-10%。
15.优选地，所述天然抗敏组合物用于化妆品中的添加量优先为占化妆品配方总质量的1～5％。
16.本发明提供的一种供化妆品用的具有舒缓抗敏功效的植物组合物，其中涉及的植
物原料及使用部位要求如下：香橼，为芸香科植物香橼（citrus medica limonum）的干燥成熟果皮，按干燥品计算，含柚皮苷（c
27h32o14
）不得少于2.5%；关黄柏，本品为芸香科植物黄檗（phellodendron amurense rupr.）的干燥树皮，按干燥品计算，含盐酸小檗碱（c
20h17
no4.hcl）不得少于0.6%；燕麦，为为禾本科植物燕麦（avena sativa）的干燥种子，应符合cxs 201-1995 燕麦标准（2019版）；甘草，为豆科植物甘草（glycyrrhiza uralensis）的干燥根，按干燥品计算，含甘草酸不得少于2.0%；粉防己，为防己科植物粉防己（stephania tetrandra）的干燥根，按干燥品计算，含生物碱约不得少于1.2%；铁皮石斛，为兰科植物铁皮石斛（dendrobium officinale）的干燥茎，其甘露糖与葡萄糖的峰面积比应为2.4-8.0。
17.本发明的原料组合及其制备方法，不是随机选取，是发明人通过大量创造性试验获得的，取得的技术效果是意想不到的，具有显著的协同增效作用，缺少任何一种组分都会导致舒缓抗敏功效的植物组合物在抗敏、止痒、褪红、皮肤屏障修复和皮肤信号传导等方面的功效下降。
18.与现有技术相比，本发明提供一种供化妆品用的具有舒缓抗敏功效的植物组合物，有益效果如下：（1）该植物组合物具有抑制过敏性介质的释放、修复皮肤屏障和调控皮肤信号传导的多靶点功效，能有效缓解因使用化妆品引起的刺痛、烧灼、紧绷、瘙痒、红肿、脱屑等过敏症状，有效防止复发。（2）该植物组合物有较好的稳定性，同时与化妆品体系有较好的兼容性。可用于膏霜、乳液、啫喱、水剂等产品，可作为脸部、身体或头皮的护理品中的抗敏功效添加剂，能够有效提高化妆品的抗敏性和舒缓性，使化妆品更加安全、有效。
附图说明
19.图1. 植物组合物对透明质酸酶活性的抑制作用。
20.图2. 植物组合物对致敏介质组胺释放的抑制作用。
21.图3. 植物组合物对炎症因子il-6抑制作用。
22.图4. 植物组合物对清除自由基的清除能力。
23.图5. 含有植物组合物的护肤品对经皮水分流失(tewl)的影响。
24.图6. 植物组合物的het-cam刺激性及修复功效评价试验。
25.图7. 植物组合物消除红肿实验结果。
26.图8. 植物组合物对trpv1的蛋白作用免疫荧光图。
具体实施方式
27.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明进行说明。所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，本发明的保护范围由权利要求限定。基于本发明公开的实施例的基础上，在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。本发明提
供的技术方案中所采用的原料，除特殊说明外，均可通过常规手段制备或者通过商业渠道购买。
28.实施例1-6，一种供化妆品用的具有舒缓抗敏功效的植物组合物，其植物提取物由下述重量份的药材制成，每1份药材的重量为10克，具体见表1实施例1-6植物提取物药材配方所示。
29.表1。
30.对比例1-6的药材配方为实施例1-6分别减少1种、2种、3种药材后，其植物提取物按下述重量份的药材制成，每1份药材的重量为10克，见表2对比例1-6植物提取物药材配方所示。
31.表2。
