一种富硒灵芝天然活性蛋白的提取方法与流程

1.本发明涉及一种富硒灵芝天然活性蛋白的提取方法，属于提取纯化技术领域。


背景技术：

2.灵芝(ganoderma)是我国传统的保健型食用真菌。在食用真菌中，灵芝对硒的耐受力较强，是获得富硒食品的一种比较理想的真菌。硒进入生物体后可以以不同的形式存在，其中以生物有机分子组成成分的形式存在的的硒元素被称为有机硒。在有机硒中，含硒蛋白是重要而又研究得相对比较清楚的一类含硒分子。硒在蛋白质中有很大一部分是以硫元素替代物存在于氨基酸残基中，比较重要的有硒代甲硫氨酸和硒代半胱氨酸。硒代甲硫氨酸是一种比较稳定的分子，而硒代半胱氨酸容易发生进一步反应，例如硒元素有可能以离子形式离开氨基酸，因而失去生物学活性。在蛋白分子中，硒代半胱氨酸中的硒需要有两个分子形成硒代胱氨酸，即形成蛋白分子内的二硒键的形式才能稳定存在。硒代半胱氨酸中硒元素是硫元素的替代物，因此二硒键也具有二硫键的功能。二硫键是蛋白质形成和维持高级结构的最重要的结构，含有二硫键的蛋白在二硫键断裂后一般都会因结构变化而失去活性。与之相对，一个蛋白如果能维持其生物活性则也能基本判断其二硫键是稳定的。
3.菌丝体发酵是获得灵芝多糖的一个重要方法，本发明前期研究发现灵芝菌丝体发酵获得的培养液中，除含有大量的胞外多糖也含有大量的蛋白质，如能把这些蛋白提取出来则可以是获得含硒蛋白的一个有效的途径。灵芝菌丝体发酵液中，蛋白质是和大量的胞外多糖混杂在一起，蛋白质提取时往往会带出大量的灵芝多糖，因而很难得到纯度高的胞外蛋白。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供一种从富硒灵芝发酵液中提取较高纯度蛋白质，并较大幅度提高具有天然活性的蛋白的含量的方法，通过向灵芝菌丝体富硒发酵液蛋白质粗提产物水溶液中添加经过预处理的酶复合物，经过特定的处理程序，再次提取处理液中的蛋白质，第二次提取得到的产物中蛋白质含量有很大幅度增加，其中以淀粉酶、木聚糖酶为代表的活性蛋白的活性保留在80％以上。
5.本发明的第一个目的是提供一种富硒灵芝天然活性蛋白的提取方法，包括如下步骤：
6.s1、将灵芝菌丝体发酵后的发酵液离心，获得上清液，将获得的上清液进行盐析和脱盐处理，得到粗蛋白溶液；
7.s2、向粗蛋白溶液中加入溶液105，混合后加入复合葡聚糖酶d溶液进行酶解处理，处理后进行盐析、脱盐，得到所述的富硒灵芝天然活性蛋白；
8.其中，所述的溶液105由50mm～100mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钾，5％～10％酒精和1％～2％peg-200组成；
9.所述的复合葡聚糖酶d溶液通过如下方法制备得到：将葡聚糖酶bgla、葡聚糖酶
anegla6和纤维素酶按照酶活比为0.5～1.5:0.5～1.5:1混合，得到复合葡聚糖酶a溶液，加入复合葡聚糖酶a溶液5～15％体积的处理液t312，在40～50℃处理10～30min，冷却并调整ph为3.5～4.5，得到复合葡聚糖酶d溶液；
10.其中，处理液t312通过如下方法制备：将含有1％～2％peg-200、0.001％～0.002％聚乙二醇辛基苯基醚、0.05g/l～0.07g/l cocl3和0.01g/l～0.02g/l zncl2的溶液的ph调至7.5～8.5，保持1.5～2.5h后，将ph调至9.0～9.5，并在-5～5℃保持20～30h。
11.本发明处理液t312中，peg-200和聚乙二醇辛基苯基醚含量按体积比计。
12.进一步地，在复合葡聚糖酶a溶液中，葡聚糖酶bgla的酶活为400u/ml～600u/ml。
13.进一步地，所述的冷却是在冰水浴中进行冷却。
14.进一步地，所述的盐析是通过加入硫酸铵进行盐析。
15.进一步地，所述的脱盐是采用截留分子量为2.5～3.5kd超滤膜处理2～4次。
