一种检测肺腺癌EGFR突变的miRNA标志物、试剂盒及方法

一种检测肺腺癌egfr突变的mirna标志物、试剂盒及方法
技术领域
1.本发明涉及一种检测肺腺癌egfr突变的mirna标志物、试剂盒及方法，属于分子诊断技术领域。


背景技术：

2.肺腺癌是当前最主要的肺癌病理亚型，已占据每年所有新发肺癌病例的近三分之二。近年来，随着mirna及组织学等基础学科的进展，人们针对肺腺癌的分子机制有了更深入的理解。人们发现表皮生长因子受体(egfr)突变是肺腺癌的主要驱动因素之一。肺腺癌患者egfr突变率为50％左右，不吸烟肺腺癌患者可高达60％-70％。egfr基因突变通常发生在外显子18-21，其中19外显子del缺失(约占45％)及21外显子l858r点突变(约占40％)最常见。
3.目前临床egfr酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tki)例如吉非替尼、阿法替尼、奥希替尼等已成为进展期且具有egfr突变的肺腺癌患者的标准治疗方式。通过检测患者是否具有egfr突变，来判断患者是否适合用egfr-tki治疗，已经是目前临床的常规操作。
4.目前检测egfr突变的方法存在成本高昂、流程繁琐等缺陷。例如egfr突变的标准检测方法直接测序法，过程稍繁琐、耗时长，检测10％以下突变率的样本常常出现假阴性。ngs是边合成边测序技术(sequencing by synthesis，sbs)，高通量高深度，价格昂贵。