32.实施例1：一种供化妆品用的具有舒缓抗敏功效的植物组合物其制备方法包括以下步骤：步骤1：称取表1中实施例1所示的药材，分别粉碎到60-100目，然后将各药材粉，混合均匀；步骤2：往步骤1的药材粉混合物加入25倍的去离子水，搅拌转速为80rpm，提取温度为25℃，提取时间为120min，所得的提取物料离心分离，收集提取液；步骤3：按重量比，往步骤2的所得的提取液中加入0.5%壳聚糖，充分搅拌溶解均匀后，澄清150min，离心分离，收集澄清液；步骤4：将步骤3收集到的澄清液分别用孔径200nm的陶瓷膜进行分离，孔径8000dal的超滤膜进行纯化，孔径80dal的纳滤膜进行浓缩，控制浓缩液的重量等于步骤1中药材总重量，即植物提取物；步骤5：按下述重量百分比进行混合配制：植物提取物30％，1,3-丁二醇60％，水10%，即得。
33.实施例2：称取表1中实施例2所示的药材，除药材组分比例不同外，其它操作与实施例1相同。
34.实施例3：称取表1中实施例3所示的药材，步骤2中去离子水为30倍，提取温度为60
℃，其它操作与实施例1相同。
35.实施例4：称取表1中实施例4所示的药材，步骤2中去离子水为20倍，搅拌转速为100rpm，其它操作与实施例1相同。
36.实施例5：称取表1中实施例5所示的药材，步骤3中，壳聚糖为1.0%，澄清120min，其它操作与实施例1相同。
37.实施例6：称取表1中实施例6所示的药材，步骤5中植物提取物25％，1,3-丁二醇60％，水15%，其它操作与实施例1相同。
38.对比例1：称取表2中对比例1所示的药材，除药材组分比例不同外，其它工艺参数及操作步骤与实施例1相同。
39.对比例2：称取表2中对比例2所示的药材，除药材组分比例不同外，对比例2采用孔径800nm的陶瓷膜进行分离，其它工艺参数及操作步骤与实施例2相同。
40.对比例3：称取表2中对比例3所示的药材，除药材组分比例不同外，对比例3采用孔径20000dal的超滤膜进行纯化，其它工艺参数及操作步骤与实施例3相同。
41.对比例4：称取表2中对比例4所示的药材，除药材组分比例不同外，采用孔径300dal的纳滤膜进行浓缩，其它工艺参数及操作步骤与实施例4相同。
42.对比例5：称取表2中对比例5所示的药材，除药材组分比例不同外，其它工艺参数及操作步骤与实施例5相同。
43.对比例6：称取表2中对比例6所示的药材，除药材组分比例不同外，其它工艺参数及操作步骤与实施例6相同。
[0044] 实施例1-6和对比例1-6，制备的植物组合物所含的活性成分进行含量检测，其柚皮苷、总糖、总生物碱、总多酚的百分比含量如表3所示。
[0045]
表3。
[0046]
所述的植物组合物中柚皮苷含量的检测，参照《中国药典》2020版四部通则0512高效液相色谱法进行测定。
[0047] 所述的植物组合物中总糖含量的检测主要利用植物多糖或寡糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在490nm波长下有最
大吸收峰，在10-100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比；总糖含量检测方法如下，精密称取110℃恒重的葡萄糖20.0mg，用水溶解，定容至100m1；精密吸取2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 ml分别置于100ml量瓶中加水定容至刻度，摇匀得葡萄糖稀释液；分别精密量取上述各稀释液2ml置具塞试管中，同时精密量取水2.0 ml置另一具塞试管中，各管分别加5%苯酚溶液（新制）1 ml，摇匀，然后迅速加入浓硫酸5.0ml，立即摇匀；于40℃水浴中保温30min，取出，置冷水浴中5 min；以上述2.0ml水所制得的空白溶液做参比，于490nm波长处测定各溶液吸收度，绘制标准曲线；吸取供试样2.0ml置于25ml比色管中，加5%苯酚试剂1.0ml，迅速滴加5.0ml浓硫酸，摇匀后在室温下静置30min；每个样品做三个平行样，于490nm处用空白调零测吸光度，然后代入标准曲线算出其总糖含量。
