用于治疗癌症的包含低甲基化剂的联合疗法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年6月1日提交的美国临时申请63/033,074；2020年10月27日提交的美国临时申请63/106,285；2020年11月3日提交的美国临时申请63/109,083；2020年11月17日提交的美国临时申请63/114,959；和2021年2月4日提交的美国临时申请63/145,925的优先权，每个申请的内容通过引用整体并入本文。
3.以ascii文本文件提交序列表
4.以下关于ascii文本文件的提交的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读形式(crf)(文件名：757972001240seqlist.txt，记录日期：2021年5月28日，大小：297kb)。
技术领域
5.本发明涉及治疗癌症的方法，所述方法包括将阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的剂与低甲基化剂(例如，阿扎胞苷(azacitidine))联合施用于有此需要的个体。
背景技术：
6.许多癌症的预后很差，即使用有效的疗法治疗也是如此。例如，美国大约有70,000名确诊为骨髓增生异常综合征(mds)的患者。mds患者具有广泛的预期结果，可根据其修订的国际预后评分系统(revised international prognostic scoring system)或ipss-r风险类别进行评估。具有极低ipss-r的患者具有8.8年的中位总生存期，而具有极高ipss-r的那些患者具有不到十个月的中位总生存期。对于具有较高风险的mds(中度、高度和极高ipss-r)的患者，护理治疗标准包括干细胞移植(sct)、高强度和低强度化疗组合和低甲基化剂(hma)。sct是唯一可能治愈的疗法；然而，手术难以忍受，尤其是对于老年患者，并且所有mds患者在200天时的非复发死亡率为大约40％。
7.由于近75％的患者在70岁或以上被诊断，因此在考虑治疗选项时，平衡患者的预后年龄与对生活质量潜在的治疗相关的影响非常重要。不考虑年龄，mds患者的治疗目标是提高存活率、缓解症状和生活质量之间的平衡。本领域需要新的治疗来为骨髓增生异常综合征(mds)患者(包括具有较高风险的mds的患者)提供额外的治疗选项并改善效果。
8.肿瘤细胞可以操纵骨髓分隔来逃避抗肿瘤宿主免疫响应(gabrilovich等人,nat rev immunol(2012)12(4):253-68)。例如，当在正常细胞表面上表达的cd47结合巨噬细胞上的sirpα并提供“不要吃我(don’t eat me)”信号时，也发现肿瘤细胞过表达cd47以逃避巨噬细胞免疫监视的组分(oldenborg,isrn hematol(2013)614619)。
9.通过同时破坏“不要吃我”信号(例如，cd47-sirpα)和活化“吃我(eat me)”信号来优化巨噬细胞介导的癌细胞破坏。没有一种组分单独足以触发针对肿瘤细胞的最大吞噬反应。如上所述，cd47通过其与巨噬细胞上的sirpα的相互作用提供基本的“不要吃我”信号。前吞噬细胞的“吃我”信号可以通过与其的活化fcγ受体结合而提供给相同的巨噬细胞。例
如，可以通过抗肿瘤抗体的fc结构域与巨噬细胞上的fc受体的结合来提供前吞噬细胞“吃我”信号。前吞噬细胞信号传导也可以由其他刺激提供，诸如肿瘤细胞表面上的钙网蛋白与巨噬细胞上的lrp受体的结合。
10.在骨髓增生异常综合征(mds)和急性髓性白血病(aml)中，已经报道了增生异常细胞上cd47的过度表达和异常表达，并且表明其与存活率呈负相关(majeti等人2009；jiang等人2013；galli等人2015)。
11.本文引用的所有参考文献(包括专利申请、专利公开和uniprotkb/swiss-prot登记号)都通过引用整体并入本文，就好像每个单独的参考文献都被具体和单独地指出通过引用并入一样。
技术实现要素：
12.在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的癌症(例如，骨髓增生异常综合征(mds)或急性髓性白血病(aml))的方法，其包括向所述个体施用有效量的：(a)包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体的融合多肽，和(b)低甲基化剂；其中融合多肽的sirpαd1结构域变体的c末端连接至fc结构域变体的n末端。在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的癌症(例如，aml)的方法，其包括向所述个体施用有效量的：(a)包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体的融合多肽，和(b)低甲基化剂；其中融合多肽的sirpαd1结构域变体的c末端连接至fc结构域变体的n末端。在一些实施方案中，融合多肽的sirpαd1结构域变体包含seq id no:81或seq id no:85的氨基酸序列；并且融合多肽的fc结构域变体是(i)包含l234a、l235a、g237a和n297a突变的人igg1 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(ii)包含a330s、p331s和n297a突变的人igg2 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(iii)包含s228p、e233p、f234v、l235a和delg236突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；或(iv)包含s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引。在一些实施方案中，癌症是骨髓增生异常综合征(mds)。在一些实施方案中，mds是较高风险的mds。在一些实施方案中，个体已经接受用于mds的先前治疗。在一些实施方案中，个体没有接受用于mds的先前治疗。在一些实施方案中，用于mds的治疗包括诱导期和维持期，其中诱导期包括施用(a)包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体的融合多肽，和(b)低甲基化剂，并且其中维持期包括施用不含低甲基化剂的包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体的融合多肽。在一些实施方案中，癌症是急性髓性白血病(aml)。在一些实施方案中，融合多肽以高达约60mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，融合多肽每四周一次(q4w)以约60mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，癌症是急性髓性白血病(aml)。在一些实施方案中，根据who 2016分类，个体患有亚细胞学或组织学确诊的复发/难治或新诊断的aml。在一些实施方案中，个体患有复发/难治在被认为不适合强化诱导治疗的患者中先前未治疗的aml。在一些实施方案中，个体患有在先前用基于hma的方案治疗后复发/难治的aml。在一些实施方案中，个体患有先前未治疗的aml，并且不被认为是强化诱导治疗的合适候选人。在一些实施方案中，个体具有足够的肾功能和肝功能。在一些实施方案中，个体≥18岁。在一些实施方案中，个体具有足够的表现状态。在一些实施方案中，个体没有经历过先前的同种异体造血干细胞移植(hsct)。在一些实施方案中，个体在hcst后至少3个月，没有不受控制的移植物抗宿主病(gvhd)。在一些实施方案中，个体没有经历过先前的同
种异体hsct。在一些实施方案中，根据aml的2019年国家综合癌症网络(national comprehensive cancer network；nccn)指南第3版，个体未患新诊断的具有有利风险细胞遗传学的aml，诸如t(8；21)、inv(16)或t(16；16)。在一些实施方案中，个体未患急性早幼粒细胞白血病(apl)。在一些实施方案中，个体没有经历过使用任何抗cd47或抗sirpα(信号调控蛋白α)药剂的预先治疗。在一些实施方案中，个体没有已知的活性病毒感染，包括乙型和丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(hiv)、获得性免疫缺陷综合征(aids)相关疾病或sars-cov-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)。在一些实施方案中，融合多肽以高达约60mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，融合多肽每四周一次(q4w)以约60mg/kg的剂量施用。
13.在一些实施方案中，低甲基化剂是阿扎胞苷、地西他滨(decitabine)、5-氟-2
′‑
脱氧胞苷、泽布拉林(zebularine)、cp-4200、rg108、七尾霉素a(nanaomycin a)、瓜地西他滨(guadecitabine)、rx-3117、epi01、安卓奎诺尔(antroquinonol)、cc-486或astx727。在一些实施方案中，低甲基化剂是阿扎胞苷。在一些实施方案中，阿扎胞苷在一个或多个28天的周期中施用于个体，并且其中阿扎胞苷在每个28天周期的7天中以每天75mg/m2的剂量施用于个体。在一些实施方案中，阿扎胞苷在一个或多个28天周期中施用于个体，并且其中阿扎胞苷在每个28天周期期间以每天75mg/m2的剂量施用于个体，持续5天，随后2天不施用阿扎胞苷，然后以75mg/m2的剂量施用于个体，持续额外2天。在一些实施方案中，静脉内或皮下施用阿扎胞苷。
14.在一些实施方案中，bcl-2抑制剂是维奈托克(venetoclax)、abt-737、纳维托克(navitoclax)、bcl201或azd-0466。在一些实施方案中，bcl-2抑制剂是维奈托克。在一些实施方案中，维奈托克在第1天以100mg的剂量施用，在第2天以200mg的剂量施用，并且在第2天后以每天400mg的剂量施用。在一些实施方案中，维奈托克在第1天以100mg的剂量施用，在第2天以200mg的剂量施用，在第3天以400mg的剂量施用，并且在第3天后以每天600mg的剂量施用。在一些实施方案中，口服施用维奈托克。
15.在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的癌症的方法，其包括向所述个体施用有效量的包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体的融合多肽，其中sirpαd1结构域变体的c末端与fc结构域变体的n末端融合，并且其中融合多肽以约60mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，融合多肽以约60mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，其中融合多肽每4周一次(q4w)以约60mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，融合多肽以约45mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，融合多肽每3周一次(q3w)以约45mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。
16.在一些实施方案中，融合多肽的sirpαd1结构域变体包含seq id no:81或seq id no:85的氨基酸序列；并且融合多肽的fc结构域变体是(i)包含l234a、l235a、g237a和n297a突变的人igg1 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(ii)包含a330s、p331s和n297a突变的人igg2 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(iii)包含s228p、e233p、f234v、l235a和delg236突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；或(iv)包含s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引。
17.在本文提供的方法中的任一种的一些实施方案中，sirpαd1结构域变体包含seq id no:85的氨基酸序列。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体包含seq id no:81的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc结构域变体是包含l234a、l235a、g237a和n297a突变的人
igg1 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引。在一些实施方案中，fc结构域变体包含seq id no:91的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合多肽包含seq id no:136的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合多肽包含seq id no:135的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合多肽形成同二聚体。在一些实施方案中，静脉内施用融合多肽。在一些实施方案中，个体是人。
18.在一些实施方案中，提供了一种包括在药学上可接受的载体中的融合多肽的试剂盒，其用于与阿扎胞苷联合用于治疗有此需要的个体的癌症，其中所述融合多肽包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体，其中sirpαd1结构域变体的c末端与fc结构域变体的n末端融合，其中sirpαd1结构域变体包含seq id no:81或seq id no:85的氨基酸序列；其中fc结构域变体是(i)包含l234a、l235a、g237a和n297a突变的人igg1 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(ii)包含a330s、p331s和n297a突变的人igg2 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(iii)包含s228p、e233p、f234v、l235a和delg236突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；或(iv)包含s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；并且其中所述个体是人。在一些实施方案中，癌症是骨髓增生异常综合征(mds)或急性髓性白血病(aml)。在一些实施方案中，癌症是mds。在一些实施方案中，mds是较高风险的mds。
19.在一些实施方案中，提供了一种包括在药学上可接受的载体中的融合多肽的试剂盒，其用于与阿扎胞苷和维奈托克联合用于治疗有此需要的个体的癌症，其中融合多肽包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体，其中sirpαd1结构域变体的c末端与fc结构域变体的n末端融合，其中sirpαd1结构域变体包含seq id no:81或seq id no:85的氨基酸序列；其中fc结构域变体是(i)包含l234a、l235a、g237a和n297a突变的人igg1 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(ii)包含a330s、p331s和n297a突变的人igg2 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(iii)包含s228p、e233p、f234v、l235a和delg236突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；或(iv)包含s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；并且其中所述个体是人。在一些实施方案中，癌症是aml。
20.在一些实施方案中，试剂盒还包括用于在一个或多个28天周期中通过iv输注或皮下施用阿扎胞苷的说明书，其中阿扎胞苷在每个28天周期的7天中以每天75mg/m2的剂量施用于个体。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于在一个或多个28天周期中通过iv输注或皮下施用阿扎胞苷的说明书，其中阿扎胞苷在每个28天周期期间以每天75mg/m2的剂量施用于个体，持续5天，随后2天不施用阿扎胞苷，然后以75mg/m2的剂量施用于个体，持续额外2天。
21.在一些实施方案中，试剂盒还包括用于以在第1天100mg、第2天200mg和在第2天后每天400mg的剂量口服施用维奈托克的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于以在第1天100mg、在第2天200mg、在第3天400mg和在第3天后每天600mg的剂量口服施用维奈托克的说明书。
22.在试剂盒的一些实施方案中，sirpαd1结构域变体包含seq id no:85的氨基酸序列。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体包含seq id no:81的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc结构域变体是包含l234a、l235a、g237a和n297a突变的人igg1 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引。在一些实施方案中，fc结构域变体包含seq id no:91的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合多肽包含seq id no:136的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合多肽包含seq id no:135的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合多肽形成同二聚体。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于以高达60mg/kg的剂量向个体施用融合多肽的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于每四周一次(q4w)以60mg/kg的剂量向个体施用融合多肽的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于通过iv输注施用融合多肽的说明书。
附图说明
23.图1a提供了对药物a、阿扎胞苷和药物a 阿扎胞苷对巨噬细胞吞噬人hl60细胞的影响进行评估的实验的结果。图1b提供了来自对药物a、阿扎胞苷和药物a 阿扎胞苷对巨噬细胞吞噬人oci-aml3细胞的影响进行评估的实验的结果。
24.图2提供了对药物a、阿扎胞苷和药物a 阿扎胞苷对人外周血单核细胞(pbmc)培养物中cd11c
树突细胞存活力的影响进行评估的实验的结果。
25.图3a提供了对阿扎胞苷对hl60、oci-aml3和mv4-11人急性髓性白血病细胞系表面上的钙网蛋白表达的影响进行评估的体外实验的结果。图3b提供了对阿扎胞苷或维奈托克对mv4-11人急性髓性白血病细胞系和来自2名人供体的原代aml母细胞的表面上的钙网蛋白表达的影响进行评估的体外实验的结果。图3c提供了对阿扎胞苷或维奈托克对mv4-11人急性髓性白血病细胞系和来自2名人供体的原代aml母细胞的表面上的cd47表达的影响进行评估的体外实验的结果。
26.图4a提供了对药物a、阿扎胞苷和药物a 阿扎胞苷对携带hl60肿瘤异种移植物的小鼠中的肿瘤生长的影响进行评估的实验的结果。图4b提供了对药物a、阿扎胞苷和药物a 阿扎胞苷对携带oci-aml3肿瘤异种移植物的小鼠中的肿瘤生长的影响进行评估的实验的结果。图4c提供了对药物a、阿扎胞苷和药物a 阿扎胞苷对携带mv4-11肿瘤异种移植物的小鼠中的肿瘤生长的影响进行评估的实验的结果。图4d显示了每个治疗组中显示肿瘤消退的mv4-11异种移植小鼠的数量。
27.图5a提供了来自对药物a、阿扎胞苷和药物a 阿扎胞苷对经由尾静脉注射以7.5e6个细胞/小鼠的浓度移植有hl60-luc2的小鼠中的肿瘤生长的影响进行评估的实验的结果。图5b提供了关于在接种后第3天、第8天、第11天、第14天、第18天和第22天成像的小鼠中总通量(发光)相对时间(即，肿瘤大小相对时间)的数据。治疗在iv接种后第4天开始。图5c提供了对药物a、阿扎胞苷或药物a 阿扎胞苷直到第147天研究终止对移植有hl60-luc2的小鼠中的肿瘤生长的影响进行评估的实验的结果。图5d提供了对药物a单一疗法(例如，维持疗法)对已经接受14剂药物a 阿扎胞苷(例如，诱导疗法)的移植有hl60-luc2的小鼠中的肿瘤生长的影响进行评估的实验的结果。
28.图6a提供了对药物a、阿扎胞苷、维奈托克、阿扎胞苷 维奈托克或药物a 阿扎胞苷 维奈托克对经由尾静脉注射以10
×
106个细胞/小鼠的浓度移植有hl60-luc2的小鼠中的肿瘤生长的影响进行评估的实验的结果。图6b显示了接受用pbs(对照)、阿扎胞苷、维奈托克、药物a、阿扎胞苷 维奈托克或阿扎胞苷 维奈托克 药物a治疗的携带异种移植的人hl-60luc2肿瘤的小鼠的存活机率(以天计)。
29.图7a提供了对药物a、阿扎胞苷和药物a 阿扎胞苷对人单核细胞来源的巨噬细胞吞噬aml细胞的影响进行评估的实验的结果。图7b提供了对药物a、维奈托克和药物a 维奈
托克对人单核细胞来源的巨噬细胞吞噬aml细胞的影响进行评估的实验的结果。
30.图8提供了对药物a、维奈托克或药物a 维奈托克在80天的评估期内对移植有hl60-luc2的小鼠中的肿瘤生长的影响进行评估的实验的结果。
具体实施方式
31.以下描述阐述了示例性方法、参数等。然而，应该认识到，这种描述并不旨在限制本公开的范围，而是作为示例性实施方案的描述来提供。
32.定义
33.术语“约”或“大约”是指由本领域普通技术人员确定的特定值在可接受的误差范围内，这部分取决于如何测量或确定所述值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或多于1个标准偏差内。替代地，“约”可以表示给定值的高达20％、高达10％、高达5％或高达1％的范围。替代地，特别是就生物系统或过程而言，所述术语可以表示在一个数量级内，优选在一个值的5倍内，并且更优选在2倍内。当在申请和权利要求中描述特定值时，除非另有说明，否则术语“约”应被认为是指特定值在可接受的误差范围内。
34.本文使用的术语仅仅是为了描述特定的情况的目的，而不旨在进行限制。如本文所使用，单数形式“一(a/an)”和“所述”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指出。此外，就详细描述或权利要求中使用的术语“包括(including/includes)”、“具有(having/has/with)”或其变体而言，这些术语旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式包括在内。
35.如本文所使用，术语“治疗(treatment/treating)”等是指为了获得效果的目的而施用药剂或实施外科手术。在一些实施方案中，就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述效果是预防性的。在一些实施方案中，就影响疾病或疾病症状的部分或完全治愈而言，所述效果是治疗性的。
36.如本文所使用，术语“接头”指两个元件(例如蛋白质结构域)之间的连接。在一些实施方案中，接头可以是共价键或间隔区。术语“间隔区”指出现在两个多肽或多肽结构域之间的部分(例如，聚乙二醇(peg)聚合物)或氨基酸序列(例如，1-200个氨基酸序列)，以在两个多肽或多肽结构域之间提供空间或柔性(或空间和柔性两者)。在一些实施方案中，氨基酸间隔区是多肽一级序列的部分(例如，经由多肽主链连接到间隔的多肽或多肽结构域)。
37.如本文所使用，术语“有效量”是指在治疗患有诸如癌症(例如，实体瘤或血液癌)的疾病的患者时，足以并有效实现所需治疗效果的多肽或含有本文所述多肽(例如，具有sirpαd1结构域的多肽或其变体)的药物组合物的量。在一些实施方案中，有效量的多肽将避免不利的副作用。
38.如本文所使用，术语“药物组合物”是指包括活性成分以及赋形剂或稀释剂(或赋形剂和稀释剂两者)并能使活性成分通过合适的施用方法施用的医学或药物配方。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包括与多肽相容的药学上可接受的组分。在一些实施方案中，药物组合物呈用于口服施用的片剂或胶囊形式，或呈用于静脉内或皮下施用(例如通过注射)的水性形式。
39.如本文所使用，术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用，指脊椎动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于老鼠、猿猴、人类、家畜、运动动物和宠物。还涵盖体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。这些术语都不需要医疗专业人员的监督。
40.如本文所使用，术语“亲和力”或“结合亲和力”是指两个分子之间的结合相互作用的强度。通常，结合亲和力指分子与其结合配偶体(诸如sirpαd1结构域变体和cd47)之间的非共价相互作用的总和强度。除非另有说明，否则结合亲和力是指固有的结合亲和力，其反映结合对成员之间的1:1相互作用。两个分子之间的结合亲和力通常用解离常数(kd)或缔合常数(ka)来描述。对彼此具有低结合亲和力的两个分子通常结合缓慢，易于解离，并且表现出大的kd。对彼此具有高亲和力的两个分子通常容易结合，倾向于保持结合更长时间，并且表现出小的kd。在一些实施方案中，使用已知的方法和技术(例如，表面等离子体共振(spr))来确定两个相互作用的分子的kd。kd可以计算为koff/kon的比率。
41.如本文所使用，术语“kd小于”是指数值上更小的kd值和相对于所述kd值增加的结合亲和力。如本文所使用，术语“kd大于”是指数值上更大的kd值和相对于所述kd值降低的结合亲和力。
42.如本文所使用，“结合”是指除了一种治疗方式以外，还施用另一种治疗方式。因此，“结合”是指在对个体施用一种治疗方案之前、期间或之后施用另一种治疗方案。
43.概述
44.本文提供了治疗个体(例如，人个体)的癌症(例如，骨髓癌，诸如骨髓增生异常综合征(“mds”))的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的(a)阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂，和(b)低甲基化剂。在一些实施方案中，提供了治疗急性髓性白血病(“aml”)的方法。
45.在一些实施方案中，阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂是cd47-sirpa途径的小分子抑制剂(例如，rrx-001和其他物)。参见例如，miller等人(2019)“quantitative high-throughput screening assays for the discovery and development of sirpα-cd47 interaction inhibitors.”plos one 14(7):e0218897和sasikumar等人acr-nci-eortc international conference:molecular targets and cancer therapeutics；october 26-30,2017；philadelphia,pa；abstract b007。
46.在一些实施方案中，阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂结合cd47(例如，hcd47)。在一些实施方案中，所述药剂以约10nm或更好(诸如至少约9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、3nm、2nm、1nm、750pm、500pm、250pm、200pm、100pm、50pm、25pm、20pm、10pm或小于10pm中的任何一种)的kd结合cd47(例如，hcd47)。在一些实施方案中，结合cd47(例如，hcd47)的药剂在人类受试者中表现出至少约50％的cd47受体占有率(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或约100％中的任何一种)。在一些实施方案中，结合cd47(例如，hcd47)的药剂具有约80ng/ml或更低，例如约75ng/ml、70ng/ml、65ng/ml、60ng/ml、55ng/ml、50ng/ml、45ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml或5ng/ml中的任何一种的ec50。在一些实施方案中，结合cd47(例如，hcd47)的药剂是抗cd47抗体(例如，治疗性抗cd47抗体)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段是fab、fab’、fab
’‑
sh、f(ab’)2、fv、scfv、单臂抗体或双价抗体(diabody)。在一些实施方案中，抗cd47抗体是单特异性抗体。在一些实施方案
中，抗cd47抗体是多特异性(例如，双特异性)抗体。在一些实施方案中，术语“抗cd47抗体”涵盖基于抗体的构建体(诸如多特异性构建体)，包括但不限于三功能抗体(triomab)、dart(即，双亲和力再靶向抗体)、tandab(即，串联双价抗体)、串联scfv、crossmab、dnl(即，停靠和锁定抗体)、dvd-ig(即，双可变结构域免疫球蛋白)、四价双特异性igg、纳米抗体、双靶向结构域和art-ig(即，不对称再造技术-免疫球蛋白)。关于示例性抗体构建体(单特异性和多特异性两者)的额外细节提供于husain等人(2018)biodrugs 32(5):441-464和spiess等人(2015)molecular immunology 67(2):95-106中。在一些实施方案中，抗cd47抗体是hu5f9-g4、b6h12.2、bric126、cc-90002、srf231或ibi188(来自innovent biologics)(关于这些抗cd47抗体的额外信息，参见例如zhao等人(2011),pnas usa 108:18342-18347；chao等人(2010)cell 142:699-713；kim等人(2012)leukemia 26:2538-2545；chao等人(2011)blood 118:4890-4891；goto等人(2014)eur j.cancer 50:1836-1846；和edris等人(2012)pnas usa 109:6656-61)。