技术实现要素：

5.本发明的目的是：提供一种检测肺腺癌egfr突变的mirna标志物、试剂盒及方法，通过检测多个mirna标志物的表达量，作为生物标志物用于判断患者egfr突变情况，为临床上egfr-tki治疗提供指导。
6.为了实现上述目的，本发明提供了一种检测试剂在制备检测肺腺癌egfr突变的试剂盒中的应用，所述检测试剂由检测以下mirna表达量的试剂组成：mir-10a-5p、mir-10b-5p、mir-34a-5p、mir-181a-5p、mir-203a-3p、mir-30e-3p、mir-542-3p和mir-4772-3p，所述检测试剂作为试剂盒实现检测肺腺癌egfr突变的唯一关键成分。
7.优选地，所述试剂盒内还包括说明书，所述说明书记载如下评分模型：
8.score＝0.558
×
mir-10a-5p 0.446
×
mir-10b-5p 0.635
×
mir-34a-5p 0.921
×
mir-181a-5p-0.346
×
mir-203a-3p 0.984
×
mir-30e-3p 0.503
×
mir-542-3p-0.74
×
mir-4772-3p－39.893；
9.上述评分模型中各基因代表的是mirna表达量的log2(tpm 1)转换值，即采用tpm计算度量指标，tpm公式＝(每条mirna比对到的read数目)/(样本总比对read数目)
×
106，并转换成log2(tpm 1)后代入评分模型中计算score得分，当检测样本score得分大于0时，则该检测样本存在egfr突变；当检测样本得分等于或小于0时，则该检测样本不存在egfr突变；所述检测样本为新鲜组织肿瘤样本。
10.本发明还提供了一种检测肺腺癌egfr突变的试剂盒，至少包括特异性检测以下
mirna表达量的试剂：mir-10a-5p、mir-10b-5p、mir-34a-5p、mir-181a-5p、mir-203a-3p、mir-30e-3p、mir-542-3p和mir-4772-3p。
11.本发明还提供了一种用于非疾病诊断和治疗目的的检测肺腺癌egfr突变的方法，包括如下步骤：
12.步骤1：使用mircute mirna提取分离试剂盒mircute mirna isolation kit提取肿瘤组织样本中的mirna；
13.步骤2：mirna文库构建：采用truseq mirna sample prep kitv2试剂盒完成；
14.步骤3：簇生成：采用truseq sr cluster kitv3-cbot
–
hs试剂盒完成；
15.步骤4：illumina hiseq2000测序：hiseq2000上机，测序结果将原始数据转换成fastq格式；
16.步骤5：数据分析及计算：
17.对原始fastq文件数据去除接头序列后，并检验测序片段碱基的质量和长度，筛选质量可靠的测序片段；将测序结果与mirbase数据库比对过滤，鉴定出检测样本中的mirna数据；根据鉴定的mirna进行表达量统计，mirna表达量计算采用tpm计算度量指标，tpm公式＝(每条mirna比对到的read数目)/(样本总比对read数目)
×
106，并转换成log2(tpm 1)；将目的mirna的表达量转换成log2(tpm 1)后代入评分模型：score＝0.558
×
mir-10a-5p 0.446
×
mir-10b-5p 0.635
×
mir-34a-5p 0.921
×
mir-181a-5p-0.346
×
mir-203a-3p 0.984
×
mir-30e-3p 0.503
×
mir-542-3p-0.74
×
mir-4772-3p－39.893计算score得分。
18.步骤6：判断：当检测样本score得分大于0时，则该检测样本存在egfr突变；当检测样本得分等于或小于0时，则该检测样本不存在egfr突变；所述检测样本为新鲜组织肿瘤样本。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
20.(1)本发明中通过检测患者多个mirna的表达量，作为生物标志物用于判断患者egfr突变情况，将会更具性价比地为egfr突变检测提供保障，同时具有高敏感性、特异性和应用价值，有助于实现针对患者的精准医疗；
21.(2)本发明首次提出了该mirna组合物可用于评估肺腺癌egfr突变，较目前常用的方法，具有操作便捷，可定量分析、准确性高、灵敏度和特异性好、性价比高的优点。
附图说明
22.图1为egfr突变型和野生型患者显著差异mirna火山图；
23.图2为lasso回归结果图；
24.图3为roc曲线。
具体实施方式
25.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
26.实施例1mirna集的筛选及效果验证
27.(一)肺腺癌预后评分模型构建
28.1、方法
29.首先从tcga数据库中获得448例肺腺癌样本的mirna表达数据和突变数据，根据患
者的egfr突变与否分为egfr突变型(51例)和野生型(397例)，通过r语言limma包筛选出两组间的显著差异mirna共38个，其中显著上调的mirna共36个，显著下调的mirna共2个(图1)。
30.进一步通过lasso回归最终挑选出18个mirna为：mir-101-3p、mir-10a-5p、mir-10b-5p、mir-34a-5p、mir-181a-5p、mir-203a-3p、mir-205-5p、mir-181a-3p、mir-224-5p、mir-30e-3p、mir-501-5p、mir-542-3p、mir-181a-2-3p、mir-339-3p、mir-146b-3p、mir-589-5p、mir-4772-3p、mir-664b-3p(图2)。
31.进一步对上述18个mirna进行logistic回归分析，最终挑选出8个mirna(表1)，并构建得分模型：
32.score＝0.558
×
mir-10a-5p 0.446
×
mir-10b-5p 0.635
×
mir-34a-5p 0.921
×
mir-181a-5p-0.346
×
mir-203a-3p 0.984
×
mir-30e-3p 0.503
×
mir-542-3p-0.74
×
mir-4772-3p－39.893；
33.表1：logistic回归结果
[0034][0035]
最后我们基于该mirna表达，计算每个样本的评分，通过roc曲线(图3)分析其敏感性和特异性，将tcga样本分为两组，评分大于0归于egfr突变型，评分等于或小于0归于egfr野生型。与实际检测结果相比较，计算灵敏度＝41/51＝80.4％，特异度＝371/444＝83.1％(表2)。
[0036]
表2本方法在tcga数据库肺腺癌中预测的灵敏度与特异度
[0037]
[0038]
(二)效果验证
[0039]
我们将复旦大学附属中山医院胸外科收集的47例肺腺癌样本，进行mirna测序。具体步骤如下：
[0040]
①
使用mircute mirna提取分离试剂盒(mircute mirna isolation kit)提取肿瘤组织样本中的mirna；
[0041]
②
mirna文库构建：采用truseq mirna sample prep kitv2试剂盒完成；
[0042]
③
簇生成：采用truseq sr cluster kitv3-cbot
–
hs试剂盒完成；
[0043]
④
illumina hiseq2000测序：hiseq2000上机，测序结果将原始数据转换成fastq格式；
[0044]
⑤
数据分析：
[0045]
对原始fastq文件数据去除接头序列后，并检验测序片段碱基的质量和长度，筛选质量可靠的测序片段；将测序结果与mirbase数据库比对过滤，鉴定出结果中的已知人的mirna数据；根据鉴定的mirna进行表达量统计，mirna表达量计算采用tpm(transcript per million)计算度量指标，tpm公式＝(每条mirna比对到的read数目)/(样本总比对read数目)
×
106，并转换成log2(tpm 1)。将目的mirna的表达量log2(tpm 1)进行相关计算，根据评分模型score＝0.558
×
mir-10a-5p 0.446
×
mir-10b-5p 0.635
×
mir-34a-5p 0.921
×
mir-181a-5p-0.346
×
mir-203a-3p 0.984
×
mir-30e-3p 0.503
×
mir-542-3p-0.74
×
mir-4772-3p－39.893计算score得分。
[0046]
⑥
根据计算结果分为两组，得到大于0的为egfr突变型，等于或小于0的为egfr野生型，与实际检测结果相比较，计算灵敏度＝20/26＝76.9％，特异度＝16/21＝71.4％。
[0047]
表3本方法在中山医院肺腺癌患者中预测的灵敏度与特异度
[0048][0049]
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。