[0048] 所述的植物组合物总生物碱含量的检测主要利用生物碱与酸性染料发生化学反应，生成有色离子对，离子对定量溶于某些有机溶剂，最后对其进行比色测定；总生物碱含量的检测方法如下，分别精密量取供试样的植物组合物1.0 ml和1.0 mg/ml 的盐酸小檗碱对照品溶液1.0 ml于10ml量瓶中，分别加入溴麝香草酚蓝6.0 ml，用甲醇定容，摇匀，静置显色15 min，即得样品和对照品待测液，同法配制空白对照液；以空白对照液校正仪器，在260nm波长分别扫描对照品测定液和样品测定液，测其吸光度，计算样品中总生物碱的含量。
[0049]
所述的植物组合物总多酚含量的检测利用多酚类化合物在碱性溶液中可将钨钼酸还原成蓝色化合物，该化合物在778nm处有最大吸收，且吸收值与多酚化合物含量成正比；总多酚含量的检测方法如下，以没食子酸为标准物质，分别吸取0、10.0mg/l、20.0mg/l、30.0mg/l、40.0mg/l、50.0mg/l的没食子酸标准使用液各1.0ml，分别加5.0ml水，1.0ml钨酸钠―钼酸钠混合溶液和3.0ml 碳酸钠溶液，混匀，显色，放置2小时，在778nm波长下测定标准溶液的吸光度，绘制标准曲线；吸取1.0ml的植物组合物供试样，分别加入5.0ml水，1.0ml钨酸钠―钼酸钠混合溶液和3.0ml碳酸钠溶液，显色，放置2小时，以标准曲线的“0”管为空白，在778nm波长下测定试样溶液的吸光度，根据标准曲线求出试样溶液的总多酚浓度。
[0050]
为了更好的说明本发明的优点，证明本发明提供的植物组合物具有抑制过敏性介质的释放、修复皮肤屏障和调控皮肤信号传导的多靶点功效，下面给出本发明提供的植物组合物的研究数据。
[0051]
一、植物组合物对透明质酸酶活性的抑制作用；透明质酸酶是过敏反应的重要参与者,通过抑制透明质酸酶活性可以有效抑制肥大细胞释放组胺等过敏介质；透明质酸酶抑制实验是典型的抗敏活性体外评价方法，以透明质酸酶抑制率为指标评价物质的抗过敏活性，透明质酸酶抑制率越大则抗过敏活性越强。
[0052]
植物组合物对透明质酸酶活性的抑制作用实验方法如下：取0.25mmol/l的cacl2溶液0.1ml和透明质酸酶溶液0.5ml,37℃保温培养20min；实施例、对比例的植物组合物样品加量均为0.5ml,37℃保温培养20min；加入0.5ml透明质酸钠液37℃保温30min,常温放置5min;加入0.1ml的0.4mol/l的naoh溶液和0.5ml乙酰丙酮溶液,置于沸水浴中加热15min,立即用冰水冷却5min;加入埃尔利希试剂1.0ml,并用3.0ml无水乙醇进行稀释,放置显色20min,期间对试样进行450-700nm范围的波长扫描,确定最大吸收波长,在最大吸收波长处用分光光度计测定其吸光度值；样品对透明质酸酶抑制率的计算公式如下:抑制率（%）=
[(c-d)-(a-b)]/(c-d)
×
100%；其中，a为试样溶液（透明质酸酶 样品 透明质酸钠）的od值， b为试样空白（醋酸缓冲液 样品 醋酸缓冲液）的od值，c为对照溶液（透明质酸酶 去离子水 透明质酸钠）的od值，d为对照空白（醋酸缓冲液 去离子水 醋酸缓冲液）的od值。
[0053]
实施例、对比例的植物组合物对透明质酸酶活性抑制实验结果见图1，实验结果表明实施例的植物组合物对透明质酸酶活性的抑制率都达80%以上，与对比例的结果相比较，实施例对透明质酸酶活性均有较好的抑制作用；本发明的植物组合物可通过抑制过敏介质的释放，达到防止过敏症状的发生。
[0054]
二、植物组合物对致敏介质组胺释放的抑制作用；组胺的释放是引起人体皮肤产生瘙痒、红斑和水肿等炎症和过敏反应的直接原因之一；人外周血嗜碱性(ku812)细胞常被用作研究过敏反应的效应细胞，通过采用ku812细胞组胺释放模型,考查实施例1-6及对比例1-6植物组合物样品对ku812细胞组胺释放的影响。
[0055]