47.在一些实施方案中，阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂结合sirpα(例如，hsirpα)。在一些实施方案中，所述药剂以约10nm或更好(诸如至少约9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、3nm、2nm、1nm、750pm、500pm、250pm、200pm、100pm、50pm、25pm、20pm、10pm或小于10pm中的任何一种)的kd结合sirpα(例如，hsirpα)。在一些实施方案中，结合sirpα(例如，hsirpα)的药剂在人类受试者中表现出至少约50％的sirpα受体占有率(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或约100％中的任何一种)。在一些实施方案中，结合sirpα(例如，hsirpα)的药剂具有约80ng/ml或更低，例如约75ng/ml、70ng/ml、65ng/ml、60ng/ml、55ng/ml、50ng/ml、45ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml或5ng/ml中的任何一种的ec50。在一些实施方案中，结合sirpα(例如，hsirpα)的药剂是抗sirpα抗体(例如，治疗性抗sirpα抗体)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段是fab、fab’、fab
’‑
sh、f(ab’)2、fv、scfv、单臂抗体或双价抗体(diabody)。在一些实施方案中，抗sirpα抗体是单特异性抗体或单特异性抗体构建体(包括但不限于上述那些)。在一些实施方案中，抗sirpα抗体是多特异性(例如，双特异性)抗体或多特异性抗体构建体(包括但不限于上述那些)。在一些实施方案中，抗sirpα抗体是kwar23、se12c3，040或my-1(关于这些抗sirpα抗体的额外信息，参见例如ring等人(2017)pnas usa 114(49):e10578-e10585)；murata等人(2018)cancer sci 109(5):1300-1308；和yanigata等人(2017)jci insight 2:e89140)。在一些实施方案中，抗sirpα抗体是wo 2018/057669、us-2018-0105600-a1、us20180312587、wo2018107058、wo2019023347、us20180037652、wo2018210795、wo2017178653、wo2018149938、wo2017068164和wo2016063233中描述的抗体，其内容通过引用整体并入本文。
48.在一些实施方案中，阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂是抗sirpβ抗体或抗sirpγ抗体(例如，能够结合sirpα的抗sirpβ抗体或抗sirpγ抗体)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述药剂是能够结合sirpα、sirpβ和sirpγ中的两种或更多种的抗体(或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，此类抗体以约10nm或更好(诸如至少约9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、3nm、2nm、1nm、750pm、500pm、250pm、200pm、100pm、50pm、25pm、20pm、10pm或小于10pm中的任何一种)的kd结合sirpα(例如，hsirpα)。在一些实施方案中，抗体在人类受试者中表现出至少约50％的sirpα受体占有率(例如，至少约50％、
55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或约100％中的任何一种)。在一些实施方案中，抗体具有约80ng/ml或更低，例如约75ng/ml、70ng/ml、65ng/ml、60ng/ml、55ng/ml、50ng/ml、45ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml或5ng/ml中的任何一种的ec50。在一些实施方案中，抗原结合片段是fab、fab’、fab
’‑
sh、f(ab’)2、fv、scfv、单臂抗体或双价抗体。在一些实施方案中，抗体是单特异性抗体或单特异性抗体构建体(包括但不限于上述那些)。在一些实施方案中，抗体是多特异性(例如，双特异性)抗体或多特异性抗体构建体(包括但不限于上述那些)。
49.在一些实施方案中，阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂是包含结合cd47的部分的融合多肽。在一些实施方案中，融合多肽包含抗体fc区和结合cd47的部分。在一些实施方案中，结合cd47(例如，hcd47)的融合多肽的部分以约10nm或更好(诸如至少约9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、3nm、2nm、1nm、750pm、500pm、250pm、200pm、100pm、50pm、25pm、20pm、10pm或小于10pm中的任何一种)的kd结合cd47(例如，hcd47)在一些实施方案中，融合多肽在人类受试者中表现出至少约50％的cd47受体占有率(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或约100％中的任何一种)。在一些实施方案中，融合多肽具有约80ng/ml或更低，例如约75ng/ml、70ng/ml、65ng/ml、60ng/ml、55ng/ml、50ng/ml、45ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml或5ng/ml中的任一种的ec50。在一些实施方案中，融合多肽包含wt人抗体fc区。在一些实施方案中，融合多肽包含fc变体(例如，wt人抗体fc区的变体)，其与wt fc区相比表现出降低的(例如，诸如消除的)效应子功能。示例性的fc变体描述于wo 2017/027422和us 2017/0107270中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，结合cd47(例如hcd47)的部分是wt sirpα(例如，hsirpα)或wt sirpγ(例如，hsirpγ)。在一些实施方案中，结合cd47(例如，hcd47)的部分是wt sirpα(例如，hsirpα)或wt sirpγ(例如，hsirpγ)的cd47结合片段(例如，d1结构域)。在一些实施方案中，结合cd47(例如hcd47)的部分是sirpα变体、sirpγ变体、sirpβ变体或其cd47结合片段(例如，d1结构域)。示例性的sirpγ变体、sirpβ1变体和sirpβ2变体描述于例如wo 2013/109752、us 2015/0071905、usp 9,944,911、wo 2016/023040、wo 2017/027422、us 2017/0107270、usp 10,259,859、us 9845345、wo 2016187226、us 20180155405、wo 2017177333、wo 2014094122、us 2015329616、us 20180312563、wo 2018176132、wo 2018081898、wo 2018081897、pct/us 2019/048921、us 20180141986a1和ep 3287470a1，其内容通过引用整体并入本文。
50.在一些实施方案中，阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂是包含抗体fc区和sirpα变体的融合多肽。在一些实施方案中，sirpα变体以约10nm或更好(诸如至少约9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、3nm、2nm、1nm、750pm、500pm、250pm、200pm、100pm、50pm、25pm、20pm、10pm或小于10pm中的任何一种)的kd结合cd47(例如，hcd47)。在一些实施方案中，融合多肽在人类受试者中表现出至少约50％的cd47受体占有率(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或约100％中的任何一种)。在一些实施方案中，融合多肽具有约80ng/ml或更低，例如约75ng/ml、70ng/ml、65ng/ml、60ng/ml、55ng/ml、50ng/ml、45ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml或5ng/ml中的任一种的ec50。在一些实施方案中，融合多肽包含wt人抗体fc区。在一些实施方案中，融合多肽包含fc变体(例如，wt人抗体fc区的变体)，其与wt fc区
相比表现出降低的(例如，诸如消除的)效应子功能，诸如本文引用的参考文献中所述的那些。在一些实施方案中，融合多肽包含描述于wo 2013/109752、us2015/0071905、wo 2016/023040、wo 2017/027422、us 2017/0107270、usp 10,259,859、us 9845345、wo 2016187226、us 20180155405、wo 2017177333、wo 2014094122、us 2015329616、us20180312563、wo 2018176132、wo 2018081898、wo 2018081897、us 20180141986a1和ep 3287470a1中的sirpα变体，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，包含抗体fc区和sirpα变体的融合多肽是tti-621、tti-622或imm01(参见例如，petrova等人(2017)clin cancer res 23:1086-1079；russ等人(2018)bloodrev s0268-960x(17)30093-0；zhang,x,chen,w,fan,j等人disrupting cd47-sirpαaxis alone or combined with autophagy depletion for the therapy of glioblastoma.carcinogenesis 2018；39:689
–
99)。
51.在一些实施方案中，阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂是融合多肽，其包含sirpαd1结构域变体(例如，本文所述的sirpαd1结构域变体)和fc结构域变体(例如，本文所述的fc结构域变体)。
52.下文描述了关于用包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体的多肽进行治疗的方法的另外细节。也参见wo 2017/027422和美国专利第10,259,859号，其各自的内容通过引用整体并入本文。
53.本文还提供了治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体的多肽(例如，融合多肽)，其中所述多肽每四周一次(q4w)以约60mg/kg的剂量施用。本文还提供了治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体的多肽(例如，融合多肽)，其中所述多肽每三周一次(q3w)以约45mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，融合多肽与至少一种额外抗癌剂联合施用。
54.信号调控蛋白α(sirpα)d1结构域及其变体
55.在一些实施方案中，本文公开了包含信号调控蛋白α(sirp-α)d1变体的多肽，所述变体包含sirpαd1结构域或其片段，其包含相对于野生型sirpαd1结构域(例如，seq id no:1或2中所示的野生型sirpαd1结构域)在残基80处的氨基酸突变；和相对于野生型sirpαd1结构域(例如，seq id no:1或2中所示的野生型sirpαd1结构域)在选自由以下组成的组的残基处的至少一个额外氨基酸突变：残基6、残基27、残基31、残基47、残基53、残基54、残基56、残基66和残基92。
56.在一些实施方案中，本文还公开了包含fc结构域变体的多肽，其中fc结构域变体二聚体包含两个fc结构域变体，其中每个fc结构域变体独立地选自(i)由突变l234a、l235a、g237a和n297a组成的人igg1 fc区；(ii)由突变a330s、p331s和n297a组成的人igg2fc区；或(iii)包含突变s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a的人igg4 fc区。
57.信号调控蛋白α(“sirp-α”或“sirp-alpha”)是属于广泛表达于骨髓细胞膜上的ig超家族的跨膜糖蛋白。sirpα与cd47相互作用，cd47是一种广泛表达于体内许多细胞类型上的蛋白质。sirpα与cd47的相互作用阻止了“自身”细胞的吞噬，否则“自身”细胞可以被免疫系统识别。已经观察到，在急性髓性白血病和几种实体瘤癌症中，肿瘤细胞上cd47的高表达可以作为存活的负预后因素。
58.天然sirpα包含3个高度同源的免疫球蛋白(ig)样胞外结构域：d1、d2和d3。sirpαd1结构域(“d1结构域”)是指sirpα的膜远端胞外结构域并介导sirpα与cd47的结合。如本文所使用，术语“sirpα多肽”是指能够结合至cd47的任何sirpα多肽或其片段。野生型人类sirpα至少有十种变体。表1显示了天然存在的野生型人sirpαd1结构域变体(seq id no:1和2)的d1结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，sirpα多肽包含sirpαd1结构域。在一些实施方案中，sirpα多肽包含野生型d1结构域，诸如seq id no:1和2中提供的那些。在一些实施方案中，sirpα多肽包括野生型人sirpα的d2或d3结构域(或d2和d3结构域两者)(参见表3)。
59.表1.野生型sirpαd1结构域的序列
[0060][0061][0062]
如本文所使用，术语“sirpαd1结构域变体”是指包含sirpαd1结构域或sirpα多肽的cd47结合部分的多肽，其对cd47的亲和力高于野生型sirpα。相对于野生型sirpα，sirpα
d1结构域变体包含至少一个氨基酸取代、缺失或插入(或其组合)。
[0063]
在一些实施方案中，本文公开的sirpαd1结构域变体包含sirpαd1结构域或其变体。在一些实施方案中，相对于seq id no:1和2中所示的野生型d1结构域，sirpαd1结构域变体包含一个或多个氨基酸取代、插入、添加或缺失。表2列出了每个sirpαd1结构域变体(seq id no:13-14)中的示例性氨基酸取代。在一些实施方案中，sirpαd1结构域多肽或sirpαd1结构域变体包含d1结构域的片段。在一些实施方案中，sirpα多肽片段或sirpαd1结构域变体片段包含长度小于10个氨基酸、长度约10个氨基酸、长度约20个氨基酸、长度约30个氨基酸、长度约40个氨基酸、长度约50个氨基酸、长度约60个氨基酸、长度约70个氨基酸、长度约80个氨基酸、长度约90个氨基酸、长度约100个氨基酸或长度超过约100个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，sirpαd1结构域片段保留了结合cd47的能力。
[0064]
在一些实施方案中，包含sirpαd1结构域变体的本公开多肽与cd47的结合亲和力高于野生型人sirpαd1结构域。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体以比天然存在的d1结构域的亲和力至少1倍(例如，至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍或大于5倍)的亲和力结合至人cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体以比天然存在的d1结构域的亲和力至少1倍(例如，至少10倍、100倍、1000倍或大于1000倍)的亲和力结合至人cd47。
[0065]
如本文所使用，术语“优化的亲和力”或“优化的结合亲和力”是指本文公开的多肽(包括sirpαd1结构域变体)与cd47之间的结合相互作用的优化强度。例如，在一些实施方案中，多肽主要或以较高的亲和力结合至癌细胞上的cd47，并且基本上不结合或以较低的亲和力结合至非癌细胞上的cd47。在一些实施方案中，多肽与cd47之间的结合亲和力被优化，使得与以最大亲和力结合的变体相比，相互作用不会引起临床相关的毒性或降低毒性。在一些实施方案中，为了在本文提供的多肽与cd47之间实现优化的结合亲和力，包括sirpαd1结构域变体的多肽被开发成具有比最大可实现的结合亲和力更低的与cd47的结合亲和力。在一些实施方案中，本文公开的sirpαd1结构域变体与啮齿动物、非人灵长类动物(nhp)和人cd47交叉反应。
[0066]
如本文所使用，术语“免疫原性”是指蛋白质(例如，治疗性蛋白质)的特性，其在宿主中引起免疫响应，如同其是外源抗原一样。蛋白质的免疫原性可以用多种不同的方式，诸如通过体外t细胞增殖测定。
[0067]
如本文所使用，术语“最小免疫原性”是指比引入氨基酸取代之前的免疫原性(例如，未修饰的蛋白质)低(例如，至少低10％、25％、50％或100％)的例如通过氨基酸取代而被修饰的蛋白质(例如，治疗性蛋白质)的免疫原性。在一些实施方案中，蛋白质(例如，治疗性蛋白质)被修饰成具有最小的免疫原性，并且不引起或引起非常小的宿主免疫响应，即使其是外源抗原。
[0068]
在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体表现出最小的免疫原性。在一些实施方案中，除了增加sirpαd1结构域变体的亲和力的氨基酸变化以外，施用于受试者的本公开的sirpα多肽具有与受试者的生物样品中的sirpα多肽相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，与抗cd47抗体或野生型sirpα相比，本文公开的多肽变体降低了副作用的风险。在一些实施方案中，与抗cd47抗体或野生型sirpα相比，本文公开的多肽变体降低了贫血的风险。在一些实施方案中，本文公开的多肽变体不会在啮齿类动物或非人类灵长类动物(nhp)研究中引起急性贫血。
[0069]
表2列出了相对于每个d1结构域序列sirpαd1结构域变体中的特定氨基酸取代。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体包括表2中所列的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或更多个)取代。在一些实施方案中，相对于野生型d1结构域，sirpαd1结构域变体包含至多十四个氨基酸取代。在一些实施方案中，相对于野生型d1结构域，sirpαd1结构域变体包含至多十个氨基酸取代。在一些实施方案中，相对于野生型d1结构域，sirpαd1结构域变体包含至多七个氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开的sirpαd1结构域变体与野生型d1结构域的序列具有至少90％(例如，至少92％，95％，97％或大于97％)的氨基酸序列同一性。
[0070]
在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体是嵌合的sirpαd1结构域变体，其包括两个或更多个野生型d1结构域或其变体的一部分(例如，一个野生型d1结构域或其变体的一部分和另一个野生型d1结构域或其变体的一部分)。在一些实施方案中，嵌合sirpαd1结构域变体包括野生型d1结构域或其变体的至少两个部分(例如，三个、四个、五个或更多个部分)，其中每个部分来自不同的野生型d1结构域。在一些实施方案中，嵌合sirpαd1结构域变体还包括表2中列出的一个或多个氨基酸取代。
[0071]
表2.sirpαd1结构域变体中的氨基酸取代
[0072][0073]
在一些实施方案中，多肽包含sirpαd1结构域变体，其包含以下的序列：eeex1qx2iqpdksvlvaagetx3tlrctx4tslx5pvgpi qwfrgagpgrx6liynqx7x8gx9fprvttvsdx
10
tx
11
rnnmdfsi rignitpadagtyycx
12
kx
13
rkgspddvex
14
ksgagtelsvrakps(seq id no:13)，其中x1是l、i或v；x2是v、l或i；x3是a或v；x4是a、i或l；x5是i、t、s或f；x6是e、v或l；x7是k或r；x8是e或q；x9是h、p或r；x
10
是l、t或g；x
11
是k或r；x
12
是v或i；x
13
是f、l或v；并且x
14
是f或v；并且其中所述变体相对于包含seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少一个氨基酸取代。
[0074]
在一些实施方案中，多肽包含sirpαd1结构域变体，其包含seq id no:13的序列，其中x1是l、i或v。在前述实施方案中的任何一个中，x2是v、l或i。在一些实施方案中，x3是a或v。在一些实施方案中，x4是a、i或l。在一些实施方案中，x5是i、t、s或f。在一些实施方案
中，x6是e、v或l。在一些实施方案中，x7是k或r。在一些实施方案中，x8是e或q。在一些实施方案中，x9是h、p或r。在一些实施方案中，x
10
是l、t或g。在一些实施方案中，x
11
是k或r。在一些实施方案中，x
12
是v或i。在一些实施方案中，x
13
是f、l、v。在一些实施方案中，x
14
是f或v。在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于包含seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过六个氨基酸取代。
[0075]
在一些实施方案中，多肽以比包含seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少10倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比包含seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少100倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比包含seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少1000倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段小于1x10-8
m、小于5x10-9
m、小于1x10-9
m、小于5x10-10
m、小于1x10-10
m或小于1x10-11
的kd结合至cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以约500nm与100nm之间、约100nm与50nm之间、约50nm与10nm之间、约10nm与5nm之间、约5nm与1nm之间、约1nm与500pm之间、约500pm与100pm之间、约100pm与50pm之间或约50pm与10pm之间的kd结合至cd47。
[0076]
在一些实施方案中，多肽包括sirpαd1结构域变体，其包含以下的序列：eeex1qx2iqpdksvsvaagesx3ilhctx4tslx5pvgpiqwfrgagparx6liynqx7x8gx9fprvttvsex
10
tx
11
renmdfsisisnitpadagtyycx
12
kx
13
rkgspdtex
14
ksgagtelsvrakps(seq id no:14)，其中x1是l、i或v；x2是v、l或i；x3是a或v；x4是v、i或l；x5是i、t、s或f；x6是e、v或l；x7是k或r；x8是e或q；x9是h、p或r；x
10
是s、t或g；x
11
是k或r；x
12
是v或i；x
13
是f、l或v；并且x
14
是f或v；并且其中所述变体相对于包含seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少一个氨基酸取代。
[0077]
在本公开的这个方面中的一些实施方案中，多肽包含seq id no:14的序列，其中x1是l、i或v。在一些实施方案中，x2是v、l或i。在一些实施方案中，x3是a或v。在一些实施方案中，x4是v、i或l。在一些实施方案中，x5是i、t、s或f。在一些实施方案中，x6是e、v或l。在一些实施方案中，x7是k或r。在一些实施方案中，x8是e或q。在一些实施方案中，x9是h、p或r。在一些实施方案中，x
10
是s、t或g。在一些实施方案中，x
11
是k或r。在一些实施方案中，x
12
是v或i。在一些实施方案中，x
13
是f、l或v。在一些实施方案中，x
14
是f或v。在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于包含seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过六个氨基酸取代。
[0078]
在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少10倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少100倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少1000倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以小于1x10-8
m、小于5x10-9
m、小于1x10-9
m、小于5x10-10
m、小于1x10-10
m或小于1x10-11
m的kd结合至cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以约500nm与100nm之间、约100nm与50nm之间、约50nm与10nm之间、约10nm与5nm之间、约5nm与1nm之间、约1nm与500pm之间、约500pm与100pm之间、约100pm与50pm之间或约50pm与10pm之间的kd结合至cd47。
[0079]
在一些实施方案中，多肽包括sirpαd1结构域变体，其具有以下的序列：eex1x2qx3iqpdkx4vx5vaagex6x7x8lx9ctx
10
tslx
11
pvgpiqwfrgagpx
12
rx
13
liynqx
14
x
15
gx
16
fprvttvsx
17
x
18
tx
19
rx
20
nmdfx
21
ix
22
ix
23
nitpadagtyycx
24
kx
25
rkgspdx
26
x
27
ex
28
ksgagtelsvrx
29
kps(seq id no:23)，其中x1是e或g；x2是l、i或v；x3是v、l或i；x4是s或f；x5是l或s；x6是s或t；x7是a或v；x8是i或t；x9是h或r；x
10
是a、v、i或l；x
11
是i、t、s或f；x
12
是a或g；x
13
是e、v或l；x
14
是k或r；x
15
是e或q；x
16
是h、p或r；x
17
是d或e；x
18
是s、l、t或g；x
19
是k或r；x
20
是e或d；x
21
是s或p；x
22
是s或r；x
23
是s或g；x
24
是v或i；x
25
是f、l、v；x
26
是d或不存在；x
27
是t或v；x
28
是f或v；并且x
29
是a或g；并且其中所述变体相对于具有seq id no:1或2的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少一个氨基酸取代。
[0080]
在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x2是l、i或v。在前述实施方案中的任一个中，x3是v、l或i。在实施方案中中，x4是s或f。在一些实施方案中，x5是l或s。在一些实施方案中，x6是s或t。在一些实施方案中，x7是a或v。在一些实施方案中，x8是i或t。在一些实施方案中，x9是h或r。在一些实施方案中，x
10
是a、v、i或l。在一些实施方案中，x
11
是i、t、s或f。在一些实施方案中，x
12
是a或g。在一些实施方案中，x
13
是e、v或l。在一些实施方案中，x
14
是k或r。在一些实施方案中，x
15
是e或q。在一些实施方案中，x
16
是h、p或r。在一些实施方案中，x
17
是d或e。在一些实施方案中，x
18
是s、l、t或g。在一些实施方案中，x
19
是k或r。在一些实施方案中，x
20
是e或d。在一些实施方案中，x
21
是s或p。在一些实施方案中，x
22
是s或r。在一些实施方案中，x
23
是s或g。在一些实施方案中，x
24
是v或i。在一些实施方案中，x
25
是f、l、v。在一些实施方案中，x
26
是d或不存在。在一些实施方案中，x
27
是t或v。在一些实施方案中，x
28
是f或v。在一些实施方案中，x
29
是a或g。在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:1或2的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过六个氨基酸取代。
[0081]
在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1或2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少10倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1或2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少100倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1或2的序列的野生型sirpαd1结构域的结合亲和力高至少1000倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以小于1x10-8
m、小于5x10-9
m、小于1x10-9
m、小于5x10-10
m、小于1x10-10
m或小于1x10-11
m的kd结合至cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以约500nm与100nm之间、约100nm与50nm之间、约50nm与10nm之间、约10nm与5nm之间、约5nm与1nm之间、约1nm与500pm之间、约500pm与100pm之间、约100pm与50pm之间或约50pm与10pm之间的kd结合至cd47。
[0082]
在一些实施方案中，包括sirpαd1结构域变体的本公开多还包含野生型人sirpα的具有seq id no:24的序列的d2结构域、具有seq id no:25的序列的d3结构域或具有seq id no:24的序列的d2结构域和具有seq id no:25的序列的d3结构域，如表3中所示。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体还包含d2结构域的片段或变体或d3结构域的片段或变体。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体还包含d2结构域的片段或变体和d3结构域的片段或变体。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体通过接头与d2或d3结构域接合。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体通过接头与d2和d3结构域接合。
[0083]
表3.sirpαd2和d3结构域的氨基酸序列
[0084][0085]
在一些实施方案中，将包括sirpαd1结构域变体的本公开多肽连接到fc结构域变体，以改善多肽的药代动力学特性，例如增加血清半衰期。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体连接到不能二聚化的fc结构域变体。在一些实施方案中，fc结构域变体用于增加本文所述的多肽的血清半衰期。在一些实施方案中，包括sirpαd1结构域变体的本公开多肽不包括表4中所示的seq id no:26-36中的任一个的序列。
[0086]
表4.