16.进一步地，s2步骤中，酶解处理是在38～42℃处理0.5～2h。
17.进一步地，s2步骤中，酶解处理后，包括调节ph为3.5～4.5，在25～35℃保温处理4～6h。
18.进一步地，灵芝菌丝体发酵是在28～32℃、160～200r/min培养5～10天。
19.进一步地，s1步骤中，离心是10,000～14,000r/min离心5～10min。
20.本发明的第二个目的是提供所述方法制备得到的富硒灵芝天然活性蛋白。
21.本发明的有益效果是：
22.本发明通过向灵芝菌丝体富硒发酵液蛋白质粗提产物水溶液中添加经过预处理的酶复合物，经过特定的处理程序，再次提取处理液中的蛋白质，第二次提取得到的产物中蛋白质含量有很大幅度增加，其中以淀粉酶、木聚糖酶为代表的活性蛋白的活性保留在80％以上。
具体实施方式
23.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
24.粗蛋白的制取方法：
25.按方法1的方法制备灵芝菌丝体富硒发酵液，发酵结束后发酵液12,000r/min离心5min，取上清液。按方法2盐析法提取发酵液的上清液，进一步再用方法3进行脱盐，由此获得粗蛋白溶液。粗蛋白中蛋白质的含量一般在40％左右。
26.再制蛋白的制取方法：
27.本发明建立的处理粗蛋白溶液的方法：在上述粗蛋白溶液中加入溶液105，混合后加入复合葡聚糖酶d溶液，在40摄氏度保温1h。反应结束后用盐酸调整ph至4.0。30℃保温5h。反应液用硫酸铵盐析法获得蛋白质沉淀，沉淀用水溶解后用超滤管进行脱盐。脱盐获得的为再制蛋白溶液，计算再制蛋白中蛋白质的含量。通过上述方法处理，再制蛋白中蛋白质的含量一般在75％左右，淀粉酶总酶活和木聚糖酶总酶活均维持在粗酶液的80％以上。
28.上述溶液105的组成：50mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钾，10％酒精，1％peg-200。
29.上述复合葡聚糖酶溶液的制备方法如下：取适当稀释获得的1000u/ml葡聚糖酶bgla和1000u/ml的anegla6，等体积混合，加入纤维素酶固体粉末，添加至终浓度为500u/
ml。上述溶液称为复合葡聚糖酶a溶液，简称复配酶a。制备复合葡聚糖酶d溶液时，在上述复合葡聚糖酶a溶液复配完成后迅速放入冰水混合物中，轻轻摇动迅速降温。加入十分之一体积的溶液t312。升温至45摄氏度，维持20min。迅速放入冰水中，用盐酸调整ph为4.0。经过上述处理的酶液称为复合葡聚糖酶d溶液，简称复配酶d。其中t312的成分如下：1％体积比的peg200，0.001％体积比的聚乙二醇辛基苯基醚，0.05g/l cocl，0.01g/l zncl2，用氢氧化钠或盐酸调整ph至8.0，维持2h，再用氢氧化钠调整ph至9.0，在冰水中持续保温24h。
30.纤维素酶为南宁庞博生物工程有限公司产品，为10万u/g的固体纤维素酶。其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。用于富硒发酵的灵芝菌种购自江南大学中国高校工业微生物资源平台，菌株号为：cicim f7085。
31.涉及的方法：
32.方法1灵芝菌丝体富硒发酵液的制备方法：
33.取固体pda培养基平板上生长的灵芝菌丝体，接种富硒灵芝发酵液，在30℃下摇瓶培养，摇瓶机转速为180r/m。培养7天。上所述富硒灵芝发酵液配方同文献[一株高耐硒灵芝突变体菌株及其应用，zl202111524579，杨梦莲，沈微，单逸蓝，陈献忠，杨海泉，夏媛媛，陈磊]中所述液态发酵一级培养基，但其中的葡萄糖改为50g/l，并增加硝酸铵0.5g/l，亚硒酸钠0.3g/l。
[0034]
方法2含蛋白质溶液的盐析方法：
[0035]
