尿沉渣用染色液的制作方法

1.本发明涉及尿沉渣检查中使用的超活染色液及使用该染色液的方法。特别是，本发明涉及抑制将尿中可能包含的杂质染色的方法、或能够提高尿中所含的稀少成分的检出率的检出能力提高方法等。


背景技术：

2.尿沉渣检查作为非侵入性的、被检者的负担少、也可以频繁实施的形态学检查，是重要的。尿沉渣检查以往通过由检查技师手动制作标本并通过镜检进行目视评价来进行。但是，该手动的操作存在以下问题：不仅镜检中使用的标本制作等成为检查技师的大的负担，而且根据检查技师的技能等的不同而在判断上容易产生偏差。因此，作为减轻这样的检查技师的负担、并且用于得到一致的判断结果的辅助，提出了在尿沉渣检查中对检体的成分进行自动分析的待检体分析装置。待检体分析装置有基于流式细胞仪法的装置、利用拍摄装置对待检体进行拍摄的装置，所述流式细胞仪法为：在待检体容器内将待检体及药剂混合、并将其悬浮液流入流动室，测定对激光的散射光、荧光。例如，日本特许第3924870号公报(专利文献1)中公开了一种分析装置，其在待检体中添加药剂，制备检出用的试样，对其进行拍摄。另外，非专利文献1中公开了各种尿沉渣染色法。
3.现有技术文献
4.专利文献
5.专利文献1：日本特许第3924870号公报
6.非专利文献
7.非专利文献1：医学检查vol.66no.j-stage-1尿沉渣特集2017、18～50页


技术实现要素：

8.发明要解决的问题
9.以往的尿沉渣检查中，不仅测定对象细胞被染色，尿中可能存在的杂质很多也被染色从而产生背景噪音，有时难以检出目标细胞。特别是，用有形成分分析装置进行尿沉渣检查的情况下，若背景中出现的杂质被染色，则有时与应当测定的成分重叠而被拍摄到，分类变得困难，在将成分错误分类下进行测定，变得难以用自动分析装置正确地进行有形成分的分析。进而，以往的尿沉渣检查中，存在杂质被染色，而另一方面上皮细胞、管型等稀少成分难以被染色的情况，有时这些稀少成分的检出变得不充分。
10.本发明是鉴于上述现有技术而作出的，本发明的一个目的在于，提供通过在尿沉渣检查中抑制杂质的染色，从而抑制背景噪音、能实现测定对象细胞的有效的检出的方法。此外，本发明的进一步的目的之一为，提供提高尿试样中的上皮细胞、管型等稀少成分的检出能力，从而能实现高灵敏度的尿沉渣检查的方法。
11.用于解决问题的方案
12.本发明人等为了达成上述目的而进行了深入研究，结果发现，通过在尿沉渣检查
中使用的超活染色液中使用特定成分，能够在不将尿试样中的背景中出现的杂质染色的情况下将目标成分效率良好地染色。进而发现，通过使该超活染色液与尿试样的混合比率最适化，能够实现尿沉渣检查中的稀少成分的更高灵敏度的测定，从而完成了本发明。即，本发明包含以下的构成。
13.[项1]一种尿沉渣检查用的超活染色液，其含有具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素。
[0014]
[项2]根据项1所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素是水可溶性色素。
[0015]
[项3]根据项1或2所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的分子量为700～900。
[0016]
[项4]根据项1～3中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素为选自由甲基蓝、专利蓝v、专利蓝a、海王星绿sbx(neptune green sbx)、阿西兰亮蓝r(acilan brilliant blue r，c.i.acid blue 24，c.i.酸性蓝24)、酸性固紫(acid fast violet)bg、酸性亮蓝(brilliant acid blue)b、亮蓝(brilliant blue)r、亮蓝fcf、亮蓝g、分散艳蓝g、酸性蓝、酸性蓝13、酸性蓝15、酸性蓝100、酸性蓝103、酸性蓝104、及酸性蓝269组成的组中的至少1种。
[0017]
[项5]根据项1～4中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，包含甲基蓝或亮蓝g作为具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素。
[0018]
[项6]根据项1～5中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，包含甲基蓝作为具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素。
[0019]