[0087]
[0088][0089]
在一些实施方案中，本文所述的多肽和多肽构建体在体外用于结合测定，诸如免疫测定。例如，在一些实施方案中，本文所述的多肽和多肽构建体在液相中使用或结合至固相载体。在一些实施方案中，以各种方式可检测地标记用于免疫测定的多肽。
[0090]
在一些实施方案中，本文所述的多肽和多肽构建体结合至各种载体并用于检测特异性抗原表达细胞的存在。载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。载体的性质可以是可溶的或不
可溶的。
[0091]
各种不同的标记和标记方法是已知的。标记的实例包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物和生物发光化合物。使标记结合至本文公开的多肽的各种技术是可用的。
[0092]
在一些实施方案中，多肽与低分子量半抗原偶联。然后通过第二次反应特异性地检测这些半抗原。例如，在一些实施方案中，半抗原生物素与抗生物素蛋白一起使用，或半抗原二硝基苯基、吡哆醛或荧光素与特异性抗半抗原抗体(例如，分别为抗二硝基苯基抗体、抗吡哆醛抗体和抗荧光素抗体)一起检测。
[0093]
糖基化模式改变的sirpαd1结构域变体
[0094]
在一些实施方案中，本文公开了包含信号调控蛋白α(sirp-α)d1变体的多肽，所述变体包含sirpαd1结构域或其片段，其具有相对于野生型sirpαd1结构域(例如，seq id no:1或2中所示的野生型sirpαd1结构域)在残基80处的氨基酸突变；和相对于野生型sirpαd1结构域(例如，seq id no:1或2中所示的野生型sirpαd1结构域)在选自由以下组成的组的残基处的至少一个额外氨基酸突变：残基6、残基27、残基31、残基47、残基53、残基54、残基56、残基66和残基92。
[0095]
在一些实施方案中，本文还公开了包含fc结构域变体的多肽，其中fc结构域变体二聚体包含两个fc结构域变体，其中每个fc结构域变体独立地选自(i)由突变l234a、l235a、g237a和n297a组成的人igg1 fc区；(ii)由突变a330s、p331s和n297a组成的人igg2fc区；或(iii)包含突变s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a的人igg4 fc区。
[0096]
在一些实施方案中，本文公开的组合物中的多肽包含sirpαd1结构域变体，其具有降低的或最小的糖基化。表1中的seq id no:1和2的d1结构域各自含有序列n80itp中的氨基酸n80处的单个潜在的n-连接的糖基化位点。sirpαd1结构域在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中的表达导致16kda(非糖基化)的主要条带和较高分子量的次要条带，其被endo hf去除。endo hf是内切糖苷酶h和麦芽糖结合蛋白的重组蛋白融合体。endo hf在高甘露糖的壳二糖核心和一些来自n-连接糖蛋白的杂合寡糖内裂解。这意味着氨基酸位置83处的脯氨酸可以降低糖基化的效率，导致蛋白质具有不同程度的糖基化并因此具有异质性。对于药物开发来说，异质性会给过程开发带来挑战。因此，为了研究产生同源、非糖基化形式的sirpαd1结构域变体的可能性，在一些实施方案中，sirpαd1变体的氨基酸n80突变为ala。在一些实施方案中，为了制备非糖基化的sirpαd1结构域变体，sirpαd1结构域变体中的氨基酸n80被任何氨基酸取代，包括任何天然和非天然存在的氨基酸，例如n80a和n80q。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体包含n80a突变和至少1个额外突变(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个额外突变或更多个突变)。在一些实施方案中，额外突变在cd47结合位点中。在一些实施方案中，额外突变在d1结构域的疏水核心中。
[0097]
在一些实施方案中，本文公开的组合物中的多肽包括相对于野生型sirpαd1结构域具有增加的糖基化的sirpαd1结构域变体。增加最终产物同质性的另一个选择是提高氨基酸n80处的糖基化效率，并且产生相对于野生型具有增加的糖基化的sirpαd1结构域变体。在一些实施方案中，序列nitp83中的氨基酸p83影响氨基酸n80处的糖基化程度。在一些实施方案中，将p83变为任何氨基酸增加了n80处的糖基化效率。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体中的氨基酸p83被任何氨基酸取代，包括天然和非天然氨基酸，例如p83v，
p83a，p83i和p83l。在一些实施方案中，本公开的多肽在细胞中表达，所述细胞例如通过遗传工程化细胞系(例如，遗传工程化酵母或哺乳动物宿主)或改变细胞培养条件(诸如添加基夫碱(kifunensine))或通过使用天然非糖基化宿主(例如原核生物(大肠杆菌等))被优化为不糖基化由这种细胞表达的蛋白质。
[0098]
表5列出了相对于每个d1结构域变体序列sirpαd1结构域变体中的特定氨基酸取代。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体包括表5中所列的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或更多个)取代。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体未被糖基化或被最低程度地糖基化。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体被完全糖基化或几乎完全糖基化。在一些实施方案中，相对于野生型d1结构域，sirpαd1结构域变体包含至多十四个氨基酸取代。在一些实施方案中，相对于野生型d1结构域，sirpαd1结构域变体包含至多十个氨基酸取代。在一些实施方案中，相对于野生型d1结构域，sirpαd1结构域变体包含至多七个氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开的sirpαd1结构域变体与野生型d1结构域的序列具有至少90％(例如，至少92％，95％，97％或大于97％)的氨基酸序列同一性。
[0099]
在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体是嵌合的sirpαd1结构域变体，其包括两个或更多个野生型d1结构域或其变体的一部分(例如，一个野生型d1结构域或其变体的一部分和另一个野生型d1结构域或其变体的一部分)。在一些实施方案中，嵌合sirpαd1结构域变体包括野生型d1结构域或其变体的至少两个部分(例如，三个、四个、五个或更多个部分)，其中每个部分来自不同的野生型d1结构域。在一些实施方案中，嵌合sirpαd1结构域变体还包括表5中列出的一个或多个氨基酸取代。
[0100]
表5.sirpαd1结构域变体中的氨基酸取代
[0101]
[0102]
[0103]
[0104]
[0105][0106]
在一些实施方案中，多肽包括具有以下的序列的sirpαd1结构域变体：eeex1qx2iqpdksvlvaagetx3tlrctx4tslx5pvgpiqwfrgagpgrx6liynqx7x8gx9fprvttvsdx
10
tx
11
rnnmdfsirigx
12
itx
13
adagtyycx
14
kx
15
rkgspddvex
16
ksgagtelsvrakps(seq id no:37)，其中x1是l、i或v；x2是v、l或i；x3是a或v；x4是a、i或l；x5是i、t、s或f；x6是e、v或l；x7是k或r；x8是e或q；x9是h、p或r；x
10
是l、t或g；x
11
是k或r；x
12
是n、a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、p、q、r、s、t、v、w或y；x
13
是p、a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、q、r、s、t、v、w或y；x
14
是v或i；x
15
是f、l或v；并且x
16
是f或v；并且其中所述变体相对于具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少一个氨基酸取代。
[0107]
在本公开的这个方面中的一些实施方案中，多肽包括具有seq id no:37的序列的sirpαd1结构域变体，其中x1是l、i或v。在一些实施方案中，x2是v、l或i。在一些实施方案中，x3是a或v。在一些实施方案中，x4是a、i或l。在一些实施方案中，x5是i、t、s或f。在一些实施方案中，x6是e、v或l。在一些实施方案中，x7是k或r。在一些实施方案中，x8是e或q。在一些实施方案中，x9是h、p或r。在一些实施方案中，x
10
是l、t或g。在一些实施方案中，x
11
是k或r。在一些实施方案中，x
12
是n、a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、p、q、r、s、t、v、w或y。在一些实施方案中，x
13
是p、a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、q、r、s、t、v、w或y。在一些实施方案中，x
14
是v或i。在一些实施方案中，x
15
是f、l、v。在一些实施方案中，x
16
是f或v。
[0108]
在一些实施方案中，本文提供的多肽相对于具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过十个氨基酸取代。在一些实施方案中，本文提供的多肽相对于具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过七个氨基酸取代。
[0109]
在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少10倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少100倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少1000倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以小于1x10-8
m、小于5x10-9
m、小于1x10-9
m、小于5x10-10
m、小于1x10-10
m或小于1x10-11
m的kd结合至cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以约500nm与100nm之间、约100nm与50nm之间、约50nm与10nm之
id no:1或2的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少一个氨基酸取代。
[0115]
在一些实施方案中，多肽包含seq id no:47的序列，其中x1是e或g。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x2是l、i或v。在前述实施方案中的任一个中，x3是v、l或i。在前述实施方案中的任一个中，x4是s或f。在前述实施方案中的任一个中，x5是l或s。在前述实施方案中的任一个中，x6是s或t。在前述实施方案中的任一个中，x7是a或v。在前述实施方案中的任一个中，x8是i或t。在前述实施方案中的任一个中，x9是h或r。在前述实施方案中的任一个中，x
10
是a、v、i或l。在前述实施方案中的任一个中，x
11
是i、t、s或f。在前述实施方案中的任一个中，x
12
是a或g。在前述实施方案中的任一个中，x
13
是e、v或l。在前述实施方案中的任一个中，x
14
是k或r。在前述实施方案中的任一个中，x
15
是e或q。在前述实施方案中的任一个中，x
16
是h、p或r。在前述实施方案中的任一个中，x
17
是d或e。在前述实施方案中的任一个中，x
18
是s、l、t或g。在前述实施方案中的任一个中，x
19
是k或r。在前述实施方案中的任一个中，x
20
是e或n。在前述实施方案中的任一个中，x
21
是s或p。在前述实施方案中的任一个中，x
22
是s或r。在前述实施方案中的任一个中，x
23
是s或g。在前述实施方案中的任一个中，x
24
是n、a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、p、q、r、s、t、v、w或y。在前述实施方案中的任一个中，x
25
是p、a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、q、r、s、t、v、w或y。在前述实施方案中的任一个中，x
26
是v或i。在前述实施方案中的任一个中，x
27
是f、l、v。在前述实施方案中的任一个中，x
28
是d或不存在。在前述实施方案中的任一个中，x
29
是t或v。在前述实施方案中的任一个中，x
30
是f或v。在前述实施方案中的任一个中，x
31
是a或g。
[0116]
在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:1或2的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过十个氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:1或2的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过七个氨基酸取代。
[0117]
在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1或2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少10倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1或2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少100倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1或2的序列的野生型sirpαd1结构域的结合亲和力高至少1000倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以小于1x10-8
m、小于5x10-9
m、小于1x10-9
m、小于5x10-10
m、小于1x10-10
m或小于1x10-11
m的kd结合至cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以约500nm与100nm之间、约100nm与50nm之间、约50nm与10nm之间、约10nm与5nm之间、约5nm与1nm之间、约1nm与500pm之间、约500pm与100pm之间、约100pm与50pm之间或约50pm与10pm之间的kd结合至cd47。
[0118]
在一些实施方案中，多肽包括具有以下的序列的sirpαd1结构域变体：eeelqx1iqpdksvx2vaagex3ax4lx5ctx6tslx7pvgpiqwfrgagpx8rx9liynqx
10
x
11
gx
12
fprvttvsx
13
x
14
tkrx
15
nmdfsix
16
ix
17
x
18
itpadagtyycx
19
kfrkgx
20
x
21
x
22
dx
23
efksgagtelsvrakps(seq id no:48)，其中x1是v或i；x2是l或s；x3是t或s；x4是t或i；x5是r或h；x6是a、v或i；x7是i、r、y、k或f；x8是g或a；x9是e或v；x
10
是k或r；x
11
是e、d或q；x
12
是h或p；x
13
是d或e；x
14
是s、l或t；x
15
是n或e；x
16
是r或s；x
17
是g或s；x
18
是n或a；x
19
是v或i；x
20
是s、i或m；x
21
是p或不存在；x
22
是d或p；并且x
23
是v或t或其片段。
[0119]
在另一方面，本公开的特征在于一种多肽，其包括具有以下的序列的sirpαd1结构
域变体：eeelqx1iqpdksvlvaagetatlrctx2tslx3pvgpiqwfrgagpgrx4liynqx5x6gx7fprvttvsdx8tkrnnmdfsirigx9itpadagtyycx
10
kfrkgspddvefksgagtelsvrakps(seq id no:49)，其中x1是v、l或i；x2是a、i、v或l；x3是i、f、s或t；x4是e、v或l；x5是k或r；x6是e或q；x7是h、p或r；x8是l、t、s或g；x9是a；并且x
10
是v或i；并且其中所述变体相对于具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少一个氨基酸取代。
[0120]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:49的序列，其中x1是v、l或i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x2是a、i、v或l。在前述实施方案中的任一个中，x3是i、f、s或t。在前述实施方案中的任一个中，x4是e、v或l。在前述实施方案中的任一个中，x5是k或r。在前述实施方案中的任一个中，x6是e或q。在前述实施方案中的任一个中，x7是h、p或r。在前述实施方案中的任一个中，x8是l、t、s或g。在前述实施方案中的任一个中，x9是a。在前述实施方案中的任一个中，x
10
是v或i。
[0121]
在一些实施方案中，多肽包含sirpαd1结构域，其包含与seq id no:49至少85％的序列同一性(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)，其中x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9和x
10
中的每一个都不是野生型氨基酸。
[0122]
在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:1中的任一个的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过十个氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:1中的任一个的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过七个氨基酸取代。
[0123]
在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少10倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少100倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少1000倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以小于1x10-8
m、小于5x10-9
m、小于1x10-9
m、小于5x10-10
m、小于1x10-10
m或小于1x10-11
m的kd结合至cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以约500nm与100nm之间、约100nm与50nm之间、约50nm与10nm之间、约10nm与5nm之间、约5nm与1nm之间、约1nm与500pm之间、约500pm与100pm之间、约100pm与50pm之间或约50pm与10pm之间的kd结合至cd47。
[0124]
在另一方面，本公开的特征在于一种多肽，其包括具有以下的序列的sirpαd1结构域变体：eeelqx1iqpdksvsvaagesailhctx2tslx3pvgpiqwfrgagparx4liynqx5x6gx7fprvttvsex8tkrenmdfsisisx9itpadagtyycx
10
kfrkgspdtefksgagtelsvrakps(seq id no:50)，其中x1是v或i；x2是v或i；x3是i或f；x4是e或v；x5是k或r；x6是e或q；x7是h或p；x8是s或t；x9是n或a；并且x
10
v或i；并且其中所述变体相对于具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少一个氨基酸取代。
[0125]
在一些实施方案中，多肽包含seq id no:50的序列，其中x1是v或i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x2是v或i。在前述实施方案中的任一个中，x3是i或f。在前述实施方案中的任一个中，x4是e或v。在前述实施方案中的任一个中，x5是k或r。在前述实施方案中的任一个中，x6是e或q。在前述实施方案中的任一个中，x7是h或p。在前述实施方案中的任一个中，x8是s或r。在前述实施方案中的任一个中，x9是n或a。在前述实施方案中
的任一个中，x
10
是v或i。
[0126]
在一些实施方案中，多肽包含sirpαd1结构域，其包含与seq id no:50至少85％的序列同一性(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)，其中x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9和x
10
中的每一个都不是野生型氨基酸。
[0127]
在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过十个氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过七个氨基酸取代。
[0128]
在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少10倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少100倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少1000倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以小于1x10-8
m、小于5x10-9
m、小于1x10-9
m、小于5x10-10
m、小于1x10-10
m或小于1x10-11
m的kd结合至cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以约500nm与100nm之间、约100nm与50nm之间、约50nm与10nm之间、约10nm与5nm之间、约5nm与1nm之间、约1nm与500pm之间、约500pm与100pm之间、约100pm与50pm之间或约50pm与10pm之间的kd结合至cd47。
[0129]
在另一个方面，本公开的特征在于一种多肽，其包括具有以下的序列的sirpαd1结构域变体：eeelqx1iqpdksvlvaagetatlrctx2tslx3pvgpiqwfrgagpgrx4liynqx5egx6fprvttvsdx7tkrnnmdfsirigx8itpadagtyycx9kfrkgspddvefksgagtelsvrakps(seq id no:51)，其中x1是v或i；x2是a或i；x3是i或f；x4是e或v；x5是k或r；x6是h或p；x7是l或t；x8是n或a；并且x9是v或i；并且其中所述变体相对于具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少一个氨基酸取代。
[0130]
在一些实施方案中，多肽包含seq id no:51的序列，其中x1是v或i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x2是a或i。在前述实施方案中的任一个中，x3是i或f。在前述实施方案中的任一个中，x4是e或v。在前述实施方案中的任一个中，x5是k或r。在前述实施方案中的任一个中，x6是h或p。在前述实施方案中的任一个中，x7是l或t。在前述实施方案中的任一个中，x8是n或a。在前述实施方案中的任一个中，x9是v或i。在一个实施方案中，x4不是v。
[0131]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:51的序列，其中x8是a。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x1是v或i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x2是a或i。在前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x3是i或f。在前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x4是e或v。在一个实施方案中，x4不是v。在前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x5是k或r。在前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x6是h或p。在前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x7是a或v。在前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x9是v或i。
[0132]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:51的序列，其中x8是a。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x1是i。在本公开的这个方面中的前述
实施方案中的任一个中，x8是a并且x2是i。在前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x3是f。在前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x4是v。在前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x5是r。在前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x6是p。在前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x7是t。在前述实施方案中的任一个中，x8是a并且x9是i。
[0133]
在一些实施方案中，多肽包含sirpαd1结构域变体，其包含与seq id no:51至少85％的序列同一性(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)，其中x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8和x9中的每一个都不是野生型氨基酸。
[0134]
在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包含不超过十个氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包含不超过七个氨基酸取代。
[0135]
在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少10倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少100倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少1000倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以小于1x10-8
m、小于5x10-9
m、小于1x10-9
m、小于5x10-10
m、小于1x10-10
m或小于1x10-11
m的kd结合至cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以约500nm与100nm之间、约100nm与50nm之间、约50nm与10nm之间、约10nm与5nm之间、约5nm与1nm之间、约1nm与500pm之间、约500pm与100pm之间、约100pm与50pm之间或约50pm与10pm之间的kd结合至cd47。
[0136]
在另一个方面，本公开的特征在于一种多肽，其包括具有以下的序列的sirpαd1结构域变体：eeelqx1iqpdksvlvaagetatlrctx2tslx3pvgpiqwfrgagpgreliynqx4egx5fprvttvsdx6tkrnnmdfsirigx7itpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakps(seq id no:222)，其中x1是v、l或i；x2是a、i或l；x3是i、t、s或f；x4是k或r；x5是h或p；x6是l、t或g；x7是n或a；并且其中所述变体相对于具有根据seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少一个氨基酸取代。
[0137]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:222的序列，其中x1是v、l或i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x2是a、i或l。在前述实施方案中的任一个中，x3是i、t、s或f。在前述实施方案中的任一个中，x4是k或r。在前述实施方案中的任一个中，x5是h或p。在前述实施方案中的任一个中，x6是l、t或g。在前述实施方案中的任一个中，x7是n或a。
[0138]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:222的序列，其中x1是v或i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x2是a或i。在前述实施方案中的任一个中，x3是i或f。在前述实施方案中的任一个中，x4是k或r。在前述实施方案中的任一个中，x5是h或p。在前述实施方案中的任一个中，x6是l或t。在前述实施方案中的任一个中，x7是n或a。