植物组合物对致敏介质组胺释放的抑制作用实验方法如下：用含10%胎牛血清的imdm培养基进行稀释细胞，将细胞密度调整为2.2x106个/ml，然后将得到的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种量为180μl。受试样品组分别加入相应浓度剂量的实施例、对比例的植物组合物样品20μl，空白对照组加入20μl培养液，置培养箱中预温孵，2h后除细胞空白对照组外，各组细胞加入刺激剂40nm巴豆醇、12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(pma)、1μm钙离子载体a23187，空白对照组加入同体积含等浓度dmso培养基。
[0056]
实施例及对比例植物组合物对对致敏介质组胺释放的抑制率如图2所示；从研究结果可以看出，实施例的植物组合物均可有效抑制组胺的释放；对比例的研究结果表明，当改变药材组方或改变制备工艺参数后，其组胺释放的抑制作用将大幅度降低；本发明的植物组合物可通过抑制组胺的释放，缓解人体皮肤的瘙痒、红斑等过敏症状。
[0057]
三、植物组合物对炎症因子il-6抑制作用；白细胞介素-6是一种细胞因子，属于白细胞介素的一种；它由纤维母细胞、单核/巨噬细胞、t/b淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞以及多种瘤细胞产生；il-6能够刺激参与免疫反应细胞增殖、分化并提高其功能；在发热反应、炎症反应中同样可以充分发挥作用，是重要的炎症介质。
[0058]
植物组合物对炎症因子il-6抑制作用实验方法如下：取raw264.7细胞悬液,密度控制在5
×
105个/ml左右,采用96孔板接种细胞,每孔200μl细胞悬液，将细胞分成空白组、阳性组和给药组；空白组每孔加入0.4μl 的dmso；阳性组每孔加入0.4μl 的dmso和2μl的lps, 给药组分别加入2μl的lps和0.4μl实施例、对比例的植物组合物；每孔依次在37℃恒温培养箱中孵育2h，用dpbs洗3次，拍干,依次加入100μl酶结合工作液(空白孔除外)、100μl显色液、加入50μl终止液，充分混合均匀5分钟后检测od值，实验结果见图3所示；研究结果表明，经1μg/ml的lps刺激后，细胞释放了il-6，浓度为1875.37
±
205.22pg/ml，与空白组218.45
±
23.71pg/ml相比，有显著性差异（p《0.05），此结果表明lps可以明显引起raw264.7细胞产生炎症反应生成il-6；对比组的植物组合物对il-6平均抑制率为27.6%,实施例对炎症因子il-6平均抑制率为89.6%,显示出本发明的植物组合物对炎症因子il-6具有良好的抑制作用。
[0059]
四、植物组合物对自由基的清除能力；
线粒体在电子传递的过程中产生的自由基会攻击细胞膜、蛋白质甚至dna,导致细胞的衰老甚至死亡, 从而导致人体出现敏感症状；抑制自由基活性可以有效缓解由外界刺激产生的皮肤过敏症状,进而维护皮肤的正常屏障结构；通过评价植物组合物对自由基的清除能力，一定程度上可反映出植物组合物对皮肤屏障修复的能力；植物组合物对自由基的清除能力评价方法如下：取0.4 ml abts工作液，用 pbs 溶液稀释，要求在常温下734nm 处吸光值为 0.7
±
0.02；取0.2 ml abts工作液与 10ul 实施例、对比例样品混合，常温避光静置 6min，在 734 nm 波长处测吸光度，平行3次；abts自由基清除能力按下式计算：清除率（%）=[a0-ai/a0]
×
100%；式中： a0 为不加样品，加入 abts 的吸光度；ai 为加入样品和 abts 的吸光度，实验结果见图4所示；结果表明实施例的植物组合物对abts自由基均有较好的清除能力，abts自由基均在80%以上，显示出植物组合物在一定程度上具有皮肤屏障修复的功能；从对比例结果可以看出，当改变药材组方或工艺参数后，其abts自由基的清除能力将大幅度下降。
[0060]