[项7]根据项1～6中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，还含有细胞质染色成分。
[0020]
[项8]根据项7所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，细胞质染色成分为选自由曙红黄、曙红蓝、詹纳斯绿、三苯基氯化四唑溶液、中性红、番红、焦宁b液、苏丹iii、苏丹黑、油红、乳品红(lactofuchsin)、甲基绿、焦宁、碘化钾、亮甲酚蓝、亮绿、靛蓝胭脂红、新亚甲蓝、中性红及品绿(light green)组成的组中的至少1种。
[0021]
[项9]根据项7或8所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，包含曙红黄或曙红蓝作为细胞质染色成分。
[0022]
[项10]根据项7～9中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，包含曙红黄作为细胞质染色成分。
[0023]
[项11]根据项7～10中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，包含甲基蓝或亮蓝g作为具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素，并且包含曙红黄或曙红蓝作为细胞质染色成分。
[0024]
[项12]根据项7～11中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，包含甲基蓝作为具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素，并且包含曙红黄作为细胞质染色成分。
[0025]
[项13]根据项7～12中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，细胞质染色成分相对于具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的摩尔比为0.5～8。
[0026]
[项14]根据项7～13中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其以如下方式使用：超活染色液和尿待检体以成为1：3～1：9的比率进行混合。
[0027]
[项15]根据项7～14中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其以如下方式使用：细胞质染色成分相对于具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的摩尔比为0.5～8，并且超活染色液和尿待检体成为1：3～1：9的比率进行混合。
[0028]
[项16]根据项1～15中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，还含有螯合剂。
[0029]
[项17]根据项1～16中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，实质上不含有有机溶剂。
[0030]
[项18]根据项1～17中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其为ph6～7。
[0031]
[项19]根据项1～18中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其在尿沉渣检查中抑制杂质的染色。
[0032]
[项20]根据项1～19中任一项所述的尿沉渣检查用的超活染色液，其中，尿沉渣检查为利用图像处理式尿中有形成分分析装置的尿沉渣检查。
[0033]
[项21]一种尿沉渣检查方法，其包括利用项1～20中任一项所述的超活染色液对尿待检体进行染色的工序。
[0034]
[项22]根据项21所述的尿沉渣检查方法，其中，将超活染色液和尿待检体以成为1：3～1：9的比率混合而进行染色。
[0035]
[项23]根据项21或22所述的尿沉渣检查方法，其包括在尿中有形成分分析装置中对进行了染色的尿待检体进行拍摄的工序。
[0036]
[项24]一种尿沉渣检查中抑制杂质染色的方法，其包括利用项1～20中任一项所述的超活染色液对尿待检体进行染色的工序。
[0037]
[项25]根据项24所述的尿沉渣检查中抑制杂质染色的方法，其中，将超活染色液和尿待检体以成为1：3～1：9的比率混合而进行染色。
[0038]
[项26]根据项24或25所述的尿沉渣检查中抑制杂质染色的方法，其包括在尿中有形成分分析装置中对进行了染色的尿待检体进行拍摄的工序。
[0039]