[0139]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:222的序列，其中x7是a。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x1是v或i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x2是a或i。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并
且x3是i或f。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x4是k或r。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x5是h或p。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x6是l或t。
[0140]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:222的序列，其中x7是a。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x1是i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x2是i。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x3是f。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x4是r。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x5是p。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x6是t。
[0141]
在一些实施方案中，多肽包含sirpαd1结构域，其包含与seq id no:222至少85％的序列同一性(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)，其中x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的每一个都不是野生型氨基酸。
[0142]
在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过十个氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过七个氨基酸取代。
[0143]
在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少10倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少100倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域高至少1000倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，片段包括长度小于10个氨基酸、长度约10个氨基酸、长度约20个氨基酸、长度约30个氨基酸、长度约40个氨基酸、长度约50个氨基酸、长度约60个氨基酸、长度约70个氨基酸、长度约80个氨基酸、长度约90个氨基酸、长度约100个氨基酸或长度超过约100个氨基酸的多肽。片段保留了与cd47结合的能力。优选地，sirpαd1结构域变体多肽及其片段以比sirpα多肽结合cd47更高的亲和力结合至cd47。例如，在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以小于1x10-8
m、小于5x10-9
m、小于1x10-9
m、小于5x10-10
m、小于1x10-10
m或小于1x10-11
m的kd结合至cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以约500nm与100nm之间、约100nm与50nm之间、约50nm与10nm之间、约10nm与5nm之间、约5nm与1nm之间、约1nm与500pm之间、约500pm与100pm之间、约100pm与50pm之间或约50pm与10pm之间的kd结合至cd47。
[0144]
在另一个方面，本公开的特征在于一种多肽，其包括具有以下的序列的sirpαd1结构域变体：eeelqx1iqpdksvsvaagesailhctx2tslx3pvgpiqwfrgagpareliynqx4egx5fprvttvsex6tkrenmdfsisisx7itpadagtyycvkfrkgspdtefksgagtelsvrakps(seq id no:212)，其中x1是v、l或i；x2是v、i或l；x3是i、t、s或f；x4是k或r；x5是h、p或r；x6是s、t或g；x7是n或a；并且其中所述变体相对于具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少一个氨基酸取代。
[0145]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:212的序列，其中x1是v、l或i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x2是v、i或l。在前述实施方案中的任一个中，x3是i、t、s或f。在前述实施方案中的任一个中，x4是k或r。在前述实施方案中的任一个中，x5是h或p。在前述实施方案中的任一个中，x6是s、t或g。在前述实施方案中的任一个中，
x7是n或a。
[0146]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:212的序列，其中x1是v或i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x2是v或i。在前述实施方案中的任一个中，x3是i或f。在前述实施方案中的任一个中，x4是k或r。在前述实施方案中的任一个中，x5是h或p。在前述实施方案中的任一个中，x6是s或t。在前述实施方案中的任一个中，x7是n或a。
[0147]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:212的序列，其中x7是a。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x1是v或i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x2是v或i。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x3是i或f。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x4是k或r。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x5是h或p。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x6是s或t。
[0148]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:212的序列，其中x7是a。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x1是i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x2是i。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x3是f。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x4是r。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x5是p。在前述实施方案中的任一个中，x7是a并且x6是t。
[0149]
在一些实施方案中，多肽包含与seq id no:212具有至少85％序列同一性的sirpαd1结构域(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)，其中x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的每一个都不是野生型氨基酸。
[0150]
在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过十个氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开的这个方面的多肽相对于具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域包括不超过七个氨基酸取代。
[0151]
在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少10倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少100倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，多肽以比具有seq id no:2的序列的野生型sirpαd1结构域高至少1000倍的结合亲和力结合cd47。在一些实施方案中，片段包括长度小于10个氨基酸、长度约10个氨基酸、长度约20个氨基酸、长度约30个氨基酸、长度约40个氨基酸、长度约50个氨基酸、长度约60个氨基酸、长度约70个氨基酸、长度约80个氨基酸、长度约90个氨基酸、长度约100个氨基酸或长度超过约100个氨基酸的多肽。片段保留了与cd47结合的能力。优选地，sirpαd1结构域变体多肽及其片段以比sirpα多肽结合cd47更高的亲和力结合至cd47。例如，在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以小于1x10-8
m、小于5x10-9
m、小于1x10-9
m、小于5x10-10
m、小于1x10-10
m或小于1x10-11
m的kd结合至cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以约500nm与100nm之间、约100nm与50nm之间、约50nm与10nm之间、约10nm与5nm之间、约5nm与1nm之间、约1nm与500pm之间、约500pm与100pm之间、约100pm与50pm之间或约50pm与10pm之间的kd结合至cd47。
[0152]
在一些实施方案中，本文描述了包含sirpαd1结构域变体的多肽，所述变体具有根据以下的序列：eeelqx1iqpdksvlvaagetatlrctx2tslx3pvgpiqwfrgagpgrx4liynqx5x6gx7fp
rvttvsdx8tkrnnmdfsirigx9x
10
x
11
x
12
adagtyycx
13
kfrkgspddvefksgagtelsvrakps(seq id no:218)，其中x1是v、l或i；x2是a、v、l或i；x3是i、s、t或f；x4是e、l或v；x5是k或r；x6是e或q；x7是h、r或p；x8是s、g、l或t；x9是任何氨基酸；x
10
是任何氨基酸；x
11
是任何氨基酸；x
12
是任何氨基酸；并且x
13
是v或i；并且其中所述sirpαd1结构域变体相对于具有根据seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少两个氨基酸取代。
[0153]
在一些实施方案中，所述多肽包含seq id no:212的序列，其中x1，其中x9是a。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x9是n。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x
10
是i。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x9是n并且x10是p。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x9是n并且x11是除s、t或c以外的任何氨基酸。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x
11
是t。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x
11
是除t以外的氨基酸。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x
12
是p。在本公开的这个方面中的前述实施方案中的任一个中，x9是n并且x
12
是除p以外的任何氨基酸。
[0154]
在一些实施方案中，本文描述了包含sirpαd1结构域变体的多肽，所述变体具有根据以下的序列：eeelqx1iqpdksvlvaagetatlrctx2tslx3pvgpiqwfrgagpgrx4liynqx5x6gx7fprvttvsdx8tkrnnmdfsirigx9itx
10
adagtyycx
11
kfrkgspddvefksgagtelsvrakps(seq id no:219)，其中x1是v、l或i；x2是a、v、l或i；x3是i、s、t或f；x4是e、l或v；x5是k或r；x6是e或q；x7是h、r或p；x8是s、g、l或t；x9是n；x
10
是除p以外的任何氨基酸；并且x
11
是v或i；并且其中所述sirpαd1结构域变体相对于具有根据seq id no:1的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少两个氨基酸取代。
[0155]
在本公开的另一方面，本文公开了包括具有seq id no:48的氨基酸序列的sirpαd1结构域变体多肽或其片段的组合物。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽或其片段以比sirpα多肽结合至cd47的亲和力更高的亲和力结合至cd47。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽以小于1x10-8
m、或小于1x10-9
m、小于1x10-10
m或小于1x10-11
m的kd结合至cd47。在一些实施方案中，上述sirpαd1结构域变体多肽与第二多肽连接或融合。在一些实施方案中，第二多肽包括但不限于fc多肽、fc变体或前述的片段。
[0156]
不限制前述内容，在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽选自表6中所示的seq id no:53-87和213中的任一种。
[0157]
表6.sirpα变体多肽
[0158]
[0159]
[0160]
[0161][0162]
在一些实施方案中，多肽包含与表6中提供的任何变体具有至少85％序列同一性(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的sirpαd1结构域变体。
[0163]
在一些实施方案中，多肽包含与表6中的seq id no:80、81或85具有至少85％序列同一性(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的sirpαd1结构域。
[0164]
fc结构域变体和包含其的融合多肽
[0165]
在一些实施方案中，本文公开了包含信号调控蛋白α(sirp-α)d1变体的多肽，所述变体包含sirpαd1结构域或其片段，其具有相对于野生型sirpαd1结构域(例如，seq id no:1或2中所示的野生型sirpαd1结构域)在残基80处的氨基酸突变；和相对于野生型sirpαd1结构域(例如，seq id no:1或2中所示的野生型sirpαd1结构域)在选自由以下组成的组的残基处的至少一个额外氨基酸突变：残基6、残基27、残基31、残基47、残基53、残基54、残基56、残基66和残基92。
[0166]
在一些实施方案中，本文还公开了fc结构域变体二聚体，其中fc结构域变体二聚体包含两个fc结构域变体，其中每个fc结构域变体独立地选自(i)由突变l234a、l235a、g237a和n297a组成的人igg1 fc区；(ii)由突变a330s、p331s和n297a组成的人igg2 fc区；或(iii)包含突变s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a的人igg4 fc区。
[0167]
靶向细胞表面抗原的抗体可以触发与免疫细胞上的fc受体(fcr)缔合相关的免疫刺激和效应子功能。存在对特定类别的抗体具有特异性的许多fc受体，包括igg(γ受体)、ige(η受体)、iga(α受体)和igm(μ受体)。fc区与细胞表面上的fc受体的结合可以触发许多生物响应，包括抗体包被颗粒的吞噬作用(抗体依赖性细胞介导的吞噬作用，或adcp)、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包被细胞的裂解(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或adcc)以及炎症介体的释放、胎盘转移和免疫球蛋白产生的控制。此外，补体的c1组分与抗体的结合可以活化补体系统。补体的活化对于细胞病原体的裂解可能是重要的。然而，补体的活化也可以刺激炎性响应，并且还可以参与自身免疫性超敏反应或其他免疫病症。结合某些fc受体的能力降低或消除的变体fc区可用于开发治疗性抗体和fc融合多肽构建体，其通过靶向、活化或中和配体功能而起作用，同时不损伤或破坏局部细胞或组织。
[0168]
在一些实施方案中，sirpαd1多肽构建体包含与fc结构域变体连接的非天然存在的sirpαd1结构域变体，所述fc结构域变体形成具有消除的或减少的效应子功能的fc结构域。
[0169]
在一些实施方案中，fc结构域变体是指包括第二和第三抗体恒定结构域(例如，ch2和ch3)的多肽链。在一些实施方案中，fc结构域变体还包括铰链结构域。在一些实施方案中，fc结构域变体属于任何免疫球蛋白抗体同种型，包括igg、ige、igm、iga和igd。此外，在一些实施方案中，fc结构域变体属于任何igg亚型(例如，igg1、igg2、igg2a、igg2b、igg2c、igg3和igg4)。在一些实施方案中，fc结构域变体包含相对于野生型fc结构域单体序列(例如，1-10个、1-8个、1-6个、1-4个氨基酸取代、添加或插入、缺失或其组合)的多达十个氨基酸修饰(例如，插入、缺失和/或取代)，其改变了fc结构域与fc受体之间的相互作用。
[0170]
如本文所使用，术语“fc结构域二聚体”是指两个fc结构域的二聚体。在野生型fc结构域二聚体中，两个野生型fc结构域通过两个ch3抗体恒定结构域之间的相互作用以及在两个二聚化fc结构域的铰链结构域之间形成的一个或多个二硫键而二聚化。
[0171]
如本文所使用，术语“fc结构域二聚体变体”包含至少一种fc结构域变体。在一些实施方案中，fc结构域二聚体变体包含经突变而缺乏效应子功能的fc结构域变体，例如“死fc结构域二聚体变体”。在一些实施方案中，fc结构域二聚体变体中的每个fc结构域包括ch2抗体恒定结构域中的氨基酸取代，以减少fc结构域二聚体变体与fc受体，诸如fcγ受体(fcγr)、fcα受体(fcαr)或fcε(fcεr)之间的相互作用或结合。
[0172]
在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体(例如，表2、表5和表6中描述的任何变体)与免疫球蛋白的fc结构域变体或fc结构域变体的片段融合。在一些实施方案中，免疫球蛋白的fc结构域变体或fc结构域变体的片段能够与另一fc结构域变体形成fc结构域二聚体。在一些实施方案中，免疫球蛋白的fc结构域变体或fc结构域变体的片段不能与另一fc结构域变体形成fc结构域二聚体。在一些实施方案中，fc结构域变体或fc结构域变体的片段与本公开的多肽融合，以增加多肽的血清半衰期。在一些实施方案中，与本公开的多肽融合的fc结构域变体或fc结构域变体的片段与第二fc结构域变体二聚化，以形成结合fc受体的fc
结构域二聚体变体，或替代地，fc结构域变体结合至fc受体。在一些实施方案中，与多肽融合以增加多肽的血清半衰期的fc结构域变体或fc结构域变体的片段不诱导任何免疫系统相关的响应。
[0173]
在一些实施方案中，本文提供的sirpα多肽或构建体包括与第一fc结构域变体接合的sirpαd1结构域或其变体和与第二fc结构域变体接合的抗体可变结构域，其中第一和第二fc结构域变体联合形成fc结构域二聚体变体(例如，异二聚fc结构域二聚体变体)。fc结构域二聚体是在免疫球蛋白的c末端发现的蛋白质结构。fc结构域二聚体包括通过ch3抗体恒定结构域之间的相互作用而二聚化的两个fc结构域。野生型fc结构域二聚体形成结合至fc受体的最小结构，例如fcγri、fcγriia、fcγriib、fcγriiia、fcγriiib和fcγriv。
[0174]
fc结构域二聚体不直接参与抗体与其靶标的结合，但可能参与各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，本公开的sirpα多肽或构建体中的fc结构域包含氨基酸取代、添加或插入、缺失或其任何组合，其导致效应子功能降低，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性降低(adcc)、补体依赖性细胞溶解降低(cdc)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用降低(adcp)或其任何组合。在一些实施方案中，本公开的sirpα多肽或构建体的特征在于与人fc受体的结合降低(例如，最小结合或不存在结合)，以及与补体蛋白c1q的结合降低(例如，最小结合或不存在结合)。在一些实施方案中，本公开的sirpα构建体的特征在于与人fcγri、fcγriia、fcγriib、fcγriiib或其任意组合以及c1q的结合降低(例如，最小结合或不存在结合)。为了改变或减少抗体依赖性效应子功能，诸如adcc、cdc、adcp或其任何组合，在一些实施方案中，本公开的sirpα构建体中的fc结构域属于igg类，并且包含e233、l234、l235、g236、g237、d265、d270、n297、e318、k320、k322、a327、a330、p331或p329处的一个或多个氨基酸取代(根据kabat的eu索引(sequences of proteins of immunological interest,第5版,public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991)进行编号))。
[0175]
在一些实施方案中，与包含天然fc区的多肽构建体相比，包含本文所述的非天然fc区的多肽构建体表现出降低的或消除的与fcγ受体cd16a、cd32a、cd32b、cd32c和cd64中的至少一种的结合。在一些情况下，本文所述的多肽构建体表现出降低的或消除的与cd16a、cd32a、cd32b、cd32c和cd64 fcγ受体的结合。
[0176]
cdc是指一种细胞毒性形式，其中补体级联被结合至抗体fc结构域的补体组分c1q活化。在一些实施方案中，与包含野生型fc区的多肽构建体相比，包含本文所述的非天然fc区的多肽构建体在c1q结合方面表现出至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的降低。在一些情况下，与包含野生型fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的非天然fc区的多肽构建体表现出降低的cdc。在一些实施方案中，与包含野生型fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的非天然fc区的多肽构建体在cdc方面表现出至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的降低。在一些情况下，与包含野生型fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的非天然fc结构域变体或fc结构域二聚体变体的多肽构建体表现出可忽略的cdc。
[0177]
在一些实施方案中，本文所述的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体相对于野生型序列被最低程度地糖基化或具有降低的糖基化。在一些实施方案中，去糖基化通过n297a的突变或通过将n297突变为任何非n的氨基酸来完成。在一些实施方案中，去糖基化通过破
坏基序n-xaa1-xaa2-xaa3来完成，其中n＝天冬酰胺；xaa1＝除p(脯氨酸)以外的任何氨基酸；xaa2＝t(苏氨酸)、s(丝氨酸)或c(半胱氨酸)；xaa3＝除p(脯氨酸)以外的任何氨基酸。在一个实施方案中，n-xaa1-xaa2-xaa3基序是指残基297-300，如根据kabat等人,1991年所指定。在一些实施方案中，n、xaa1、xaa2或xaa3中任何一个或多个的突变导致fc结构域变体或fc结构域二聚体变体的去糖基化。
[0178]
在一些实施方案中，抗体igg恒定区的变体(例如，fc结构域变体或fc结构域二聚体变体)具有降低的特异性结合fcγ受体的能力，或具有降低的诱导吞噬作用的能力。在一些实施方案中，抗体igg恒定区的变体(例如，fc结构域变体或fc结构域二聚体变体)具有降低的特异性结合fcγ受体的能力，并且具有降低的诱导吞噬作用的能力。例如，在一些实施方案中，fc结构域变体被突变为缺乏效应子功能，这是“死亡”fc结构域变体的典型特征。例如，在一些实施方案中，fc结构域变体包括已知使fc结构域二聚体与fcγ受体之间的相互作用最小化的特定氨基酸取代。在一些实施方案中，fc结构域变体来自igg1抗体，并且包括氨基酸取代l234a、l235a、g237a和n297a中的一个或多个(如根据kabat等人,1991的eu编号系统所指定)。在一些实施方案中，一个或多个额外突变包括于此类igg1 fc结构域变体中。人igg1 fc结构域变体的此类额外突变的非限制性实例包括e318a和k322a。在一些情况下，与野生型人igg1序列相比，人igg1fc结构域变体总共具有多达12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个或更少的突变。在一些实施方案中，一个或多个额外缺失包括于此类igg1 fc结构域变体中。例如，在一些实施方案中，表7中的seq id no:88中提供的fc结构域igg1重链恒定区的c末端赖氨酸缺失，例如以在多肽在细菌或哺乳动物细胞中产生时增加多肽的同质性。在一些情况下，与野生型人igg1序列相比，人igg1fc结构域变体总共具有多达12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个或更少的缺失(参见例如，seq id no:161，如下)。在一些实施方案中，igg1 fc结构域变体具有根据seq id no:135、seq id no:136或seq id no:137中的任一个的序列。
[0179]
seq id no:161：
[0180]
dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
[0181]
在一些实施方案中，fc结构域变体来自igg2或igg4抗体，并且包括氨基酸取代a330s、p331s，或a330s和p331s两者。根据kabat等人(1991)定义上述氨基酸位置。通过在抗体序列的同源区域处与“标准”kabat编号序列进行比对，可以确定给定抗体的氨基酸残基的kabat编号。在一些实施方案中，fc结构域变体包含人igg2 fc结构域序列，所述序列包含a330s、p331s和n297a氨基酸取代中的一个或多个(如根据kabat等人(1991)的eu编号系统所指定)。在一些实施方案中，一个或多个额外突变包括于此类igg2 fc结构域变体中。人igg2 fc结构域变体的此类额外突变的非限制性实例包括v234a、g237a、p238s、v309l和h268a(如根据kabat等人(1991)的eu编号系统所指定)。在一些情况下，与野生型人igg2序列相比，人igg2 fc结构域变体总共具有多达12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或更少的突变。在一些实施方案中，一个或多个额外缺包括于此类igg2 fc结构域变体中。例如，在一些实施方案中，表7中的seq id no:89中提供的fc结构域igg2重链恒定区的c
末端赖氨酸缺失，例如以在多肽在细菌或哺乳动物细胞中产生时增加多肽的同质性。在一些情况下，与野生型人igg2序列相比，人igg2 fc结构域变体总共具有多达12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个或更少的缺失(参见例如，seq id no:162，如下)。
[0182]
seq id no:162：
[0183]
erkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
[0184]
当fc结构域变体是igg4 fc结构域变体时，在一些实施方案中，此类fc结构域变体包含s228p突变(如根据kabat等人(1991)所指定)。在一些情况下，与野生型人igg4序列相比，人igg4 fc结构域变体总共具有多达12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变。在一些实施方案中，fc结构域变体包含人igg4 fc序列，所述序列包含s228p、e233p、f234v、l235a和delg236氨基酸取代中的一个或多个(如根据kabat等人(1991)的eu编号系统所指定)。在一些实施方案中，fc结构域变体包含人igg4fc序列，其包含s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a氨基酸取代中的一个或多个(如根据kabat等人(1991)的eu编号系统所指定)。
[0185]