取去除了沉淀的含蛋白溶液，不停的搅拌溶液，同时逐步加入固体硫酸铵，以保证硫酸铵不断加入不断溶解，不积累固体硫酸铵为硫酸铵添加的标准。将上述添加了硫酸铵的发酵液转移到三角瓶中，4℃，60r/min，缓慢摇动摇床。12h后离心，收集沉淀。沉淀用水溶解用。
[0036]
方法3盐析蛋白的超滤脱盐：
[0037]
用截留分子量为3kd的millipore超滤浓缩管浓缩蛋白。取上清液15ml于3kd超滤离心管中，12,000rpm离心10min。此过程中，分子量小于3kd的小分子物质被过滤到收集管中。酶分子等大于3kd的分子被截留在上层超滤管中。浓缩后加入纯水恢复体积，再次进行超滤浓缩，如此进行3次左右可以获得基本不含硫酸铵的粗蛋白溶液。
[0038]
方法4总蛋白质含量的检测：
[0039]
用碧云天公司的bradford溶液蛋白浓度检测试剂盒检测溶液中蛋白质的含量，方法按试剂盒说明书进行。
[0040]
方法5蛋白质占干物质比例的检测方法：
[0041]
取待测溶液，等量分成两份。其中一份用于总蛋白质含量的检测，结果假定为m。另一方采用冷冻干燥法去除水分获得干物质，称量，结果假定为n。蛋白质占干物质总量的方法可以写成：m1/n1(100％)。
[0042]
方法6淀粉酶活性的检测：
[0043]
淀粉酶检测方法同文献[沈微*，林丽珍，黄雯雯，郭玉婉，陈献忠，樊游，王正祥，一种酸性真菌α-淀粉酶的异源表达与重组酶性质，食品与发酵工业，2013，39(8):5-10.]，由于本发明所使用的灵芝所产胞外淀粉酶是一种酸性酶，因此检测时按上述文献所述在ph4.0条件下酶活检测方法进行的检测，是在ph4.0的柠檬酸缓冲液中进行的。
[0044]
方法7木聚糖酶检测方法：
[0045]
木聚糖酶检测方法同文献[焦丛蕊，杨文娟，陈晓玲，董自星，金鹏，刘晓光，王正祥，黑曲霉xync基因编码一种低温酸性木聚糖酶[j].食品与发酵工业，2017,43(11):44-50.]，本文检测ph为4.5，检测温度为40℃。
[0046]
方法8葡聚糖酶bgla的制备方法：
[0047]
所述葡聚糖酶bgla的制备方法同文献[陈玉娟，沈微，陈献忠，王正祥，解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达，生物技术，2011，21(2):22-26]。是采用该文献报道的重组菌bacillus amyloliquefaciens(pub-pq-gm-bgla)发酵制备，发酵方法与该文献一致，发酵液酶活大约在1200u/ml。重组菌bacillus amyloliquefaciens(pub-pq-gm-bgla)由该文献作者保藏在江南大学生物工程学院，本发明使用该菌株时将该菌株在中国高校工业微生物资源信息平台进行了重新保藏，保藏编号为：cicim b6930。在保藏上述菌株时由于中国高校工业微生物资源信息平台工作人员认为该菌株的名称不符合现在的基因工程菌株的命名规则，根据该中心的建议，其名称更改为：bacillus amyloliquefaciens 7658/pub-pq-gm-bgla。
[0048]
方法9葡聚糖酶anegla6的制备方法：
[0049]
所述葡聚糖酶anegla6的制备方法同文献[韩冰，王施兰，德青美朵，沈微，陈献忠，樊游，一种黑曲霉高耐热β-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分析，食品与发酵工业，2018，44(11):55-62.]。是采用该文献报道的巴斯德毕赤酵母pichia pastoris gs115/ppic9k-egla6b发酵获得的。在该论文发表时该菌株已经保藏在中国高校工业微生物资源信息平台，编号为：cicim y1489。所述anegla6的酶液是用该菌株摇瓶发酵获得的粗酶液，发酵方法同上述文献，发酵水平大约在2500u/ml，结果与上述文献报道基本一致。
[0050]
通过实施例对本发明做进一步的说明：