[项27]一种尿沉渣检查中提高稀少成分检出能力的方法，其包括利用项1～20中任一项所述的超活染色液对尿待检体进行染色的工序。
[0040]
[项28]根据项27所述的提高稀少成分检出能力的方法，其中，稀少成分为选自由上皮细胞及管型组成的组中的至少1种。
[0041]
[项29]根据项27或28所述的尿沉渣检查中提高稀少成分检出能力的方法，其中，将超活染色液和尿待检体以成为1：3～1：9的比率混合而进行染色。
[0042]
[项30]根据项27～29中任一项所述的尿沉渣检查中提高稀少成分检出能力的方法，其包括在尿中有形成分分析装置中对进行了染色的尿待检体进行拍摄的工序。
[0043]
发明的效果
[0044]
通过本发明，能够抑制在尿沉渣检查中杂质被染色。另外，另一方面中，根据本发明，在尿沉渣检查中，皮细胞、管型等稀少成分也能够高灵敏度地检出。因此，例如使用自动分析装置对尿试样中的有形成分进行分析时，能实现高精度的分析。
附图说明
[0045]
图1为示出使用染色液1的尿沉渣检查的拍摄图像的图。
[0046]
图2为示出使用s染色液的尿沉渣检查的拍摄图像的图。
[0047]
图3为示出使用sm染色液的尿沉渣检查的拍摄图像的图。
[0048]
图4为示出使用pb染色液的尿沉渣检查的拍摄图像的图。
[0049]
图5为示出使用h染色液的尿沉渣检查的拍摄图像的图。
[0050]
图6为示出使用染色液1的尿沉渣检查的拍摄图像的2值化图像的图。
[0051]
图7为示出使用s染色液的尿沉渣检查的拍摄图像的2值化图像的图。
[0052]
图8为示出使用sm染色液的尿沉渣检查的拍摄图像的2值化图像的图。
[0053]
图9为示出使用pb染色液的尿沉渣检查的拍摄图像的2值化图像的图。
[0054]
图10为示出使用h染色液的尿沉渣检查的拍摄图像的2值化图像的图。
具体实施方式
[0055]
本发明的实施方式的详细说明如下所述，但本发明不限定于此。需要说明的是，对于本说明书中使用的术语，只要没有特别说明，则应当理解为以本领域中通常使用的含义来使用。
[0056]
另外，本说明书中记载的非专利文献及专利文献全部作为参考被援引至本说明书中。本说明书中的“～”是指“以上且
……
以下”，例如说明书中记载为“x～y”时表示“x以上且y以下”。另外，本说明书中的“和/或”是指任一者或两者。另外，本说明书中，对于单数形式的表述，只要没有另外说明，则应当理解为也包括其复数形式的概念。
[0057]
(1.尿沉渣检查用的超活染色液)
[0058]
一个实施方式中，本发明提供一种尿沉渣检查用的超活染色液，其含有具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素。
[0059]
尿沉渣检查例如为：诊断肾脏、泌尿系统的疾病时等，作为其诊断的辅助，对尿待检体中的红细胞、白细胞等有形成分的种类、量进行观察
·
分类
·
测量的检查。以往，进行的是检查技师手动在被检者的尿待检体中添加/混合染色液来制作标本，在显微镜下进行观察的方法，但为了减轻检查技师的操作负担、提供一致的检查结果，近年也广泛使用自动化尿中有形成分分析装置等。作为这样的使用有形成分分析装置的尿沉渣检查，已知有：利用直接以自动化方式进行显微镜下的成分图像解析的图像处理方式的尿沉渣检查法、基于将尿待检体与染色液的悬浮液流入流动室并测定对激光的散射光、荧光等的流式细胞仪法的尿沉渣检查法等。本发明的超活染色液可以在任意的尿沉渣检查中使用，例如，可以在手动的尿沉渣检查中使用，也可以在利用有形成分分析装置的尿沉渣检查中使用。在不利用目视的机械判别中，从通过抑制杂质的染色能够实现更准确的判定、也能够实现稀少成分的检出的观点出发，优选的是，本发明在尿中有形成分分析装置中的尿沉渣检查中使用，尤其优选在图像处理式尿中有形成分分析装置中的尿沉渣检查中使用。
[0060]
已知有各种对活体成分进行染色的方法。其中，对活体内给与色素来对细胞进行染色的方法被称为“活体染色”，对取出到活体外的细胞在存活状态下进行染色的方法被称为“超活染色”。本发明作为超活染色用的染色液使用。
[0061]
本发明的超活染色液的一个特征在于，含有具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素。三芳基甲烷系色素为将在碳上键合有3个苯环的三芳基甲烷结构作为基本骨架的色素的总称。本发明的特征在于，三芳基甲烷系色素中，使用其结构中具有阴离子性官能团