在一些实施方案中，fc结构域变体包括igg1 fc区的突变l234a、l235a、g237a或n297a中的至少一个，或igg2 fc区的突变a330s、p331s或n297a中的至少一个。在一些实施方案中，fc结构域变体包括igg1 fc区的突变l234a、l235a、g237a或n297a中的至少两个，或igg2 fc区的突变a330s、p331s或n297a中的至少两个。在一些实施方案中，fc结构域变体包括igg1 fc区的突变l234a、l235a、g237a或n297a中的至少三个，或由igg2 fc区的突变a330s、p331s和n297a组成。在一些实施方案中，fc结构域变体由突变l234a、l235a、g237a和n297a组成。
[0186]
在一些实施方案中，与野生型人igg fc区相比，fc结构域变体表现出降低的与受试者的fc受体的结合。在一些实施方案中，与野生型人igg fc区相比，fc结构域变体表现出消除的与受试者的fc受体的结合。在一些实施方案中，与野生型人igg fc区相比，fc结构域变体表现出降低的吞噬作用。在一些实施方案中，与野生型人igg fc区相比，fc结构域变体表现出消除的吞噬作用。
[0187]
seq id no:88和seq id no:89提供fc结构域igg1和igg2重链恒定区的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc结构域变体是如表7中所示的seq id no:90-95的任何变体。
[0188]
表7.fc结构域变体的氨基酸序列
[0189][0190]
[0191]
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(在本文中也称为adcc)是指一种细胞毒性形式，其中分泌的ig结合到存在于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀手(nk)细胞和嗜中性粒细胞)上的fc受体(fcr)上，使这些细胞毒性效应子细胞能够特异性结合至携带抗原的靶细胞并随后杀死靶细胞。抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(在本文中也称为adcp)是指一种细胞毒性形式，其中分泌的ig结合到存在于某些吞噬细胞(例如，巨噬细胞)上的fc受体(fcr)上，使这些吞噬效应子细胞能够特异性结合至携带抗原的靶细胞并随后吞没和消化所述靶细胞。针对靶细胞的表面的配体特异性高亲和力igg抗体可刺激细胞毒性或吞噬细胞并可用于此类杀伤。在一些实施方案中，与包含野生型fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体的多肽构建体表现出降低的adcc或adcp。在一些实施方案中，与包含野生型fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体的多肽构建体在adcc或adcp方面表现出至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的降低。在一些实施方案中，与包含野生型fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体的多肽构建体表现出消除的的adcc或adcp。
[0192]
补体介导的细胞毒性(在本文中也称为cdc)是指一种细胞毒性形式，其中补体级联被与抗体fc结构域结合的补体组分c1q活化。在一些实施方案中，与包含野生型fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体的多肽构建体在c1q结合方面表现出减少至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的降低。在一些情况下，与包含野生型fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体的多肽构建体表现出降低的cdc。在一些实施方案中，与包含野生型fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体的多肽构建体在cdc方面表现出至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的降低。在一些情况下，与包含野生型fc区的多肽构建体相比，包含如本文所述的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体的多肽构建体表现出可忽略的cdc。
[0193]
本文中的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体包括与野生型人igg fc区相比表现出降低的与fcγ受体的结合的那些变体。例如，在一些实施方案中，fc结构域变体或fc结构域二聚体变体表现出与fcγ受体的结合低于由野生型人igg fc区表现的与fcγ受体的结合，如实施例中所述。在某些情况下，fc结构域变体或fc结构域二聚体变体与fcγ受体的结合降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的因数(完全消除的效应子功能)。在一些实施方案中，降低的结合是针对任何一种或多种fcγ受体，例如cd16a、cd32a、cd32b、cd32c或cd64。
[0194]
在一些情况下，与其野生型人igg fc区相比，本文公开的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体表现出降低的吞噬作用。与其野生型人igg fc区相比，此类fc结构域变体或fc结构域二聚体变体表现出降低的吞噬作用，其中吞噬作用活性降低了例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的因数。在一些情况下，fc结构域变体或fc结构域二聚体变体与其野生型人igg fc区相比表现出消除的吞噬作用。
[0195]
在一些实施方案中，本文公开的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体与一个或多
个融合配偶体偶联。在一些情况下，融合配偶体是治疗部分。在一些情况下，选择融合配偶体以使得能够靶向表达的蛋白质、纯化、筛选、展示等。在一些实施方案中，融合配偶体也影响与fc受体的结合的程度或吞噬作用降低的程度。如本文所述，在一些实施方案中，当fc结构域变体或fc结构域二聚体变体与融合配偶体偶联时，其形成如下所述的多肽构建体。
[0196]
在一些实施方案中，融合配偶体经由接头序列与fc结构域变体或fc结构域二聚体变体序列连接。在一些实施方案中，接头序列通常包含少量的氨基酸，诸如少于十个氨基酸，尽管也使用较长的接头。在一些情况下，接头的长度小于10个、9个、8个、7个、6个或5个氨基酸或更短。在一些情况下，接头具有至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个或35个氨基酸或更长的长度。任选地，在一些实施方案中，采用可裂解的接头。
[0197]
在一些实施方案中，融合配偶体是靶向序列或信号序列，其将fc结构域变体或fc结构域二聚体变体蛋白和任何相关的融合配偶体导向所需的细胞位置或胞外培养基。在一些实施方案中，某些信号传导序列靶向要分泌到生长培养基中或位于细胞的内膜与外膜之间的周质空间中的蛋白质。在一些实施方案中，融合配偶体是编码能够纯化或筛选的肽或蛋白质的序列。此类融合配偶体包括但不限于聚组氨酸标签(his标签)(例如his6(seq id no:223)和his10(seq id no:224))或与固定化金属亲和色谱(imac)系统(例如，ni 2亲和柱)一起使用的其他标签、gst融合体、mbp融合体、strep标签、细菌酶bira的bsp生物素化靶序列以及被抗体靶向的表位标签(例如c-myc标签、flag标签等)。
[0198]
在一些实施方案中，此类标签可用于纯化、筛选或两者。例如，在一些实施方案中，使用his标签通过将其固定到ni 2亲和柱上来纯化fc结构域变体或fc结构域二聚体变体，然后在纯化后，使用相同的his标签将抗体固定到ni 2包被的板上，以进行elisa或如本文别处所述的其他结合测定。在一些实施方案中，融合配偶体使得能够使用选择方法来筛选如本文所述的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体。
[0199]
可获得实现多种选择方法的各种融合配偶体。例如，通过将fc结构域变体或fc结构域二聚体变体文库的成员与基因iii蛋白融合，可以采用噬菌体展示。在一些实施方案中，融合配偶体fc结构域变体或fc结构域二聚体变体将被标记。替代地，在一些实施方案中，融合配偶体结合至表达载体上的特定序列，使得融合配偶体和相关的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体能够与编码其的核酸共价或非共价连接。
[0200]
在一些实施方案中，当融合配偶体是治疗性部分时，治疗性部分是例如肽、蛋白质、抗体、sirna或小分子。与本公开的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体偶联的治疗性抗体的非限制性实例包括但不限于识别cd47的抗体。与本公开的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体偶联的治疗性多肽的非限制性实例包括但不限于cd47结合多肽，包括sirpα多肽。在此类情况下，cd47结合多肽连接或融合到本公开的fc结构域变体或fc结构域二聚体变体。cd47结合多肽的实例包括但不限于抗cd47抗体或其片段，以及cd47的配体，诸如sirpα或其片段。cd47结合多肽的额外实例包括但不限于天然存在形式的sirpα以及其突变体。
[0201]
在一些实施方案中，本文公开了包含fc结构域二聚体变体的多肽，其中fc结构域二聚体变体包含两个fc结构域变体，其中每个fc结构域变体独立地选自(i)由突变l234a、l235a、g237a和n297a组成的人igg1 fc区；(ii)由突变a330s、p331s和n297a组成的人igg2 fc区；或(iii)包含突变s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a的人igg4 fc区。在一些实施方案中，fc结构域变体是相同的(即，同二聚体)。在一些实施方案中，fc结构域变体
是不同的(即，异二聚体)。在一些实施方案中，fc结构域二聚体中的至少一个fc结构域变体是由突变l234a、l235a、g237a和n297a组成的人igg1fc区。在一些实施方案中，fc结构域二聚体中的至少一个fc结构域变体是由突变a330s、p331s和n297a组成的人igg2 fc区。在一些实施方案中，与人igg fc区的野生型形式相比，fc结构域二聚体变体表现出消除的或降低的与fcγ受体的结合。在一些实施方案中，与人igg fc区的野生型形式相比，fc结构域二聚体变体表现出消除的或降低的与cd16a、cd32a、cd32b、cd32c和cd64 fcγ受体的结合。在一些实施方案中，与人igg fc融合体的野生型形式相比，fc结构域二聚体变体表现出消除的或降低的与c1q的结合。在一些实施方案中，fc结构域二聚体变体中的至少一个是包含突变s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a的人igg4 fc区。在一些实施方案中，与野生型人igg4 fc区相比，fc结构域二聚体变体表现出消除的或降低的与fcγ受体的结合。在一些实施方案中，与其人igg4 fc区的野生型形式相比，fc结构域二聚体变体表现出消除的或降低的与cd16a和cd32b fcγ受体的结合。在一些实施方案中，fc结构域二聚体变体以大于约5x10-6m的kd结合至fcγ受体。
[0202]
在一些实施方案中，fc结构域二聚体变体还包含cd47结合多肽。在一些实施方案中，与人igg fc区的野生型形式相比，fc结构域二聚体变体表现出消除的或降低的与fcγ受体的结合。在一些实施方案中，cd47结合多肽不会在啮齿动物和非人灵长类动物中引起急性贫血。在一些实施方案中，cd47结合多肽不会在人中引起急性贫血。
[0203]
在一些实施方案中，cd47结合多肽是信号调控蛋白α(sirp-α)多肽或其片段。在一些实施方案中，sirpα多肽包含sirpαd1结构域变体，所述变体包含氨基酸序列eeelqx1iqpdksvlvaagetatlrctx2tslx3pvgpiqwfrgagpgrx4liynqx5egx6fprvttvsdx7tkrnnmdfsirigx8itpadagtyycx9kfrkgspddvefksgagtelsvrakps(seq id no:221)，其中x1是v或i；x2是a或i；x3是i或f；x4是e或v；x5是k或r；x6是h或p；x7是l或t；x8是除n以外的任何氨基酸；并且x9是v或i。在一些实施方案中，sirpα多肽包含sirpαd1结构域变体，其中x1是v或i；x2是a或i；x3是i或f；x4是e；x5是k或r；x6是h或p；x7是l或t；x8不是n；并且x9是v。
[0204]
在一些实施方案中，本文公开了一种多肽，其包含：sirpαd1结构域变体，其中sirpαd1结构域变体是非天然存在的高亲和力sirpαd1结构域，其中sirpαd1结构域变体以比天然存在的d1结构域的亲和力大至少10倍的亲和力结合至人cd47；和fc结构域变体，其中所述fc结构域变体与包含第二fc结构域变体的第二多肽连接，以形成fc结构域二聚体变体，其中所述fc结构域二聚体变体具有消除的或降低的效应子功能。在一些实施方案中，非天然存在的高亲和力sirpαd1结构域包含残基80处的氨基酸突变。
[0205]
在一些实施方案中，本文公开了一种sirpαd1结构域变体，其中sirpαd1结构域变体以小于250nm的kd结合来自第一物种的cd47；并且其中sirpαd1结构域变体以小于250nm的kd结合来自第二物种的cd47；并且来自第一物种的cd47的kd和来自第二物种的cd47的kd彼此在100倍以内；其中第一物种和第二物种选自由以下组成的组：人、啮齿动物和非人灵长类动物。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体结合来自至少3种不同物种的cd47。在一些实施方案中，非人灵长类动物是食蟹猴。
[0206]
在一些实施方案中，本文公开了一种多肽，其包含(a)以小于250nm kd结合人cd47的sirpαd1结构域；和(b)与sirpαd1结构域的n末端或c末端连接的fc结构域或其变体，其中所述多肽不会在啮齿类动物和非人灵长类动物中引起急性贫血。在一些实施方案中，多肽
是人sirp-α的非天然存在的变体。在一些实施方案中，体内施用多肽导致施用后的第一周期间血红蛋白减少少于50％。在一些实施方案中，在人类中施用多肽导致在施用后的第一周期间血红蛋白减少少于50％。在一些实施方案中，多肽进一步包含至少一种fc结构域二聚体变体，其中fc结构域二聚体变体包含选自以下的fc结构域变体：(i)由突变l234a、l235a、g237a和n297a组成的人igg1 fc区；(ii)由突变a330s、p331s和n297a组成的人igg2 fc区；或(iii)包含突变s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a的人igg4 fc区。在一些实施方案中，fc结构域变体是由突变l234a、l235a、g237a和n297a组成的人igg1 fc区。在一些实施方案中，fc结构域变体是由突变a330s、p331s和n297a组成的人igg2 fc区。
[0207]
本公开的sirpα构建体包括sirpα结构域或其变体，其c末端通过使用常规遗传或化学手段(例如，化学缀合)的接头接合到fc结构域或其变体的n末端。在一些实施方案中，将接头(例如，间隔区)插入多肽与fc结构域或其变体之间。在一些实施方案中，包括sirpαd1结构域变体的本公开的多肽与不能形成二聚体的fc结构域变体融合。在一些实施方案中，本公开的多肽与能够与另一fc结构域或其变体形成二聚体(例如，异二聚体)的fc结构域或其变体融合。在一些实施方案中，本发明的多肽与fc结构域或其变体融合，并且此融合蛋白形成同二聚体。在一些实施方案中，本公开的多肽与第一fc结构域或其变体融合，并且不同的蛋白质或肽(例如，抗体可变区)与第二fc结构域或其变体融合。在一些实施方案中，sirpαd1结构域或其变体与第一fc结构域或其变体接合，并且治疗性蛋白质(例如，细胞因子、白介素、抗原、类固醇、抗炎剂或免疫调控剂)与第二fc结构域或其变体接合。在一些实施方案中，第一和第二fc结构域或其变体形成异二聚体。
[0208]
在不限制前述内容的情况下，在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽(例如，表2、5和6中描述的任何变体)与fc多肽或fc变体多肽(诸如fc结构域或其变体)融合。包含sirpαd1结构域变体多肽和融合fc结构域变体多肽的多肽的实例包括但不限于表8中所示的seq id no:96-137、214和216。
[0209]
表8.包含与fc结构域变体融合的sirpαd1结构域变体的多肽
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223]
[0224]
[0225][0226]
在一些实施方案中，多肽包含与表8中提供的任何变体具有至少85％序列同一性(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的sirpαd1变体结构域。
[0227]
在一些实施方案中，多肽包含与表8中的seq id no:98-104、107-113、116-122或135-137具有至少85％序列同一性(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的sirpαd1结构域变体。
[0228]
在一些实施方案中，多肽包含(a)信号调控蛋白α(sirp-α)d1变体，其中sirpαd1结构域变体包含氨基酸序列，eex1x2qx3iqpdkx4vx5vaagex6x7x8lx9ctx
10
tslx
11
pvgpiqwfrgagpx
12
rx
13
liynqx
14
x
15
gx
16
fprvttvsx
17
x
18
tx
19
rx
20
nmdfx
21
ix
22
ix
23
x
24
itx
25
adagtyycx
26
kx
27
rkgspdx
28
x
29
ex
30
ksgagtelsvrx
31
kps(seq id no:47)，其中x1是e或g；x2是l、i或v；x3是v、l或i；x4是s或f；x5是l或s；x6是s或t；x7是a或v；x8是i或t；x9是h、r或l；x
10
是a、v、i或l；x
11
是i、t、s或f；x
12
是a或g；x
13
是e、v或l；x
14
是k或r；x
15
是e或q；x
16
是h、p或r；x
17
是d或e；x
18
是s、l、t或g；x
19
是k或r；x
20
是e或n；x
21
是s或p；x
22
是s或r；x
23
是s或g；x
24
是任何氨基酸；x
25
是任何氨基酸；x
26
是v或i；x
27
是f、l或v；x
28
是d或不存在；x
29
是t或v；x
30
是f或v；并且x
31
是a或g；并且其中所
述sirpαd1结构域变体相对于具有根据seq id no:1至10中的任一个的序列的野生型sirpαd1结构域包含至少两个氨基酸取代；和(b)具有两个fc结构域变体的fc结构域二聚体变体，其中每个fc结构域变体独立地是(i)包含n297a突变的人igg1 fc区；(ii)包含l234a、l235a和g237a突变的人igg1 fc区；(iii)包含l234a、l235a、g237a和n297a突变的人igg1 fc区；(iv)包含n297a突变的人igg2 fc区；(v)包含a330s和p331s突变的人igg2 fc区；(vi)包含a330s、p331s和n297a突变的人igg2 fc区；(vii)包含s228p、e233p、f234v、l235a和delg236突变的人igg4 fc区；或(viii)包含s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a突变的人igg4 fc区。
[0229]
在一些实施方案中，多肽包含sirpαd1结构域变体，其中sirpαd1结构域变体包含根据seq id no:47的氨基酸序列；具有两个fc结构域的fc结构域二聚体，其中fc结构域中的一个是包含含有l234a、l235a、g237a和n297a突变的人igg1 fc区的fc结构域变体。
[0230]
fc结构域的二聚化
[0231]
在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体多肽(例如，表2、5和6中描述的任何变体)在n末端或c末端处与第一fc结构域(例如，fc结构域变体)融合。在一些实施方案中，第一fc结构域是不能形成二聚体的变体。在一些实施方案中，第一fc结构域与第二fc结构域形成二聚体。在一些实施方案中，第一和第二fc结构域包含促进第一和第二结构域fc结构域之间的异二聚化的氨基酸取代。
[0232]
在一些实施方案中，fc结构域二聚体中的两个fc结构域中的每一个都包括促进两个单体的异二聚化的氨基酸取代。在一些实施方案中，sirpα构建体由例如包括与第一fc结构域融合的sirpαd1结构域变体多肽的第一亚基和包括第二fc结构域的第二亚基(例如，没有sirpαd1结构域变体多肽或任何其他多肽)形成。在一些实施方案中，构建体具有与fc结构域二聚体(例如，单臂)连接的单个sirpαd1结构域变体多肽。在一些实施方案中，构建体具有与fc结构域二聚体(例如，双臂)连接的两个sirpαd1结构域变体多肽。在一些实施方案中，kd为约500nm的sirpαd1结构域变体在双臂构建体中特别有用。在一些实施方案中，kd为约50nm的sirpαd1结构域变体在双臂构建体中特别有用。在一些实施方案中，kd为约5nm的sirpαd1结构域变体在双臂构建体和单臂构建体中是有用的。在一些实施方案中，kd为约500pm的sirpαd1结构域变体在双臂构建体和单臂构建体中是有用的。在一些实施方案中，kd为约100pm的sirpαd1结构域变体在双臂构建体和单臂构建体中是有用的。在一些实施方案中，kd为约50pm的sirpαd1结构域变体在双臂构建体和单臂构建体中是有用的。在一些实施方案中，kd为约10pm的sirpαd1结构域变体在双臂构建体和单臂构建体中是有用的。
[0233]
在一些实施方案中，通过在两个fc结构域(诸如“杵-臼(knob-into-hole)”残基对和电荷残基对)中引入不同但相容的取代来促进fc结构域的异二聚化。杵和臼相互作用有利于异二聚体形成，而杵-杵(knob-knob)和臼-臼(hole-hole)相互作用由于空间冲突和有利相互作用的缺失而阻碍同二聚体形成。臼是指当蛋白质中的原始氨基酸被具有较小侧链体积的不同氨基酸替换时产生的空隙。杵是指当蛋白质中的原始氨基酸被具有较大侧链体积的不同氨基酸替换时产生的凸块。例如，在一些实施方案中，被替换的氨基酸位于fc结构域的ch3抗体恒定结构域中并参与两个fc结构域的二聚化。在一些实施方案中，产生一个ch3抗体恒定结构域中的臼以容纳另一个ch3抗体恒定结构域中的杵，使得杵和臼氨基酸起到促进或有利于两个fc结构域的异二聚化的作用。在一些实施方案中，产生一个ch3抗体恒
定结构域中的臼以更好地容纳另一个ch3抗体恒定结构域中的原始氨基酸。在一些实施方案中，产生一个ch3抗体恒定结构域中的杵以与另一个ch3抗体恒定结构域中的原始氨基酸形成额外的相互作用。
[0234]
在一些实施方案中，通过用具有较小侧链的氨基酸(诸如丙氨酸、缬氨酸或苏氨酸)替换具有较大侧链的氨基酸(诸如酪氨酸或色氨酸)来构建臼，例如ch3抗体恒定结构域中的y407v突变。类似地，在一些实施方案中，通过用具有较大侧链的氨基酸替换具有较小侧链的氨基酸来构建杵，例如ch3抗体恒定结构域中的t366w突变。在一些实施方案中，一个fc结构域包括杵突变t366w，并且另一个fc结构域包括臼突变t366s、l358a和y407v。在一些实施方案中，包括sirpαd1结构域变体的本公开的多肽与包括杵突变t366w的fc结构域融合以限制不想要的杵-杵同二聚体形成。表9中包括但不限于杵-臼氨基酸对的实例，并且表10中提供了杵-臼fc结构域变体和sirpα
–
fc融合体的实例。
[0235]
表9.杵-臼氨基酸对
[0236][0237]
表10.示例性fc结构域变体和sirpαd1结构域变体
–
fc结构域变体融合多肽
[0238]
[0239]
[0240]
[0241][0242]
除杵-臼策略以外，在一些实施方案中，静电操纵也用于控制fc结构域的二聚化。静电操纵是指利用肽、蛋白质结构域和蛋白质中带相反电荷的氨基酸之间有利的静电相互作用来控制更高级蛋白质分子的形成。具体而言，为了使用静电操纵控制fc结构域的二聚化，组成ch3-ch3界面的一个或多个氨基酸残基被带正电或带负电的氨基酸残基替换，使得相互作用根据引入的特定带电荷氨基酸而变得静电有利或不利。在一些实施方案中，界面中带正电荷的氨基酸(诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)被带负电荷的氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)替换。在一些实施方案中，界面中带负电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸替换。在一些实施方案中，将带电荷的氨基酸引入相互作用的ch3抗体恒定结构域中的一个或两个中。在一些实施方案中，将带电荷的氨基酸引入两个fc结构域的相互作用的ch3抗体恒定结构域中促进fc结构域的异二聚体的选择性形成，如由带电氨基酸之间的相互作用产生的静电操纵效应所控制。表11中包括但不限于静电操纵氨基酸对的实例。
[0243]
表11.静电操纵氨基酸对
[0244][0245]
可获得用于控制fc结构域的异二聚化的其他方法，尤其是在构建双特异性抗体的情形下。
[0246]
在一些实施方案中，第一fc结构域和第二fc结构域相对于人igg1的序列各自包括以下氨基酸取代中的一个或多个：t366w、t366s、l368a、y407v、t366y、t394w、f405w、y349t、y349e、y349v、l351t、l351h、l351n、l351k、p353s、s354d、d356k、d356r、d356s、e357k、e357r、e357q、s364a、t366e、l368t、l368y、l368e、k370e、k370d、k370q、k392e、k392d、t394n、p395n、p396t、v397t、v397q、l398t、d399k、d399r、d399n、f405t、f405h、f405r、y407t、y407h、y407i、k409e、k409d、k409t和k409i。
[0247]
在一些实施方案中，fc结构域包含：(a)相对于野生型人igg1的以下氨基酸取代中的一个：t366w、t366s、l368a、y407v、t366y、t394w、f405w、y349t、y349e、y349v、l351t、l351h、l351n、l351k、p353s、s354d、d356k、d356r、d356s、e357k、e357r、e357q、s364a、t366e、l368t、l368y、l368e、k370e、k370d、k370q、k392e、k392d、t394n、p395n、p396t、v397t、v397q、l398t、d399k、d399r、d399n、f405t、f405h、f405r、y407t、y407h、y407i、k409e、k409d、k409t或k409i；或(b)(i)相对于人igg1 fc区的n297a突变；(ii)相对于人igg1 fc区的l234a、l235a和g237a突变；(iii)相对于人igg1 fc区的l234a、l235a、g237a和n297a突变；(iv)相对于人igg2 fc区的n297a突变；(v)相对于人igg2 fc区的a330s和p331s突变；(vi)相对于人igg2 fc区的a330s、p331s和n297a突变；(vii)相对于人igg4 fc区的s228p、e233p、f234v、l235a和delg236突变；或(viii)相对于人igg4 fc区的s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a突变。在一些实施方案中，fc结构域变体包含：(a)相对于野生型人igg1的以下氨基酸取代中的一个：t366w、t366s、l368a、y407v、t366y、t394w、f405w、y349t、y349e、y349v、l351t、l351h、l351n、l351k、p353s、s354d、d356k、d356r、d356s、e357k、e357r、e357q、s364a、t366e、l368t、l368y、l368e、k370e、k370d、k370q、k392e、k392d、t394n、p395n、p396t、v397t、v397q、l398t、d399k、d399r、d399n、f405t、f405h、f405r、y407t、y407h、y407i、k409e、k409d、k409t或k409i；和(b)还包含(i)相对于人igg1 fc区的n297a突变；(ii)相对于人igg1 fc区的l234a、l235a和g237a突变；(iii)相对于人igg1 fc区的l234a、l235a、g237a和n297a突变；(iv)相对于人igg2 fc区的n297a突变；(v)相对于人igg2 fc区的a330s和p331s突变；(vi)相对于人igg2 fc区的a330s、p331s和n297a突变；(vii)相对于人igg4 fc区的s228p、e233p、f234v、l235a和delg236突变；或(viii)相对于人igg4 fc区的s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a突变。
[0248]
在一些实施方案中，第一和第二fc结构域包括不同的氨基酸取代。在一些实施方案中，第一fc结构域包括t366w。在一些实施方案中，第二fc结构域包括t366s、l368a和y407v。在一些实施方案中，第一fc结构域包括d399k。在一些实施方案中，第二fc结构域包括k409d。
[0249]
接头
[0250]
在一些实施方案中，本文公开了包含信号调控蛋白α(sirp-α)d1变体的多肽，所述变体包含sirpαd1结构域或其片段，其具有相对于野生型sirpαd1结构域在残基80处的氨基酸突变；和相对于野生型sirpαd1结构域在选自由以下组成的组的残基处的至少一个额外氨基酸突变：残基6、残基27、残基31、残基47、残基53、残基54、残基56、残基66和残基92。
[0251]