五、含有植物组合物的护肤品对经皮水分流失(tewl)的影响；经皮水分流失(tewl)是指经被动扩散通过皮肤输运的水分，它反映了皮肤屏障功能的好坏，因而tewl 的变化可以用来反映皮肤屏障功能的变化；当皮肤屏障受到破坏，它导致皮肤经皮水分流失加重，tewl也会较高；当皮肤屏障得到修复，tewl也会较低；皮肤的tewl值越低，说明皮肤的屏障功能就越好，反之，则越差。
[0061]
将本发明实施例1、实施例2，以及对比例1、对比例2的植物组合物分别添加至护肤品乳液基质中，混匀；所述的护肤品乳液基质为本领域常规的护肤品乳液基质，植物组合物与护肤品乳液基质的重量比例为5:95，测试中涉及的空白组仅是护肤品乳液基质，不添加任何实施例或对比例的植物组合物；在有皮肤屏障的受试者脸部，每天早晚以打圈方式擦抹护肤品2ml，连续使用28天，使用皮肤表皮水分丧失测定仪记录受试者在第0天、7天、14天、21天、28天tewl值，评估植物组合物对人体皮肤屏障的修复功能；实验结果见图5，实验结果可以看出，实施例的植物组合物tewl值下降幅度最大；实施例、对比例和空白组的的tewl平均值分别下降了46.7%、19.2%和12.7%，说明本发明的植物组合物对受损的皮肤有较的修复屏障效果，从而可以提高皮肤对过敏物质的抵抗能力。
[0062]
六、植物组合物的het-cam刺激性及修复功效评价试验；本试验利用孵化的鸡胚中期绒毛尿囊膜血管系统完整、清晰和透明的特点，将0.3g的受试物直接与鸡胚尿囊膜接触，作用5min之后观察绒毛尿囊膜毒性效应指标（出血、凝血和血管融解）的变化，这些指标反映血管及血管网的形态结构、颜色和通透性的变化，以及反映绒毛尿囊膜蛋白质变性等现象及其受损程度，然后组合得到一个评分，用于安全性及修复功效评估；评价标准：（1）根据无出血、轻度出血、中度出血、重度出血分别判予0、1、2、3分；（2）根据无凝血、轻度凝血、中度凝血、重度凝血分别判予0、1、2、3分；（3）根据无血管融解、轻度血管融解、中度血管融解、重度血管融解分别判予0、1、2、3分；es平均分值=6只鸡胚观察到出血、凝血和血管融解和程度总和除以3；当es≤12为无/轻刺激性；当12《es《16为中度刺激性；当es≥16为严重刺激性。
[0063]
分别进行实施例3、对比例3的het-cam刺激性及修复功效评价试验，实验结果见表4和图6；从实验结果可以看出，阴性组、实验组1、实验组2和对比组1均无刺激性，阳性组和对比组2为中等刺激性；实施例3的植物组合物具有较好的安全性及一定的缓解刺激能力；
对比组的结果可以看出，当改变药材组方或制备工艺参数后，植物组合物不具有缓解刺激的能力。
[0064]
表4。
[0065]
七、植物组合物缓解人体刺痛试验；辣椒素能够通过刺激神经细胞和皮肤角质细胞，促使细胞释放降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide，cgrp)；cgrp在外周及脊髓参与伤害性信息的传递及痛敏化的形成，与兴奋性氨基酸、辣椒素 i 型受体、趋化因子、激活素、糖皮质激素等生物活性物质或受体在痛觉调制过程中存在相互影响，cgrp 是使皮肤产生炎症以及痛觉的重要原因。
[0066]
将本发明实施例4，以及对比例4中提供的植物组合物添加至护肤品基质中，混匀；所述的护肤品基质为本领域常规的护肤品基质，植物组合物与护肤品基质的重量比例为：5:95，测试中涉及的空白组仅是护肤品基质，不添加任何实施例或对比例的植物组合物。
[0067]
实验采用 1.0 %的辣椒素刺激自愿者左右两侧鼻唇沟至颧骨区域，筛选合格的受试者；通过比较实施例、对比例和空白组的护肤品在使用前后，皮肤辣椒素刺激性试验评分的变化来评价产品的舒缓功效；评价标准：每组6个人，涂抹完毕后，询问受试者并记录0、2、5和10 min等4个时间点的感受（主要包括刺痛感、瘙痒感和灼热感），并对每种感受的程度进行评分；没有刺激感（0分），轻度刺激感（1分），中等刺激感（2分），强烈的严重刺激感（3分）；将每组受试者在左右两侧鼻唇沟至颧骨区域的4个时间点的评分相加之和除以6计算刺激评分(is值)，is≤2.5为无刺激/轻度刺激，2.5≤is《4.5为中度刺激，is≥4.5为严重刺激；测试结果见下表5含有植物组合物的护肤品缓解人体刺痛试验结果；结果表明，实施例4的植物组合物具有一定的及时舒缓效果，在使用产品2周及4周后，可一定程度上修复皮肤屏障，提高皮肤对过敏介质的耐受力。