[0051]
实施例1：粗酶液再处理方法的比较
[0052]
本实施例富硒灵芝天然活性蛋白提取方法：
[0053]
(1)粗蛋白的制取方法：
[0054]
按方法1制备灵芝菌丝体富硒发酵液(取固体pda培养基平板上生长的灵芝菌丝体，接种富硒灵芝发酵液，在30℃下摇瓶培养，摇瓶机转速为180r/m。培养7天)，发酵结束后发酵液12,000r/min离心5min，取上清液。
[0055]
将所获得的发酵液的上清液采用方法2进行盐析处理：不停的搅拌上清液，同时逐步加入固体硫酸铵，以保证硫酸铵不断加入不断溶解，不积累固体硫酸铵为硫酸铵添加的标准。将上述添加了硫酸铵的上清液转移到三角瓶中，4℃，60r/min，缓慢摇动摇床。12h后离心，收集沉淀，沉淀用水溶解备用。
[0056]
进一步再用方法3对上述溶解的沉淀进行脱盐处理：取沉淀的水溶液15ml于3kd超滤离心管中，12,000rpm离心10min，浓缩后加入纯水恢复体积，再次进行超滤浓缩，如此进行3次左右可以获得基本不含硫酸铵的粗蛋白溶液，即为粗酶液。
[0057]
制备的粗酶液共计500ml，淀粉酶酶活为36u/ml，木聚糖酶酶活为15u/ml，蛋白质含量为46％。
[0058]
(2)再制蛋白的制取方法：
[0059]
本发明建立的处理粗蛋白溶液的方法：在上述粗酶液中加入溶液105(50mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钾，10％酒精，1％peg-200)，混合后加入复合葡聚糖酶d，在40摄氏度保温
1h。反应结束后用盐酸调整ph至4.0，30℃保温5h。反应液用方法2将获得蛋白质沉淀，沉淀用水溶解后用超滤管进行方法3脱盐，获得的为再制蛋白溶液，计算再制蛋白中蛋白质的含量。通过上述方法处理，再制蛋白中蛋白质的含量一般在75％左右，淀粉酶总酶活和木聚糖酶总酶活均维持在粗酶液的80％以上。
[0060]
对比例：直接处理方法
[0061]
直接处理的方法是向20ml实施例中步骤(1)制备的粗酶液中加入各种酶液50微升的酶液，130℃处理1h。其中单一酶用的是稀释或溶解后估算酶活在500u/ml的酶液。
[0062]
采用不同的酶按照直接处理和本发明方法处理，结果分别如表1、2所示。
[0063]
表2的处理方法是按本发明实施例1的方法进行处理，将复合葡聚糖酶d换成不同的酶，酶的加量同上述直接加酶的方法。
[0064]
表1采用不同的酶直接处理粗酶液的方法
[0065][0066]
表2采用不同的酶用本发明方法处理粗酶液的方法
[0067]
[0068][0069]
由表1可见，用本发明涉及的三种酶处理粗酶液，对再制蛋白中蛋白总得率影响不大。各种处理方法中蛋白的总收率都在85-88％左右，这说明粗蛋白用盐析法进行再制过程中，蛋白的损失主要来源于盐析本身。几种酶的处理虽然对再制蛋白中得率影响不大，但对所获得的再制蛋白的纯度的影响较大，其中复合葡聚糖酶a和d都可以大幅度提高再制蛋白的蛋白含量，但复合葡聚糖酶a处理后两种活性酶的活性几乎全部丧失，而复合葡聚糖酶d处理后两种酶的活性保留较多。进一步用本发明建立的方法处理粗提蛋白溶液，结果见表2，从表2可见，用未经处理的酶，不管是复配的还是单独的酶，即使采用本发明的方法，其对活性蛋白的破坏依然很严重，大部分淀粉酶和木聚糖酶失去活性，只有采用经过特殊处理的复配酶即复合葡聚糖酶d，用本发明的方法处理蛋白粗提溶液，获得的再提蛋白中活性成分大幅度提高，80％以上的酶活性被保留下来，同时所提取的蛋白的纯度也大幅度提高，可见本发明建立的复合葡聚糖酶及其处理体系配合使用不但有利于提高蛋白浓度，更重要的是其可以在此基础上最大限度的保护灵芝活性酶的活性，使蛋白质处理天然的状态。
[0070]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。