在一些实施方案中，本文还公开了包含fc变体的多肽，其中fc变体包含含有两个fc结构域变体的fc结构域二聚体，其中每个fc结构域变体独立地选自(i)由突变l234a、l235a、g237a和n297a组成的人igg1 fc区；(ii)由突变a330s、p331s和n297a组成的人igg2 fc区；或(iii)包含突变s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a的人igg4 fc区。
[0252]
在本公开中，接头用于描述多肽或蛋白质结构域或相关非蛋白质部分之间的连接(linkage/connection)。在一些实施方案中，接头是fc结构域(或其变体)与sirpαd1结构域变体之间的连接(linkage/connection)。在一些实施方案中，接头连接sirpαd1结构域变体的c末端和fc结构域变体的n末端，使得两种多肽彼此串联接合。
[0253]
在一些实施方案中，接头是简单的共价键、例如肽键、合成聚合物或由化学反应产生的任何种类的键，例如化学缀合。当接头是肽键时，在一些实施方案中，一个蛋白质结构域的c末端处的羧酸基团与另一个蛋白质结构域的n末端处的氨基基团在缩合反应中反应以形成肽键。在一些实施方案中，肽键通过常规有机化学反应由合成手段形成，或通过宿主细胞的天然产生形成，其中编码串联的两种蛋白质的dna序列(例如，fc结构域变体和sirpαd1结构域变体)的核酸分子可通过宿主细胞中必要的分子机制(例如，dna聚合酶和核糖体)直接转录并翻译成编码两种蛋白质的连续多肽。
[0254]
当接头是合成聚合物时，在一些实施方案中，聚合物在每一端用反应性化学官能团官能化，以与两种蛋白质的连接端处的末端氨基酸反应。
[0255]
当接头(除了上面提到的肽键)由化学反应制成时，在一些实施方案中，化学官能团(例如，胺、羧酸、酯、叠氮化物或其他官能团)分别合成连接到一种蛋白质的c末端和另一种蛋白质的n末端。在一些实施方案中，两个官能团然后通过合成化学手段反应以形成化学键，从而将两个蛋白质连接在一起。
[0256]
间隔区
[0257]
在本公开中，在一些实施方案中，fc结构域单体与本公开的sirpαd1变体多肽之间的接头是包括约1-200个氨基酸的氨基酸间隔区。合适的肽间隔区包括含有柔性氨基酸残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)的肽接头。接头序列的实例提供于表12中。在一些实施方案中，间隔区含有gs、gg、ggs、ggg、ggggs(seq id no:163)、ggsg(seq id no:164)或sggg(seq id no:165)的基序，例如多个或重复基序。在一些实施方案中，间隔区含有2至12个氨基酸，包括gs，例如gs、gsgs(seq id no:166)、gsgsgs(seq id no:167)、gsgsgsgs(seq id no:168)、gsgsgsgsgs(seq id no:169)或gsgsgsgsgsgs(seq id no:170)的基序。在一些实施方案中，间隔区含有3至12个氨基酸，包括ggs，例如、ggs、ggsggs(seq id no:171)、ggsggsggs(seq id no:172)和ggsggsggsggs(seq id no:173)的基序。在一些实施方案中，间隔区含有4至12个氨基酸，包括ggsg(seq id no:164)，例如ggsg(seq id no:164)、ggsgggsg(seq id no:174)或ggsgggsgggsg(seq id no:175)的基序。在一些实施方案中，间隔区含有ggggs(seq id no:163)，例如ggggsggggsggggs(seq id no:176)的基序。在一些实施方案中，间隔区含有除甘氨酸和丝氨酸以外的氨基酸，例如aas(seq id no:177)、
aaal(seq id no:178)、aaak(seq id no:179)、aaar(seq id no:180)、egkssgsgseskst(seq id no:181)、gsagsaagsgef(seq id no:182)、aeaaakeaaaka(seq id no:183)、kesgsvsseqlaqfrsld(seq id no:184)、ggggagggg(seq id no:185)、genlyfqsgg(seq id no:186)、sacycels(seq id no:187)、rsiat(seq id no:188)、rpackipndlkqkvmnh(seq id no:189)、ggsaggsgsgssggssgasgtgtaggtgsgsgtgsg(seq id no:190)、aaanssidlisvpvdsr(seq id no:191)或ggsgggsegggsegggsegggsegggsegggsgggs(seq id no:192)。
[0258]
在一些实施方案中，间隔区含有eaaak(seq id no:193)的基序，例如多个或重复基序。在一些实施方案中，间隔区含有富含脯氨酸序列(诸如(xp)n，其中x是任何氨基酸(例如，a、k或e)，并且n是1-5)和papap(seq id no:194)的基序，例如多个或重复基序。
[0259]
表12.接头序列
[0260]
[0261][0262]
在一些实施方案中，所用的肽间隔区和氨基酸的长度根据所涉及的两种蛋白质和最终蛋白质融合多肽中所需的柔性程度进行调整。在一些实施方案中，调节间隔区的长度以确保蛋白质正确折叠并避免聚集体形成。在一些实施方案中，间隔区是a或aaal(seq id no:178)。
[0263]
载体、宿主细胞和蛋白质产生
[0264]
在一些实施方案中，本文公开了包含信号调控蛋白α(sirp-α)d1变体的多肽，所述变体包含sirpαd1结构域或其片段，其具有相对于野生型sirpαd1结构域在残基80处的氨基酸突变；和相对于野生型sirpαd1结构域在选自由以下组成的组的残基处的至少一个额外氨基酸突变：残基6、残基27、残基31、残基47、残基53、残基54、残基56、残基66和残基92。
[0265]
在一些实施方案中，本文还公开了包含fc变体的多肽，其中fc变体包含具有两个fc结构域单体的fc结构域二聚体，其中每个fc结构域单体独立地选自(i)由突变l234a、l235a、g237a和n297a组成的人igg1 fc区；(ii)由突变a330s、p331s和n297a组成的人igg2 fc区；或(iii)包含突变s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a的人igg4 fc区。
[0266]
在一些实施方案中，本公开的多肽从宿主细胞产生。宿主细胞是指包括从其相应核酸表达本文所述的多肽和融合多肽所需要的必需的细胞组分(例如，细胞器)的媒介物。在一些实施方案中，核酸包括于通过转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射、感染等引入宿主细胞的核酸载体中。在一些实施方案中，核酸载体的选择取决于待使用的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞属于原核(例如，细菌)或真核(例如，哺乳动物)来源。
[0267]
在一些实施方案中，多肽(例如包含sirpαd1结构域变体(例如，表2、5和6中提供的
任何变体)和融合配偶体(诸如fc变体)的多肽构建体)是通过在合适的条件下培养用核酸转化的宿主细胞来产生的，所述核酸优选为表达载体，含有编码多肽构建体(例如，fc变体，接头和融合配偶体)的核酸，以诱导或引起多肽构建体的表达。在一些实施方案中，适于表达的条件随着所选择的表达载体和宿主细胞而变化。在一些实施方案中，使用多种合适的宿主细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞和酵母。例如，可从美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)获得的细胞系目录中描述了可用于本公开的多种细胞系。在一些实施方案中，本公开的fc结构域变体在细胞中表达，所述细胞通过细胞系的遗传工程化或细胞培养条件的修改(诸如添加基夫碱)或通过使用天然非糖基化宿主(诸如原核生物)(大肠杆菌等)被优化为不糖基化由此类细胞表达的蛋白质，并且在一些情况下，不需要修饰fc中的糖基化序列。
[0268]
核酸载体构建和宿主细胞
[0269]
可以通过多种方法来制备编码本公开的多肽的氨基酸序列的核酸序列。这些方法包括但不限于寡核苷酸介导的(或定点)突变形成和pcr突变形成。在一些实施方案中，使用标准技术(例如，基因合成)获得编码本公开的多肽的核酸分子。替代地，使用标准技术(例如，quikchange
tm
突变形成)突变编码野生型sirpαd1结构域的核酸分子，以包括特定的氨基酸取代。在一些情况下，使用核苷酸合成仪或pcr技术合成核酸分子。
[0270]
在一些实施方案中，将编码多肽构建体(例如，包含sirpαd1结构域变体(例如，表2、5和6中提供的任何变体)和融合配偶体(诸如fc变体)的多肽构建体)的核酸并入表达载体中，以表达蛋白质。多种表达载体可用于蛋白质表达。表达载体可以包含自我复制的染色体外载体或整合到宿主基因组中的载体。载体还可以包括各种组分或元件。例如，在一些实施方案中，载体组分包括但不限于转录和翻译调控序列，诸如启动子序列、核糖体结合位点、信号序列、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、3’和5’非翻译区(utr)以及增强子或活化子序列；复制起点；选择标记物基因；和编码感兴趣多肽的核酸序列，以及转录终止序列。在一些实施方案中，表达载体包含与控制或调控序列、选择性标记物、任何融合配偶体、额外元件或其任何组合可操作地连接的蛋白质。术语“可操作地连接”是指核酸与另一个核酸序列处于功能关系。通常，这些表达载体包括与编码fc变体的核酸有效连接的转录和翻译调控核酸，并且通常适合用于表达蛋白质的宿主细胞。选择基因或标记物(诸如但不限于抗生素抗性基因或荧光蛋白基因)可用于选择含有表达载体的宿主细胞，例如通过抗生素或荧光表达。各种选择基因是可用的。
[0271]
在一些实施方案中，载体的组分或元件被优化，使得表达载体与宿主细胞类型相容。在本公开中找到用途的表达载体包括但不限于那些能够在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母和体外系统中进行蛋白质表达的载体。
[0272]
在一些实施方案中，使用哺乳动物细胞作为宿主细胞来产生本公开的多肽。哺乳动物细胞类型的实例包括但不限于人胚胎肾(hek)(例如，hek293，hek 293f)，中国仓鼠卵巢(cho)、hela、cos、pc3、vero、mc3t3、ns0、sp2/0、very、bhk、mdck、w138、bt483、hs578t、htb2、bt20、t47d、ns0(一种不内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、crl7o3o和hss78bst细胞。在一些实施方案中，大肠杆菌细胞被用作宿主细胞来产生本公开的多肽。大肠杆菌菌株的实例包括但不限于大肠杆菌294(31,446)、大肠杆菌λ1776(
31,537)、大肠杆菌bl21(de3)(baa-1025)和大肠杆菌rv308(31,608)。
[0273]
不同的宿主细胞具有蛋白质产物翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制(例如，糖基化)。在一些实施方案中，选择合适的细胞系或宿主系统以确保所表达的多肽的正确修饰和加工。一旦载体被引入宿主细胞以用于蛋白质产生，宿主细胞就在常规营养培养基中培养，所述培养基被改良为适于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
[0274]
在一些实施方案中，多肽构建体(例如包含sirpαd1结构域变体(例如，表2、5和6中提供的任何变体)和融合配偶体(诸如fc变体)的多肽构建体)在哺乳动物表达系统中表达，包括其中使用病毒(诸如逆转录病毒或腺病毒)将表达构建体引入哺乳动物细胞中的系统。在一些实施方案中，利用人、小鼠、大鼠、仓鼠或灵长类动物细胞。合适的细胞还包括已知的研究细胞，包括但不限于jurkat t细胞、nih3t3、cho、cos和293细胞。或者，在一些实施方案中，蛋白质在细菌细胞中表达。细菌表达系统是本领域众所周知的，并且包括大肠杆菌(escherichia coli/e.coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、乳脂链球菌(streptococcus cremoris)和变铅青链球菌(streptococcus lividans)。在一些情况下，包含fc结构域变体的多肽构建体在昆虫细胞(诸如但不限于sf9和sf21细胞)或酵母细胞(诸如但不限于来自酵母属(saccharomyces)、毕赤酵母属(pichia)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、汉逊酵母属(hansenula)和耶氏酵母属(yarrowia)的生物体)中产生。在一些情况下，使用无细胞翻译系统在体外表达包含fc结构域变体的多肽构建体。来源于原核(例如，大肠杆菌)和真核(例如，小麦胚芽、兔网织红细胞)细胞的体外翻译系统是可用的，并且在一些实施方案中，基于感兴趣的蛋白质的表达水平和功能特性进行选择。例如，如本领域技术人员所理解的，一些展示技术(例如核糖体展示)需要体外翻译。此外，在一些实施方案中，fc结构域变体通过化学合成方法产生，诸如但不限于液相肽合成和固相肽合成。在使用非糖基化系统(诸如细菌提取物)进行体外转录的情况下，即使存在天然糖基化位点，fc也不会被糖基化，因此将等同地获得fc的失活。
[0275]
在一些实施方案中，多肽构建体包括非天然氨基酸、氨基酸类似物、氨基酸模拟物或其任意组合，其以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。天然编码的氨基酸通常指20种常见的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如与氢、羧基、氨基和r基团键结的碳，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。在一些实施方案中，此类类似物具有经修饰的r基团(诸如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但通常保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
[0276]
蛋白质产生、回收和纯化
[0277]
在一些实施方案中，使用于产生本公开的多肽的宿主细胞在适于培养所选宿主细胞的培养基中生长。用于哺乳动物宿主细胞的合适培养基的实例包括最低必需培养基(minimal essential medium；mem)、杜皮克氏改良爱哥尔氏培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium；dmem)、expi293
tm
表达培养基、补充胎牛血清(fbs)的dmem和rpmi-1640。用于细菌宿主细胞的合适培养基的实例包括鲁利亚肉汤(luria broth；lb)加必要的补充物，
诸如选择剂，例如氨苄青霉素(ampicillin)。在一些实施方案中，在合适的温度(诸如约20℃至约39℃，例如约25℃至约37℃，优选37℃)和co2水平(诸如约5％至10％)下培养宿主细胞。在一些实施方案中，培养基的ph为约ph 6.8至ph 7.4，例如ph 7.0，主要取决于宿主生物体。如果在表达载体中使用诱导型启动子，可以在适用于活化启动子的条件下诱导蛋白质表达。
[0278]
在一些实施方案中，蛋白质回收包括破坏宿主细胞，例如通过渗透休克、超声处理或裂解。一旦细胞被破坏，通过离心或过滤去除细胞碎片。然后可以进一步纯化蛋白质。在一些实施方案中，通过各种蛋白质纯化方法，例如通过色谱(例如，离子交换色谱、亲和色谱和尺寸排阻柱色谱)、离心、差异溶解或通过任何其他用于蛋白质纯化的标准技术来纯化本公开的多肽。例如，在一些实施方案中，通过适当选择和组合亲和柱，诸如蛋白质a柱(例如，poros蛋白质a色谱)与色谱柱(例如，poros hs-50阳离子交换色谱)、过滤、超滤、脱盐和透析程序来分离和纯化蛋白质。在一些实施方案中，多肽与标记物序列(诸如肽)缀合，以便于纯化。标记物氨基酸序列的实例为六组氨酸肽(his6-tag)，其可以微摩尔的亲和力结合至镍功能化的琼脂糖亲和柱。作为替代，可以使用血凝素“ha”标签，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位。
[0279]
在一些实施方案中，例如在基因疗法的情形下，通过施用含有编码本公开的多肽的核酸分子的载体，诸如病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体(例如，痘苗病毒载体，诸如改良的安卡拉痘苗(modified vaccinia ankara；mva))、腺相关病毒载体和甲病毒载体)，本公开的多肽(例如包含sirpαd1结构域变体(例如，表2、5和6中提供的任何变体)和融合配偶体(诸如fc变体)的多肽构建体)由受试者(例如，人)的细胞产生。一旦载体进入受试者的细胞(例如，通过转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射、感染等)可用于表达本文公开的多肽。在一些情况下，多肽从细胞中分泌出来。在一些实施方案中，如果疾病或病症的治疗是期望的结果，则不需要进一步的行动。在一些实施方案中，如果需要收集蛋白质，则从受试者收集血液并通过各种方法从血液中纯化蛋白质。
[0280]
治疗癌症的方法
[0281]
治疗髓性癌症的方法
[0282]
在一些实施方案中，提供了治疗个体(例如，人个体)的癌症(例如，髓性癌症，诸如骨髓增生异常综合征(mds)或急性髓性白血病(aml))的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的(a)阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂和(b)低甲基化剂。在一些实施方案中，癌症是aml。在一些实施方案中，癌症是tp53突变的aml和/或flt3突变的aml。在一些实施方案中，癌症是mds。在一些实施方案中，所述方法包括诱导期和维持期，其中所述诱导期包括施用(a)阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂，和(b)低甲基化剂，并且所述维持期包括施用阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂，而没有低甲基化剂(例如，使用阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂的单一疗法)。
[0283]
在一些实施方案中，提供了治疗个体(例如，人个体)的癌症(例如，髓性癌症，诸如骨髓增生异常综合征(mds)或急性髓性白血病(aml))的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的(a)阻断cd47(例如，hcd47)与sirpα(例如，hsirpα)之间的相互作用的药剂，(b)低甲基化剂，和(c)bcl-2抑制剂(例如，选择性bcl-2抑制剂)。在一些实施方案中，癌症是
aml。在一些实施方案中，癌症是tp53突变的aml和/或flt3突变的aml。在一些实施方案中，癌症是mds。
[0284]
mds涵盖一系列以慢性血细胞减少症(例如，贫血、中性粒细胞减少症、血小板减少症)为特征并伴有异常细胞成熟(骨髓发育异常)和/或特征性细胞遗传学异常的血液病状。因此，患有mds的个体处于出现症状性贫血、感染和出血以及进展为急性髓性白血病(aml)的风险下，而急性髓性白血病通常是标准治疗难以治愈的。患有mds的个体最常见的死亡原因是骨髓衰竭，而不是转化为aml。在一些实施方案中，mds是较高风险的mds。在一些实施方案中，如果个体具有大于3的经修订国际预后评分系统(revised international prognostic scoring system；ipss-r)得分，则mds被认为是较高风险的。在一些实施方案中，如果个体具有大于3.5的经修订国际预后评分系统(ipss-r)得分，则mds被认为是较高风险的。ipss-r是基于5个因素的有效的预后工具：(1)个体骨髓中原始细胞(血细胞的非常早期形式)的百分比；(2)细胞遗传学异常的类型和数量(如果有的话)；(3)个体血液中红细胞(以血红蛋白测量)的水平；(4)个体血液中的血小板水平；和(5)个体血液中嗜中性粒细胞的水平。每个因素都有一个得分，得分《3的个体更有可能具有良好的预后前景。参见，例如greenberg等人(2012).“revised international prognostic scoring system for myelodysplastic syndromes.”blood,120(12),2454
–
2465；和schanz等人(2012).“new comprehensive cytogenetic scoring system for primary myelodysplastic syndromes(mds)and oligoblastic acute myeloid leukemia after mds derived from an international database merge.”j clin oncol,30(8),820
–
829，了解有关ipss-r以及如何计算得分以确定个体的mds风险状态的另外细节。在一些实施方案中，个体具有约3或更高或约3.5或更高的ipss-r得分。在一些实施方案中，个体具有小于约3或小于约3.5的ipss-r得分。在一些实施方案中，个体已经接受了mds的先前治疗。用于mds的目前标准治疗包括例如造血干细胞移植和阿扎胞苷。在一些实施方案中，个体没有接受mds的先前治疗。
[0285]
aml是一种癌症形式，其特征在于骨髓、血液和其他组织被造血系统的增殖性、克隆性、异常分化和偶尔低分化细胞浸润。这是成人中最常见的急性白血病形式中的一种。在美国，医生每年诊断出大约19,520名aml患者。据估计，每年有10,670人死于这种疾病。在一些实施方案中，根据who 2016分类，个体患有亚细胞学或组织学确诊的复发/难治或新诊断的aml。在一些实施方案中，个体患有复发/难治在被认为不适合强化诱导治疗的患者中先前未治疗的aml。在一些实施方案中，个体患有在先前用基于hma的方案治疗后复发/难治的aml。在一些实施方案中，个体患有先前未治疗的aml，并且不被认为是强化诱导治疗的合适候选物。在一些实施方案中，个体具有足够的肾功能和肝功能。在一些实施方案中，个体≥18岁。在一些实施方案中，个体具有足够的表现状态。在一些实施方案中，个体没有经历过先前的同种异体hsct。在一些实施方案中，个体在hcst后至少3个月，没有不受控制的移植物抗宿主病(gvhd)。在一些实施方案中，个体没有经历过先前的同种异体hsct。在一些实施方案中，根据aml的2019年nccn指南第3版，个体未患新诊断的具有有利风险细胞遗传学的aml，诸如t(8；21)、inv(16)或t(16；16)。在一些实施方案中，个体未患急性早幼粒细胞白血病(apl)。在一些实施方案中，个体没有经历过使用任何抗cd47或抗sirpα(信号调控蛋白α)药剂的预先治疗。在一些实施方案中，个体不具有已知的活性病毒感染，包括乙型和丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(hiv)、获得性免疫缺陷综合征(aids)相关疾病或sars-cov-2(严重
急性呼吸综合征冠状病毒2)。
[0286]
在一些实施方案中，阻断cd47与sirpα之间的相互作用的药剂是包含sirpαd1结构域变体(例如，本文所述的sirpαd1结构域变体)和fc结构域变体(例如，本文所述的fc结构域变体)的多肽(例如，融合多肽)。在一些实施方案中，融合多肽的sirpαd1结构域变体(例如，本文描述的sirpαd1结构域变体)的c末端与fc结构域变体的n末端融合。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)包含sirpαd1结构域变体，所述变体包含seq id no:81或seq id no:85的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc结构域变体是(i)包含l234a、l235a、g237a和n297a突变的人igg1 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(ii)包含a330s、p331s和n297a突变的人igg2 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(iii)包含s228p、e233p、f234v、l235a和delg236突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；或(iv)包含s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引(例如，其中sirpαd1结构域变体的c末端与fc结构域变体的n末端融合)。在一些实施方案中，施用于个体的多肽(例如，融合多肽)包含seq id no:136或seq id no:135的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)形成同二聚体。
[0287]
低甲基化剂
[0288]
低甲基化剂是一类抗癌药物，迄今为止已显示具有两种主要的抗肿瘤活性机制：(i)由于掺入rna和/或dna而产生的细胞毒性，导致dna损伤响应的诱导，和(ii)通过抑制dna甲基转移酶的dna低甲基化，能够恢复正常的细胞生长和分化。参见，例如diesch等人(2016)“a clinical-molecular update on azanucleoside-based therapy for the treatment of hematologic cancers.”clin epigenet,8:71；sato等人(2017)“dna hypomethylating drugs in cancer therapy.”cold spring harbor perspectives in medicine,7(5),a026948；和datta等人(2012)“novel insights into the molecular mechanism of action of dna hypomethylating agents:role of protein kinase cδin decitabine-induced degradation of dna methyltransferase 1.”genes&cancer,3(1),71
–
81，了解有关低甲基化剂的额外细节。
[0289]
在一些实施方案中，低甲基化剂是阿扎胞苷(也称为5-氮杂-2
’‑
脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、氮杂胞苷、拉达卡霉素(ladakamycin)、4-氨基-1-β-d-呋喃核糖基-s-三嗪-2(1h)-酮和u-18496)。阿扎胞苷(胞苷的嘧啶核苷类似物)为具有经验式c8h
12
n4o5和244.2g/mol的分子量的白色结晶粉末。阿扎胞苷在化学上描述为4-氨基-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)氧杂环戊烷-2-基]-1,3,5-三嗪-2-酮并具有以下化学结构：
[0290][0291]
阿扎胞苷的cas登记号是320-67-2。阿扎胞苷经皮下或静脉内施用并以商品名
premierpro rxazacitidine等出售。关于阿扎胞苷制备、配药、剂量和施用时间表的完整信息可在当地包装插页(package insert)中找到(对于美国，参见例如，www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2008/050794s011lbl.pdf；对于欧洲，参见例如，www.ema.europa.eu/en/documents/product-information/vidaza-epar-product-information_en.pdf)。在一些实施方案中，根据当地包装插页中推荐的剂量和频率施用阿扎胞苷。
[0292]
在一些实施方案中，低甲基化剂是地西他滨(也称为5-氮杂-2
’‑
脱氧胞苷、4-氨基-1-(2-脱氧-β-d-赤-呋喃戊糖基)-s-三嗪-2(1h)-酮和5-氮杂脱氧胞苷)。地西他滨也是胞苷的嘧啶核苷类似物。地西他滨具有经验式c8h
12
n4o4和218.21g/mol的分子量。地西他滨在化学上描述为4-氨基-1-[(2r,4s,5r)-4-羟基-5-(羟甲基)氧杂环戊烷-2-基]-1,3,5-三嗪-2-酮并具有以下化学结构：
[0293][0294]
地西他滨的cas登记号是2353-33-5。地西他滨经静脉内施用并以商品名(及其他者)出售。关于地西他滨制备、配药、剂量和施用时间表的完整信息可在当地的包装插页中找到(对于美国，参见例如，www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/021790s006lbl.pdf；对于欧洲，参见例如，www.ema.europa.eu/en/documents/product-information/dacogen-epar-product-information_en.pdf。在一些实施方案中，根据当地包装插页推荐的剂量和频率施用地西他滨。
[0295]
在一些实施方案中，低甲基化剂是fdcyd(5-氟-2
’‑
脱氧胞苷)、泽布拉林、cp-4200(即，阿扎胞苷的反油酸衍生物)、rg108、七尾霉素a、胍地西他滨、rx-3117、epi01、安卓奎诺尔、cc-486或astx727(参见例如，astx.com/research-development/clinical-pipeline/astx727-oral-dnmt-inhibitor-hematological-malignancies/)。可用于本发明方法的其他示例性低甲基化剂描述于例如sato等人(2017).“dna hypomethylating drugs in cancer therapy.”cold spring harbor perspectives in medicine,7(5),a026948和duchmann等人(2019).“clinical update on hypomethylating agents.”int j hematol 110,161
–
169.