[0068]
表5。
[0069]
八、植物组合物缓解人体瘙痒和红肿试验研究；组胺是一种自体活性物质, 在过敏、炎症的调节中发挥重要作用；当肥大细胞脱粒释放组胺这过敏介质时，通常会刺激周围的软组织及末梢神经, 导致周围毛细血管出现扩张,形成水肿症状,或者产生炎症性红斑,并诱发瘙痒症状；通过缓解组胺引起的人体瘙痒和红肿，来评价不同植物组合物的舒缓功效。
[0070]
将本发明实施例5，对比例5的植物组合物分别添加至护肤品乳液基质中，混匀；所述的护肤品乳液基质为本领域常规的护肤品乳液基质，植物组合物与护肤品乳液基质的重量比例为5:95，测试中涉及的空白组仅是护肤品乳液基质，不添加任何实施例或对比例的
植物组合物。
[0071]
招募30名手部无皮肤病及其他疾病的志愿者，标记志愿者手臂内侧约4cm2区域,吸取2%组胺溶液20ul于标记区域，涂抹均匀后观察，20分钟内有明显红、肿为合格试验者；每组6名自愿者，分别在手臂涂抹组胺溶液，当产生瘙痒感、轻微红肿后，于红肿处分别涂抹受试物进行测试；阳性组的受试物为护肤品乳液基质，实验组的受试物为含5%实施例5植物组合物及95%护肤品乳液基质，对比组的受试物为含5%对比例5植物组合物及95%护肤品乳液基质；记录志愿者瘙痒缓解、消失的平均时间，以及消除红肿平均时间，结果见下表6所示；涂抹受试物前及涂抹受试物后60min的皮肤症状进行拍照记录，见图7；结果表明，实验组可以较短时间内缓解瘙痒不适，有一定的即时舒缓功效；同时可以在60min内消除组胺引起的红肿症状。本发明具有较好的缓解瘙痒和消除红肿的效果。
[0072]
表6。
[0073]
九、植物组合物对皮肤信号传导的调控作用；瞬时感受器电位香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid 1，trpv1)是一种非选择性阳离子通道，主要表达于感觉神经元；trpv1作为一种在周围神经系统中广泛分布的多相感受器，可以直接或间接被各种配体激活，引起细胞内钙离子浓度升高，触发动作电位，进而引起皮肤的灼热、疼痛、瘙痒、肿胀等感觉；基于角质形成细胞的辣椒素受体trpv1的蛋白含量检测原理，依据免疫荧光操作步骤，进行trpv1蛋白含量检测，通过抑制trpv1的蛋白的表达，阻断各种配体激活和动作电位触发的信号通路，从而抑制了皮肤的灼热、疼痛、瘙痒、肿胀等感觉的发生。
[0074]
按1
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105个孔的接种密度接种角质形成细胞至96孔板，培养24h；将板内细胞用pbs洗2遍，加入终浓度为4μmol/l的fluo-4 am工作液，37℃孵育30min；将板内荧光染料轻轻吸出，用pbs洗2遍；每孔加入45μl hank’s液，空白组加入10μl不含植物组合物的溶剂，阴性对照组加入5μl的15μmol/l辣椒素和5μl不含植物组合物的溶剂，阳性组加入5μl的15μmol/l辣椒素和5μl的20μg/l反-4-叔丁基环己醇溶液，实验组加入5μl的15μmol/l辣椒素和5μl的200μg/l实施例6的植物组合物，对比组加入5μl的15μmol/l辣椒素和5μl的200μg/l对比例6的植物组合物，用膜封好96孔板；显微镜下拍照观察，采集图片并分析；实验结果如表7和图8 的trvp1蛋白含量检测结果所示，从实验结果可以看出，本发明的植物组合物对trpv1的信号通路具有一定程度的抑制作用，可通过阻断各种配体激活和动作电位触发的信号通路，达到皮肤感受信号传导的调控从而舒缓皮肤的灼热、疼痛、瘙痒、肿胀等感觉。
[0075]
表7