[0296]
bcl-2抑制剂
[0297]
bcl-2抑制剂是一类抗癌药物，据信通过与促凋亡bcl2竞争占据抗凋亡家族成员表面上的bh3停靠槽来发挥其细胞毒性作用。通过与一个或多个bcl2家族成员结合，这些抑制剂通过模拟bcl-2和其他相关蛋白的天然拮抗剂的活性来诱导凋亡并恢复肿瘤细胞中的凋亡。
[0298]
在一些实施方案中，bcl-2抑制剂是维奈托克(也称为gdc-0199、abt-199和
rg7601)，是本文所述方法中使用的示例性选择性bcl2抑制剂。维奈托克为具有经验式c
45h50
cln7o7s和868.44g/mol的分子量的浅黄色至暗黄色固体。维奈托克具有极低水溶性。维奈托克在化学上描述为4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-n-({3-硝基-4-[(四氢-2h-吡喃-4基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺)并具有以下化学结构：
[0299][0300]
维奈托克的cas登记号是1257044-40-8。维奈托克口服施用并以商品名唯可来(venclexta)和维托克(venclyxto)出售。关于维奈托克制备、配药、剂量和施用时间表的完整信息可在当地包装插页中找到(对于美国，参见例如，www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2016/208573s000lbl.pdf；对于欧洲，参见例如，www.ema.europa.eu/en/medicines/human/epar/venclyxto#product-information-section)。在一些实施方案中，根据当地包装插页中推荐的剂量和频率施用维奈托克。
[0301]
在一些实施方案中，bcl-2抑制剂是abt-737。abt-737是本文所述方法中使用的另一种示例性选择性bcl2抑制剂。抑制bcl2和bcl-xl两者的abt-737具有经验式c
42h45
cln6o5s2及813.43g/mol的分子量。abt-737的cas登记号是852-808-04-9。abt-737在化学上描述为4-{4-[(4
’‑
氯-2-联苯基)甲基]-1-哌嗪基}-n-[(4-{[(2r)-4-(二甲基氨基)-1-(苯硫基)-2-丁酰基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]苯甲酰胺并具有以下化学结构：
[0302][0303]
在一些实施方案中，本文所述方法中使用的bcl-2抑制剂是纳维托克。抑制bcl2、bcl-xl两者和bcl-w的纳维托克(也称为abt-263)具有经验式c
47h55
clf3n5o6s3和974.6g/mol的分子量。纳维托克的cas登记号为923564-51-6。abt-737在化学上描述为4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基环己烯-1-基]甲基]哌嗪-1-基]-n-[4-[[(2r)-4-吗啉-4-基-1-苯基硫烷基丁-2-基]氨基]-3-(三氟甲基磺酰基)苯基]磺酰基苯甲酰胺并具有以下提供的化学结构。关于纳维托克的额外细节提供于例如tse等人(2008)cancer res.68(9):3421-3429中。
[0304][0305]
在一些实施方案中，本文所述方法中使用的bcl2抑制剂是s55746(也称为bcl201和servier-1)。s55746占据了bcl-2的疏水槽。其的选择性特征表明与mcl-1无显著结合，bfl-1s55746占据了bcl-2的疏水槽。其的选择性特征表明与mcl-1、bfl-1(bcl2a1/a1)无显著结合，并且对bcl-xl的亲和力差。s55746对bcl-xl依赖性细胞(诸如血小板)无细胞毒性活性(参见，例如，casara等人(2008)oncotarget.9(28):29975-20088)。s55746具有经验式c
43h42
n4o6和710.82g/mol的分子量。s55746的cas登记号是1448584-12-0。s55746在化学上描述为(s)-n-(4-羟基苯基)-3-(6-(3-(吗啉甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-n-苯基-5,6,7,8-四氢吲哚嗪-1-甲酰胺并具有以下化学结构：
[0306][0307]
在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)和低甲基化剂(例如，阿扎胞苷)同时、并发或依序施用。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)、低甲基化剂(例如，阿扎胞苷)和bcl-2抑制剂(例如，维奈托克)同时、并发或依序施用。在一些实施方案中，融合多肽经由静脉输注施用。在一些实施方案中，以高达60mg/kg的剂量施用融合多肽(例如，经由静脉输注)。在一些实施方案中，融合多肽每4周一次(即，q4w)或每28天一次以60mg/kg的剂量施用(例如，经由静脉输注)。在一些实施方案中，低甲基化剂(例如，阿扎胞苷)经由静脉输注或皮下施用。在一些实施方案中，阿扎胞苷在一个或多个28天周期中施用。在一些实施方案中，阿扎胞苷在28天周期的7天中以每天75mg/m2的剂量施用。在一些实施方案中，阿扎胞苷在每个28天周期期间以每天75mg/m2的剂量施用于个体，持续5天，随后2天不施用阿扎胞苷，然后以75mg/m2的剂量施用于个体，持续额外2天。在一些实施方案中，口服施用bcl-2抑制剂(例如，维奈托克)在一些实施方案中，以的剂量施用维奈托克在一些实施方案中，维奈托克在治疗的第1天以100mg的剂量施用，在治疗的第2天以200mg的剂量施用，并且在治疗的第3天后以每天400mg的剂量施用。在一些实施方案中，维奈托克在治疗的第1天以100mg的剂量施用，在治疗的第2天以200mg的剂量施用，在治疗的第3天以400mg的剂量施用，并且在第3天后以每天600mg的剂量施用。在一些实施方案中，维奈托克与低甲基化剂(例如，阿扎胞苷或地西他滨)联合在每个28天周期中每天一次口服施用400mg。
[0308]
在一些实施方案中，融合多肽在100mg/5ml i型透明玻璃瓶中提供使用(例如，静脉内施用)，所述玻璃瓶用20mm特氟隆(teflon)涂覆的橡胶隔膜塞和铝密封件密封。在一些
实施方案中，融合多肽在400mg/20ml i型透明玻璃瓶中提供使用(例如，静脉内施用)，所述玻璃瓶用20mm特氟隆涂覆的橡胶隔膜塞和铝密封件密封。在一些实施方案中，将融合多肽在2-8℃(36-46℉)下储存在其原始容器中，直到使用为止(例如，静脉内施用)。
[0309]
用于治疗癌症的联合疗法
[0310]
在一些实施方案中，提供了治疗个体(例如，人个体)的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的多肽(例如，融合多肽)，所述多肽包含sirpαd1结构域变体(例如，本文所述的sirpαd1结构域变体)和fc结构域变体(例如，本文所述的fc结构域变体)，其中所述多肽(例如，融合多肽)以高达约60mg/kg(例如，例如约20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg、50mg/kg、51mg/kg、52mg/kg、53mg/kg、54mg/kg、55mg/kg、56mg/kg、57mg/kg、58mg/kg、59mg/kg或60mg/kg中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的剂量施用于个体(例如，经由静脉输注)。在一些实施方案中，提供了治疗个体(例如，人个体)的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的多肽(例如，融合多肽)，所述多肽包含sirpαd1结构域变体(例如，本文所述的sirpαd1结构域变体)和fc结构域变体(例如，本文所述的fc结构域变体)，其中所述多肽(例如，融合多肽)以约60mg/kg的剂量施用于个体。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)每四周一次(例如，q4w)或每28天一次以约60mg/kg的剂量施用(例如，经由静脉输注)。在一些实施方案中，提供了治疗个体(例如，人个体)的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的多肽(例如，融合多肽)，所述多肽包含sirpαd1结构域变体(例如，本文所述的sirpαd1结构域变体)和fc结构域变体(例如，本文所述的fc结构域变体)，其中所述多肽(例如，融合多肽)以约45mg/kg的剂量施用于个体(例如，经由静脉输注)。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)每三周一次(例如，q3w)或每21天一次以约45mg/kg的剂量施用于个体(例如，经由静脉输注)。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)的sirpαd1结构域变体的c末端与fc结构域变体的n末端融合。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)包含sirpαd1结构域变体，所述变体包含seq id no:81或seq id no:85的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc结构域变体是(i)包含l234a、l235a、g237a和n297a突变的人igg1 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(ii)包含a330s、p331s和n297a突变的人igg2 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(iii)包含s228p、e233p、f234v、l235a和delg236突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；或(iv)包含s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引(例如，其中sirpαd1结构域变体的c末端与fc结构域变体的n末端融合)。在一些实施方案中，施用于个体的多肽(例如，融合多肽)包含seq id no:136或seq id no:135的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)形成同二聚体。在一些实施方案中，个体是人。
[0311]
在一些实施方案中，所述方法包括与至少一种额外药剂(例如，抗癌剂)，诸如至少两种、三种、四种或五种另额外药剂(例如，抗癌剂)联合施用包含sirpαd1结构域变体(例如，本文所述的sirpαd1结构域变体)和fc结构域变体(例如，本文所述的fc结构域变体)的多肽(例如，融合多肽)。在一些实施方案中，可与本文中的方法一起使用的示例性抗癌剂包括但不限于治疗性抗体、抗体-药物缀合物(adc)、小分子抑制剂、肽抑制剂、皮质类固醇、甲
氨蝶呤、免疫调控剂、抗肿瘤抗生素、免疫治疗剂、抗癌疫苗、溶瘤病毒、细胞因子或化疗剂(例如、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、抗有丝分裂药物、低甲基化剂、铂基化合物、蒽环类、烷基化剂、植物生物碱及其他者)及其组合。
[0312]
此外或替代地，在一些实施方案中，所述方法包括与至少一种额外治疗模式结合施用包含sirpαd1结构域变体(例如，本文所述的sirpαd1结构域变体)和fc结构域变体(例如，本文所述的fc结构域变体)的多肽。在一些实施方案中，与融合多肽的施用结合进行的治疗的示例性模式包括但不限于过继细胞疗法(例如，嵌合抗原受体t细胞疗法(car-t)、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、tcr工程化t细胞、tcr工程化nk细胞和巨噬细胞产物)、自体干细胞移植、同种异体干细胞移植、放射、手术、基因疗法、冷冻消融和骨髓移植。
[0313]
在一些实施方案中，通过本文提供的方法治疗的癌症是实体瘤。通过本文提供的方法治疗的示例性癌症包括但不限于例如乳腺癌、肺癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、小细胞肺癌(sclc)、非小细胞肺癌(nsclc)、头颈癌、间皮瘤、脑癌、脑瘤、腹部癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、咽旁癌、胃肠癌、神经胶质瘤、肝癌、胃癌、口腔癌、舌癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、泌尿道癌症、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、维尔姆斯瘤(wilm’s tumor)、多发性骨髓瘤、皮肤癌、淋巴瘤、白血病、血癌、甲状腺癌、骨癌、腺囊性肿瘤、软骨肉瘤、胰岛细胞瘤、神经内分泌肿瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌瘤、子宫内膜癌、平滑肌肉瘤、胆囊癌、肝细胞癌、黑色素瘤或其他实体瘤。
[0314]
在一些实施方案中，通过本文提供的方法治疗的癌症是血液癌症。通过本文提供的方法治疗的示例性癌症包括但不限于例如多发性骨髓瘤或白血病，包括但不限于例如急性或慢性髓性白血病、急性或慢性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、急性髓性白血病(aml)、骨髓增生异常综合征(mds)、慢性髓性白血病(cml)、毛细胞性白血病、慢性粒单核细胞性白血病(cmml)、幼年粒单核细胞性白血病(jmml)、大颗粒淋巴细胞性(lgl)白血病、浆细胞瘤、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(bpdcn)、b细胞前淋巴细胞性白血病(b-pll)、t细胞前淋巴细胞性白血病(t-pll)、多发性骨髓瘤(mm)和非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphomas)(诸如弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、伯基特淋巴瘤(burkitt lymphoma)、套细胞淋巴瘤(mcl)、外周t细胞淋巴瘤(ptcl)、淋巴浆细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、边缘区淋巴瘤(mzl)和滤泡性淋巴瘤(fl)。
[0315]
试剂盒和制品
[0316]
在本发明的另一个实施方案中，提供了包括多肽(例如，本文所述的融合多肽)的制品或试剂盒，所述多肽包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体用于与低甲基化剂(例如，阿扎胞苷)联合用于治疗个体(例如，人个体)的骨髓增生异常病症(mds)或急性髓性白血病(aml)。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体与低甲基化剂(例如，阿扎胞苷)和bcl-2抑制剂(例如，维奈托克(veneotclax))联合用于治疗个体(例如，人个体)的aml。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体包含选自seq id no:81和seq id no:85的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc结构域变体是(i)包含l234a、l235a、g237a和n297a突变的人igg1 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(ii)包含a330s、p331s和n297a突变的人igg2 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(iii)包含s228p、e233p、f234v、l235a和delg236突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索
引；或(iv)包含s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引。在一些实施方案中，fc结构域变体包含seq id no:91的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含seq id no:135或seq id no:136的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体的多肽形成同二聚体。在一些实施方案中，试剂盒或制品根据本文提供的治疗方法使用。
[0317]
在一些实施方案中，试剂盒或制品还包括低甲基化剂。在一些实施方案中，低甲基化剂是阿扎胞苷。在一些实施方案中，试剂盒包括包装插页或标签，其具有与低甲基化剂(例如，阿扎胞苷)联合使用多肽(例如，融合多肽)来治疗个体(诸如人个体)的癌症(例如，髓性癌症，诸如骨髓增生异常综合征(mds)或急性髓样白血病(aml))或延迟其进展的说明书。在一些实施方案中，试剂盒或制品用于治疗aml，例如tp53突变的aml和/或flt3突变的aml。在一些实施方案中，试剂盒或制品用于治疗mds，例如较高风险的mds。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)和低甲基化剂(例如，阿扎胞苷)一起提供于试剂盒中。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)和低甲基化剂(例如，阿扎胞苷)提供于相同的容器或单独的容器中。
[0318]
在一些实施方案中，试剂盒或制品还包括bcl-2抑制剂。在一些实施方案中，bcl-2抑制剂是维奈托克。在一些实施方案中，试剂盒包括包装插页或标签，其具有与低甲基化剂(例如，阿扎胞苷)和bcl-2抑制剂(例如，维奈托克)联合使用多肽(例如，融合多肽)来治疗个体(诸如人个体)的癌症(例如，髓性癌症，诸如急性髓性白血病(aml))或延迟其进展的说明书。在一些实施方案中，试剂盒或制品用于治疗aml，例如tp53突变的aml和/或flt3突变的aml。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)、低甲基化剂(例如，阿扎胞苷)和bcl-2抑制剂(例如，维奈托克)一起提供于试剂盒中。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)、低甲基化剂(例如，阿扎胞苷)和bcl-2抑制剂(例如，维奈托克)提供于相同的容器或单独的容器中。
[0319]
在本发明的另一个实施方案中，提供了包括多肽(例如，本文所述的融合多肽)的制品或试剂盒，所述多肽包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体。在一些实施方案中，sirpαd1结构域变体包含选自seq id no:81和seq id no:85的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc结构域变体是(i)包含l234a、l235a、g237a和n297a突变的人igg1 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(ii)包含a330s、p331s和n297a突变的人igg2 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；(iii)包含s228p、e233p、f234v、l235a和delg236突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引；或(iv)包含s228p、e233p、f234v、l235a、delg236和n297a突变的人igg4 fc区，其中编号是根据kabat的eu索引。在一些实施方案中，fc结构域变体包含seq id no:91的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含seq id no:135或seq id no:136的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含sirpαd1结构域变体和fc结构域变体的多肽形成同二聚体。在一些实施方案中，试剂盒包括包装插页或标签，其具有使用多肽(例如，融合多肽)治疗个体(诸如人个体)的癌症(例如，本文别处描述的癌症)的说明书。在一些实施方案中，包装插页或标签提供了将多肽(例如，融合多肽)以高达60mg/kg的剂量施用于有需要的个体的说明书。在一些实施方案中，包装插页或标签提供了将多肽(例如，融合多肽)每4周一次(q4w)或每28天一次以60mg/kg的剂量施用于个体的说明书。在一些实施方案中，包装插页或标签提供了将多肽(例如，融合多肽)每3周一次(q3w)或每21天一次以45mg/kg的
剂量施用于有需要的个体的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包括至少一种额外抗癌剂(例如，本文别处描述的抗癌剂)。在一些实施方案中，试剂盒包括包装插页或标签，其具有与至少一种额外抗癌剂联合使用多肽(例如，融合多肽)来治疗个体(诸如人个体)的癌症(例如，本文所述的癌症)或延迟其进展的说明书。在一些实施方案中，多肽(例如，融合多肽)和至少一种额外抗癌剂提供于相同的容器或单独的容器中。此外或替代地，在一些实施方案中，试剂盒包括包装插页或标签，其具有与至少一种额外治疗模式(例如，本文所述的治疗模式)结合使用多肽(例如，融合多肽)的说明书。
[0320]
合适的容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。容器可由诸如玻璃、塑料(诸如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(诸如不锈钢或哈氏合金)的多种材料形成。在一些实施方案中，容器上或与其相关的配方和标签可指示使用方向。制品或试剂盒还可包括从商业和使用者角度来看所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明书的包装插页。在一些实施方案中，制品还包括一种或多种另一种药剂(例如，化疗剂、抗肿瘤剂、治疗性抗体等)。用于一种或多种药剂的合适容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。
[0321]
本说明书被认为足以使本领域技术人员实践本发明。除了在此示出和描述的那些以外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说从前面的描述中将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全文并入本文。
[0322]
实施例
[0323]
通过参考以下实施例，将更全面地理解本公开。然而，这些实施例不应被解释为限制本公开的范围。应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且将建议本领域技术人员根据这些其进行各种修改或变化，并且各种修改或变化将被包括在本技术的精神和范围以及所附权利要求的范围内。
[0324]
实施例1：用于实施例2a-2e的材料和方法
[0325]
外周血单核细胞(pbmc)分离
[0326]
用pbs(life technologies)稀释来自太平洋血液中心(blood centers of the pacific)或血小板单采白细胞减少过滤器(lrs室)(vitalant)的trima残留物。将稀释的血液分成两个管，并用15ml ficoll-paque plus(ge healthcare)打底。管以400x g离心30分钟。从界面收集外周血单核细胞(pbmc)，通过添加40ml pbs洗涤两次，以400x g离心10分钟，并且重悬于macs缓冲液(含0.5％ bsa(thermo fisher scientific)、2mm edta(teknova)的pbs)中。
[0327]
用于吞噬作用的人单核细胞来源的巨噬细胞的衍生和培养
[0328]
根据制造商的方案，使用经典的人单核细胞分离试剂盒(miltenyi biotec)和ls柱(miltenyi biotec)通过阴性选择纯化cd14
单核细胞。将cd14
单核细胞以600万细胞/皿的密度接种到150mm组织培养皿(corning)中的由rpmi完全培养基组成的补充有50ng/ml m-csf(miltenyi biotec)、10％ fbs(thermo fisher scientific)、1％青霉素/链霉素和1％ glutamax的25ml培养基内。将细胞培养七至是十一天。
[0329]
体外吞噬作用测定
[0330]
将靶细胞(hl60和oci-aml3细胞)在pbs中洗涤一次并根据制造商的说明书用具有
300nm cfse(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)的悬浮液中的celltrace cfse细胞增殖试剂盒(thermo fisher scientific)标记并重悬于rpmi完全培养基中。将靶细胞与rpmi完全培养基中的39nm至2.5μm之间的阿扎胞苷的两倍系列稀释液一起孵育过夜。在与巨噬细胞一起孵育之前，将细胞重悬于rpmi中。通过用pbs洗涤一次并在37℃下在tryple select中孵育20分钟，从培养板中分离巨噬细胞。将细胞用细胞刮刀(corning)去除，在pbs中洗涤，并且重悬于rpmi中。
[0331]
将用阿扎胞苷处理48小时的cfse标记的靶细胞离心并以100,000个细胞/孔添加到超低附着u形底96孔板(corning)中。然后添加药物a。将板在37℃下在含5％二氧化碳的潮湿孵育箱中孵育30分钟，然后添加50,000个巨噬细胞。将板在37℃下在含有5％二氧化碳的潮湿孵育箱中孵育两小时。细胞通过以400x g离心五分钟而沉淀并在4℃下在以1:4000稀释于pbs中的可固定活性染料efluor 780(ebioscience)中染色30分钟。将细胞在facs缓冲液(含0.5％ bsa的pbs)中洗涤并在4℃下在含有人fcr阻断试剂(miltenyi biotec)、bv421抗cd33(biolegend)、apc抗cd14(biolegend)和pe-花青蛋白7抗cd11b(invitrogen)的facs缓冲液中染色45分钟。将细胞在facs缓冲液中洗涤两次并在稀释于pbs中的0.5％多聚甲醛中在4℃下固定过夜。在facs canto ii(bd biosciences)上分析细胞，随后通过flowjo 10.6.1(becton dickinson&company)进行数据分析。通过对e780阴性群体进行门控来排除死亡细胞。将巨噬细胞鉴定为对谱系标记物cd33、cd11b和cd14呈阳性的细胞。在这个群体中，将吞噬了肿瘤细胞的巨噬细胞鉴定为对cfse呈阳性的细胞。
[0332]
人pbmc存活力测定
[0333]
在完全rpmi中计数并涂铺pbmc。将单独或与阿扎胞苷联合的药物a添加至pbmc中。在37℃下孵育72小时或五天后，用可固定的活性染料对细胞进行染色，然后用细胞表面标记物进行染色：cd3、cd19、cd14、cd56、cd16、cd11c和hladr(biolegend)。通过attune nxt对细胞进行流式细胞术处理并通过flowjo 10.3进行分析。存活力门控策略包括通过fsc高度和fsc宽度的双单线排除，随后是细胞类型表面标记物，然后是存活力门控。将cd11c树突状细胞鉴定为谱系阴性(cd3、cd19、cd14、cd16和cd56)hladr
cd11c
。使用graphpad prism 8将活细胞百分比制成表格。
[0334]
钙网蛋白表达分析
[0335]
为了检测人急性髓性白血病细胞系hl60、oci-aml3和mv4-11中的钙网蛋白表达水平的变化，将细胞与完全生长培养基(rpmi1640，10％ fbs)中的2.5μm或75nm阿扎胞苷(selleckchem)在37℃5％co2孵育箱中一起孵育72小时。在完全生长培养基中生长的细胞用作钙网蛋白基线表达的对照。孵育后，收获细胞并在染色缓冲液(pbs，2％fbs)中洗涤一次，在pbs中用可固定的活/死染色剂(invitrogen)在4℃下染色1小时，在染色缓冲液中洗涤一次并与500ng/ml的钙网蛋白-af647(克隆1g6a7，novus)一起孵育。在4℃下孵育1小时后，将细胞在染色缓冲液中洗涤两次并固定于0.5％多聚甲醛中。在attune(thermoscientific)上分析细胞，随后使用flowjo 10.6进行数据分析。
[0336]
体内抗肿瘤活性
[0337]
通过将hl60(atcc)、mv4-11(atcc)、oci-aml3(dsmz)急性髓性白血病细胞以每只小鼠5
×
106个细胞的浓度，使用1:1的基质胶(corning)和rpmi 1640比率注射到nod-scid雌性小鼠的右侧来诱导皮下肿瘤异种移植物。监测肿瘤，直到所有肿瘤的平均大小对于
hl60达到105mm3，对于mv4-11达到75mm3，并且对于oci-aml3达到112mm3。将小鼠随机分成pbs、阿扎胞苷(selleckchem)、药物a和阿扎胞苷 药物a联合的群组，对于hl60和oci-aml3每群组4-5只小鼠并且对于mv4-11每群组10只小鼠。向hl60和oci-aml3肿瘤模型中的小鼠腹膜内(ip)给药，对于阿扎胞苷间隔三天以5mg/kg给药五次，并且对于药物a间隔三天以10mg/kg给药给药六次。向携带mv4-11肿瘤的小鼠每周ip给药三次，对于阿扎胞苷以5mg/kg给药，并且对于药物a以10mg/kg给药。用卡尺对肿瘤进行二维测量，并且将肿瘤体积计算为：长度
×
宽度
×
宽度
×
0.5，其中长度是两个测量值中的较大值。当肿瘤体积达到约2000mm3时，处死动物。
[0338]
系统性白血病模型的连续bli成像
[0339]
以在rpmi 1640中每只7.5x106个细胞的浓度通过nod-scid雌性小鼠的尾静脉注射hl60luc2(atcc)细胞系。使用ivis光谱(perkin elmer)进行生物发光成像(bli)采集和分析，以监测肿瘤生长。将萤火虫d-荧光素(regis technologies)在磷酸盐缓冲盐水中稀释至15mg/ml储备液并在使用前过滤。将多组小鼠置于样本室中并腹膜内(ip)注射200μl d-荧光素。在注射后大约10分钟获得bli全身信号。每周两次连续监测bli通量值，初始扫描在小鼠接种后三天获得。在整个小鼠身体上手工构建感兴趣区域后，使用living image软件(perkin elmer)来量化bli平均总通量值(光子/秒，p/s)。在平均2.6e6总通量(光子/秒)下，将小鼠随机分成pbs、阿扎胞苷(selleckchem)、药物a和阿扎胞苷与药物a联合的群组，每群组10只小鼠。阿扎胞苷的配方是含2％ dmso的pbs。通过ip注射对阿扎胞苷处理的小鼠给药5mg/kg阿扎胞苷，总共五次，间隔三天。药物a处理的小鼠以30mg/kg通过ip注射给药，总共五次，间隔三天。当总通量达到1e11或体重减轻大于20％时，处死动物。
[0340]
实施例2a：在体外模型中药物a与阿扎胞苷联合对巨噬细胞吞噬作用的影响
[0341]
在本实施例中，在体外测定中评估了单独药物a、单独阿扎胞苷以及药物a与阿扎胞苷联合对巨噬细胞吞噬hl60和oci-aml3人急性髓性白血病细胞的作用(详情参见实施例1)。hl60为tp53null flt3wt细胞系，并且oci-aml3为tp53wt和flt3wt。
[0342]
简言之，hl60细胞和oci-aml3细胞(即，“靶细胞”)用cfse(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)标记并用阿扎胞苷(aza)处理48小时。然后将靶细胞旋转并以100,000个细胞/孔添加到96孔板的孔中。然后添加药物a。平行制备未处理的对照靶细胞，以及仅用阿扎胞苷或仅用药物a处理的对照靶细胞。将巨噬细胞添加至孔中，并且将板在37℃下孵育两小时。将巨噬细胞沉淀、染色并经由流式细胞术分析。通过对e780阴性群体进行门控来排除死亡细胞。将巨噬细胞鉴定为对谱系标记物cd33、cd11b和cd14呈阳性的细胞。在这个群体中，将吞噬肿瘤细胞的巨噬细胞鉴定为对cfse呈阳性的细胞。
[0343]
如图1a中所示，阿扎胞苷(aza)作为单一药剂轻微刺激巨噬细胞介导的hl60细胞吞噬作用，而药物a作为单一剂对吞噬作用几乎没有影响。(比较药物a处理的细胞和未处理的细胞。)1.6nm药物a和156nm阿扎胞苷的联合比单独药物a或单独阿扎胞苷更大程度地刺激巨噬细胞对hl60细胞的吞噬。在oci-aml3细胞中用40nm药物a和2.5μm阿扎胞苷观察到类似的结果。参见图1b。
[0344]
实施例2b：药物a与阿扎胞苷联合对人pbmc培养物中cd11c
树突细胞存活力的影响
[0345]
在这个实施例中，在体外测定中评估了单独药物a、单独阿扎胞苷以及药物a与阿
扎胞苷联合对人外周血单核细胞培养物中cd11c
树突细胞的存活力的影响(详情参见实施例1)。树突细胞(dc)是哺乳动物免疫系统的抗原呈递细胞(也称为辅助细胞)。其被认为是先天免疫系统与适应性免疫系统之间的信使。
[0346]
pmbc细胞与单独1.25μm阿扎胞苷(aza)一起孵育将cd11c
树突细胞的存活力降低了约40％，而pbmc与单独200nm药物a一起孵育将cd11c
树突细胞的存活力增加了约40％。参见图2。cd11c
树突细胞在与1.25μm阿扎胞苷和200nm药物a一起孵育的pbmc培养物中的存活力几乎与cd11c
树突细胞在与单独药物a一起孵育的pbmc培养物中的存活力相当。参见图2。此类结果表明药物a解除了阿扎胞苷对cd11c
树突细胞的作用。
[0347]
实施例2c：阿扎胞苷或维奈托克对人急性髓性白血病细胞系上的钙网蛋白表达的影响
[0348]
在本实施例中，在体外测定中评估了阿扎胞苷对hl60、oci-aml3和mv4-11人急性髓性白血病(aml)细胞的细胞表面上的钙网蛋白表达水平的影响(详情参见实施例1)。hl60为tp53null flt3wt细胞系；oci-aml3为tp53wt和flt3wt；并且mv4-11是tp53wt和flt3-itd。
[0349]
钙网蛋白是在内质网中发现参与ca
2
结合和储存的多功能蛋白。钙网蛋白也是先前描述于急性髓性白血病(aml)中的细胞表面前吞噬细胞标记物。如图3a中所示，hl60、oci-aml3和mv4-11细胞表面上的钙网蛋白表达随着阿扎胞苷浓度的增加而增加。基线细胞表面钙网蛋白表达显示在单独培养基中孵育的细胞中。
[0350]
还测试了阿扎胞苷或维奈托克对来自两名不同人类患者的mv4-11和原代aml细胞的细胞表面上的钙网蛋白表达水平的影响。如图3b中所示，阿扎胞苷和维奈托克都增加了mv411 aml细胞系和原代aml母细胞中前吞噬细胞信号钙网蛋白的表达。
[0351]
在另一组测定中，测试了阿扎胞苷或维奈托克对来自两个不同人类患者的mv4-11和原代aml细胞的细胞表面上的cd47表达水平的影响。如图3c中所示，阿扎胞苷和维奈托克都增加了mv411 aml细胞系和原代aml母细胞中抗吞噬细胞信号cd47的表达。
[0352]
实施例2d：药物a与阿扎胞苷或维奈托克联合在体外对aml细胞系和原代aml母细胞的吞噬作用的影响
[0353]
aml细胞(hl60、ociaml3或来自人供体的原代aml母细胞)与阿扎胞苷或维奈托克一起孵育24-48小时，然后在存在或不存在药物a的情况下与人单核细胞来源的巨噬细胞共培养2小时。通过流式细胞术将aml细胞的吞噬作用测定为吞没aml细胞(cfse )的巨噬细胞数对比总巨噬细胞数。如图7a和7b中所示，与使用药物a、阿扎胞苷或维奈托克的单一剂处理相比，药物a与阿扎胞苷(7a)或维奈托克(7b)联合增强了人巨噬细胞对aml细胞的吞噬消除。
[0354]
实施例2e：药物a与阿扎胞苷联合在白血病异种移植物模型中的抗肿瘤活性。
[0355]
在本实施例中，对携带hl60、oci-aml3和mv4-11人白血病肿瘤异种移植物的小鼠评估了药物a与阿扎胞苷(aza)联合的抗肿瘤活性。(实验细节参见实施例1。)hl60为tp53null flt3wt细胞系；oci-aml3为tp53wt和flt3wt；并且mv4-11是tp53wt和flt3-itd。
[0356]
将携带hl60异种移植肿瘤的小鼠随机分成4组，每组4-5只小鼠。一组小鼠被给予(a)10mg/kg ip的药物a(q3d，共6剂)，(b)5mg/kg ip的阿扎胞苷(q3d，共5剂)，(c)药物a和阿扎胞苷(按照每种单一剂的剂量和施用时间表)，或(d)媒介物。对携带oci-aml3异种移植
物的小鼠进行类似的随机化和处理。
[0357]
将携带mv4-11异种移植物的小鼠随机分成4组，每组9-10只。一组小鼠被给予10mg/kg ip的药物a(每周3次)，第二组小鼠被给予5mg/kg ip的阿扎胞苷(每周三次)，第三组被给予药物a和阿扎胞苷(按照每种单一剂的剂量和施用时间表)，并且第四组被给予媒介物。
[0358]
肿瘤生长抑制％(tgi)计算如下：(1-(所治疗肿瘤的平均体积)/(对照肿瘤的平均体积))
×
100％。在第20天，用单一剂阿扎胞苷治疗的小鼠中的hl60肿瘤生长被最低限度地抑制(即，与给予媒介物对照的小鼠相比)，而用药物a治疗对小鼠中的肿瘤生长没有明显的影响(即，与用媒介物治疗相比)。参见图4a。用阿扎胞苷与药物a联合治疗比使用任一种单独药物更大程度地延迟了小鼠中hl60肿瘤的生长。在第20天，在用单独阿扎胞苷治疗的小鼠中观察到42％ tgi；在用单独药物a治疗的小鼠中观察到10％ tgi，并且在用药物a与阿扎胞苷联合治疗的小鼠中观察到67％ tgi。在oci-aml3模型中观察到类似的结果，其中用阿扎胞苷与药物a联合治疗比任一种单独药物更大程度地延迟了小鼠中oci-aml3肿瘤的生长。参见图4b(*p《0.05，图基氏(tukey’s)普通单向anova)。在第20天，在用单独阿扎胞苷治疗的小鼠中观察到33％ tgi；在用单独药物a治疗的小鼠中观察到-3.7％ tgi，并且在用药物a与阿扎胞苷联合治疗的小鼠中观察到69％ tgi。
[0359]
与用每种单一剂或媒介物对照治疗相比，10mg/kg药物a与5mg/kg阿扎胞苷联合施用根除了mv4-11异种移植物中的肿瘤生长。在第26天，在用单独阿扎胞苷治疗的小鼠中观察到49％ tgi，在用单独药物a治疗的小鼠中观察到35％ tgi，并且在用药物a与阿扎胞苷联合治疗的小鼠中观察到86％ tgi。参见图4c(***p＝0.001，第26天图基氏普通单向anova)。用药物a 阿扎胞苷治疗的5/10小鼠显示完全的肿瘤根除。参见图4d。
[0360]
实施例2f：药物a与阿扎胞苷联合在全身性白血病模型中的抗肿瘤活性
[0361]
在播散性hl60-luc2急性髓性白血病模型中测试了单独的和与阿扎胞苷联合的药物a的抗肿瘤活性。在通过静脉内尾部注射将hl60-luc2细胞移植到免疫缺陷的nsg小鼠(7.5e6个细胞/动物)中后，通过生物发光成像确认移植物并将小鼠随机分成4组(10只小鼠/组)。如下表a所示进行处理。
[0362]
表a1：治疗组-剂量和时间表
[0363]
[0364]
第3天开始，每周两次对小鼠进行生物发光信号成像。如图5a和5b中所示，当与用每种单一剂或媒介物对照进行治疗相比时，30mg/kg药物a与5mg/kg阿扎胞苷联合施用消除了肿瘤生长。
[0365]
继续治疗，直到小鼠接受14剂单一剂a、单一剂阿扎胞苷或药物a与阿扎胞苷的组合。药物a单一疗法和阿扎胞苷单一疗法产生中度肿瘤生长抑制，但是所有给予药物a单一疗法或阿扎胞苷单一疗法的小鼠到治疗的第85天死于疾病。参见图5c。相比之下，药物a和阿扎胞苷的组合完全消除了肿瘤生长，直到第147天研究终止，动物存活率为100％。参见图5c。
[0366]
在播散性hl60-luc2急性髓性白血病模型中进行的第二组实验中，阿扎胞苷和药物a疗法在植入后4天开始并每3天进行腹膜内给药，持续共14剂。参见下面的表a2。
[0367]
表a2：治疗组-剂量和时间表
[0368][0369]
在接受药物a 阿扎胞苷的一半小鼠中，药物a单一疗法继续另外16剂。如图5d中所示，用单一剂阿扎胞苷治疗的所有小鼠到约第85天死于治疗。在用14剂的药物a 阿扎胞苷治疗的小鼠中，直到第105天观察到肿瘤抑制。相比之下，直到研究终止(第147天)，在用14剂的药物a 阿扎胞苷接着用另外16剂药物a单一疗法治疗的4只小鼠中的3只中，观察到肿瘤抑制。参见图5d。
[0370]
实施例3：药物a与维奈托克联合在系统性白血病模型中的抗肿瘤活性
[0371]
如实施例2所述，在播散性hl60-luc2急性髓性白血病模型中测试单独药物a和与维奈托克联合的抗肿瘤活性。维奈托克和药物a治疗在植入后4天开始并每3天进行给药，持续共5剂。参见下面的表b。
[0372]
表b：治疗组-剂量和时间表
[0373]
[0374][0375]
维奈托克单一疗法和药物a单一疗法各自产生中度肿瘤生长抑制，但不能维持持久的响应。给予维奈托克单一疗法或药物a单一疗法的所有小鼠在到40天死于疾病。参见图8。相比之下，在80天的评价期内，肿瘤生长在用维奈托克与药物a联合治疗的8只小鼠中的6只中完全消除。
[0376]
实施例4：药物a与阿扎胞苷和维奈托克联合在系统性白血病模型中的抗肿瘤活性
[0377]
药物a与阿扎胞苷和维奈托克联合对携带异种移植的人hl-60luc2白血病肿瘤的小鼠中的肿瘤生长抑制的作用。6周龄的雌性nodscid(charles river)小鼠用于异种移植实验。将hl-60luc2细胞(每只小鼠10
×
106个细胞)静脉内注射到每只小鼠的尾静脉中。接种后第4天开始，使用ivis卡尺(perkin elmer)监测肿瘤进展。当白血病负荷达到约1
×
106个光子/秒时，将小鼠随机分组并腹膜内给予(a)pbs(对照)，(b)阿扎胞苷，(c)维奈托克，(d)药物a，(e)阿扎胞苷 维奈托克，或(f)阿扎胞苷 维奈托克 药物a。阿扎胞苷以每三天5mg/kg的剂量腹膜内施用共5剂；药物a以每3天30mg/kg的剂量腹膜内施用共5剂；并且维奈托克以每天100mg/kg的剂量通过口服管饲施用14天。治疗开始后每3-4天对小鼠注射d-荧光素(regis)，并且使用小动物体内成像系统(ivis)测量并记录肿瘤生物发光。通过ivis软件(caliper life sciences)对整个小鼠的感兴趣区域进行门控，并且报道为由辐射度(光子/秒/厘米2/球面度)定义的面积通量(光子/秒)。
[0378]
如图6a中所示，药物a与维奈托克和阿扎胞苷联合比单独药物a、单独阿扎胞苷、单独维奈托克或阿扎胞苷与维奈托克联合更大程度地抑制肿瘤生长。如图6b中所示，用药物a与维奈托克和阿扎胞苷联合治疗的小鼠显示比用单独阿扎胞苷、单独维奈托克或阿扎胞苷与维奈托克联合治疗的小鼠存活率增加。在80天的评价期内，药物a与维奈托克和阿扎胞苷联合完全消除了9只小鼠中7只的肿瘤生长。参见图6b。
[0379]
实施例5：药物a增强了对多种急性髓性白血病疗法的响应深度和持久性
[0380]
急性髓性白血病(aml)是一种侵袭性血液恶性肿瘤，即使在标准治疗后，大多数患者仍会复发。尽管最近在治疗中取得了进展，但有效的新型治疗的开发仍未得到满足。
[0381]
cd47是由肿瘤细胞上调以逃避宿主免疫响应的骨髓检查点，并且其阻断增强了抗肿瘤免疫(weiskopf(2017)eur j cancer,76:100-109)。药物a是由与无活性的人免疫球蛋
白fc区连接的高亲和力cd47阻断剂构成的工程化融合蛋白。在临床前研究中，药物a通过促进巨噬细胞吞噬作用、树突状细胞活化和肿瘤相关巨噬细胞向炎症表型的转变来桥接先天免疫和获得性免疫，从而在与各种抗癌疗法联合使用时引起抗肿瘤活性增加(kauder等人(2018)plos one13(8):e0201832)。药物a先前已被证明在患有实体瘤的患者以及患有血液恶性肿瘤的患者中良好耐受。在药物a与抗癌治疗剂联合的情况下报道令人鼓舞的抗肿瘤响应(kim等人,摘要#ep1247，在2020年欧洲血液学协会(eha)第25届大会(25th congress of the european hematology association)上呈现的海报，以及chow等人,摘要#3056，在2020年美国临床肿瘤学会虚拟科学项目(2020american society of clinical oncology virtual scientific program)上呈现的海报)。最近，在患有aml的患者中，阿扎胞苷与维奈托克(一种bcl2抑制剂)联合显示出比单独阿扎胞苷更高的功效(dinardo等人(2019)blood,133(1):7
–
17)。在白血病恶性肿瘤中，用阿扎胞苷或维奈托克进行的体外治疗增加了cd47和钙网蛋白(一种前吞噬细胞标记物)的细胞表面表达。
[0382]
进行实验以测试药物a与阿扎胞苷或维奈托克联合将增强针对aml的治疗功效的假设。与任一种单独治疗相比，用药物a进行体外治疗导致人单核细胞来源的巨噬细胞对用阿扎胞苷或维奈托克治疗的多种aml细胞系(包括携带tp53和flt3突变的细胞系)的吞噬吞没增强。参见实施例2b-2c。在几种鼠aml异种移植模型中，体外发现与体内抗白血病活性增强相关。参见实施例2c-2d。小鼠经由尾静脉接种或皮下植入aml细胞，并且当肿瘤达到指数生长时，将小鼠随机化以接受以下：媒介物对照、阿扎胞苷、维奈托克、单独药物a或药物a与化疗剂的组合。接受药物a联合治疗的群组显示出显著更强的肿瘤进展抑制作用，有证据表明肿瘤已被根除，导致与任何单一剂疗法相比，存活率显著提高。
[0383]
实施例6：评估药物a与阿扎胞苷联合在具有较高风险骨髓增生异常综合征(mds)的人类患者中的安全性、耐受性和功效的示例性临床试验
[0384]
进行1/2期临床试验以评估药物a和阿扎胞苷(aza)的组合在具有较高风险骨髓增生异常综合征(mds)的患者中的安全性、耐受性和功效。1期包括药物a与标准剂量阿扎胞苷联合的剂量递增，以评价安全性并鉴定2期的推荐剂量，并且2期评价药物a 阿扎胞苷组合在具有较高风险mds的患者中的功效。
[0385]
招募了约63名患者。示例性的纳入标准是：(a)1期：诊断为先前未治疗或复发/难治的较高风险mds；2期：诊断先前未治疗的较高风险mds；(b)适当的肾脏和肝脏功能；(c)年龄≥18岁；以及(d)适当的性能状态(例如，根据东部肿瘤协作组(eastern cooperative onco logy group；ecog)量表，参见ecog-acrin.org/resources/ecog-perform ance-status)。示例性的排除标准是：(a)先前针对mds或急性髓性白血病(aml)的同种异体造血干细胞移植(同种异体hsct)；(b)以前用任何抗cd47或抗sirpα剂治疗；(c)已知的活性病毒感染，包括乙型和丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(hiv)、获得性免疫缺陷综合征(aids)相关疾病或sars-cov-2。
[0386]
对于1期，药物a与阿扎胞苷联合每4周一次(q4w)施用高达60mg/kg，例如60mg/kg。阿扎胞苷静脉内或皮下施用，在每个28天周期的7天中以每天75mg/m2的剂量(通常称为“7-0方案”)，或在每个28天周期中以每天75mg/m2的剂量，持续5天，接着2天无治疗(即，不施用阿扎胞苷)，然后每天75mg/m2持续2天(通常称为“5-2-2方案”)。对于2期，药物a以2期推荐剂量与阿扎胞苷联合施用(在每个28天周期的前7天中以每天75mg/m2的剂量静脉内或皮下
施用)。
[0387]
1期的主要结果量度是具有剂量限制毒性(dlt)的研究参与者人数。2期的主要结果量度是客观响应率(orr)，其为根据国际工作组(international working group；iwg)标准达到响应(例如，完全响应“cr”或部分响应“pr”)的研究参与者人数(参见，例如，cheson等人blood.2000；96:3671 3674和cheson等人blood.2006；108:419-425)。
[0388]
实施例7：用于评估药物a与维奈托克和阿扎胞苷联合在患有急性髓性白血病(aml)的人类患者中的安全性、耐受性和功效的示例性临床试验。
[0389]
进行1/2期临床试验以评估药物a、维奈托克和阿扎胞苷(aza)联合在患有急性髓性白血病(aml)的患者中的安全性、耐受性和功效。在1a期中，参与者接受递增剂量的药物a与维奈托克和阿扎胞苷的组合。i期的主要结果量度是经历剂量限制性毒性的参与者人数。在1b/2期中，受试者接受了推荐2期剂量的药物a与维奈托克和阿扎胞苷的组合。1b/2期的主要结果量度是根据欧洲白血病网(european leukemia net；eln)2017年标准，达到完全缓解(cr)和完全缓解伴不完全血液学恢复(cri)的参与者人数。这些研究鉴定了组合的安全性和功效以及推荐剂量。
[0390]
示例性的纳入标准包括但不限于：(a)根据who 2016分类，复发/难治或新诊断的aml的细胞学或组织学确诊；(b)对于1a期：被认为不适合强化诱导治疗的患者中的复发/难治或先前未治疗的aml；(c)对于1b期：在以前用基于hma的方案治疗后复发/难治的aml；(d)对于2期：被认为不适合强化诱导疗法的患者的先前未治疗的aml；(e)适当的肾脏和肝脏功能；(f)年龄≥18岁；和(g)适当的性能状态。
[0391]
示例性的排除标准包括但不限于：(a)对于1a期和1b期，先前经历过同种异体hsct的患者必须在hcst后至少3个月，没有不受控的移植物抗宿主病(gvhd)；(b)对于2期，排除了先前进行过同种异体hsct的患者；(c)根据aml的2019年nccn指南第3版，患有新诊断的具有有利风险细胞遗传学的aml的患者，诸如t(8；21)、inv(16)或t(16；16)；(d)患有急性早幼粒细胞白血病(apl)的患者；(e)以前用任何抗cd47或抗sirpα(信号调控蛋白α)剂治疗；(f)已知的活性病毒感染，包括乙型和丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(hiv)、获得性免疫缺陷综合征(aids)相关疾病或sars-cov-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)。
[0392]
前述实施例仅用于说明目的，并且不打算以任何方式限制本发明的范围。除了在此示出和描述的那些以外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说从前面的描述中将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。
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