者。作为阴离子性官能团，可以举出磺酸基、羧基、磷酸基、硫酸酯基等，但不限定于这些。优选的是，通过使用具有磺酸基作为阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素，能够更高度地发挥本发明的效果。本发明中使用的三芳基甲烷系色素能够在其结构中具有1个或多个(例如2个或3个)阴离子性官能团。另外，本发明中使用的三芳基甲烷系色素除了具有前述的阴离子性官能团以外、还可以具有阳离子性官能团。本发明基于以下预想不到的见解：在尿沉渣检查的超活染色液中使用这样的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的情况下，可抑制尿中杂质的染色性、并且能够特异性地对尿中有形成分的细胞核进行染色。
[0062]
一个实施方式中，本发明中使用的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素优选为水可溶性色素。水可溶性例如是指20℃下相对于水的溶解度为1g/l以上，优选为5g/l以上、优选为10g/l以上、优选为50g/l以上、优选为100g/l以上、优选为200g/l以上、更优选为250g/l以上(例如300g/l以上)。上限值没有特别限定，例如可以为1000g/l以下。
[0063]
本发明中使用的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的分子量只要发挥本发明的效果，就没有特别限定，例如优选为约500～1100、优选约600～1000、更优选约700～900。通过使用这样的分子量的三芳基甲烷系色素，能够稳定地发挥高的效果。
[0064]
一个实施方式中，本发明中使用的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素优选为在人的尿的ph附近(中性附近)稳定的色素。从该观点出发，本发明中使用的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素优选在ph6～8附近稳定、更优选在ph6～7附近稳定、尤其优选在ph6～6.5附近稳定。另外，本发明中使用的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素优选在前述ph的范围内显色。
[0065]
进而另一方面中，从使处理容易的观点出发，本发明中使用的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素优选致癌性低或没有致癌性，另外，从担心细菌变性的观点出发，本发明中使用的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素优选杀菌性低或没有杀菌性。进而，如后述那样与细胞质染色成分组合使用的情况下，优选为呈现出与该细胞质染色成分不同的色调的色素。例如，与作为细胞质染色成分的、曙红黄等呈现出红色系的成分组合的情况下，优选为呈现出蓝色系的三芳基甲烷系色素。
[0066]
具体而言，作为本发明中可使用的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素，可以使用该领域中公知的任意三芳基甲烷系色素，例如，作为具有磺酸基的三芳基甲烷系色素，可以适宜使用甲基蓝(别名：酸性蓝93)、专利蓝(patent blue)v(别名：酸性蓝1)、专利蓝a(别名：酸性蓝7)、海王星绿sbx(neptune green sbx)(别名：酸性蓝11)、阿西兰亮蓝r(别名：酸性蓝24)、酸性固紫(acid fast violet)bg(别名：酸性蓝34)、酸性亮蓝(brilliant acid blue)b(别名：酸性蓝38)、亮蓝r(别名：酸性蓝83)、亮蓝fcf(别名：酸性蓝9)、亮蓝g(别名：酸性蓝90)、分散艳蓝(brilliant discharge blue)g(别名：酸性蓝91)、酸性蓝、酸性蓝13、酸性蓝15、酸性蓝100、酸性蓝103、酸性蓝104、酸性蓝269等。优选的是，本发明中，作为具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素，可以使用甲基蓝或亮蓝g，更优选可以使用甲基蓝。进而在本发明中，可以仅使用1种如上所述的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素，也可以组合使用2种以上。
[0067]
甲基蓝(cas no.28983-56-4)是分子式由c
37h27
n3na2o9s3表示、已知在水中的溶解性高的公知的化合物(在水中的溶解性：300g/l(20℃)、分子量：799.8)。以往，已知甲基蓝为在中性附近的ph将胶原纤维等结缔组织、胶原蛋白染为蓝色的色素，已知既没有致癌性
body)染色法、中性红
·
詹纳斯绿超活染色法、亮甲酚蓝染色法(“临床检查手册1尿沉渣”、“临床检查技术全书3血液检查”、“临床检查法提要”、“染色法的全部medical technology增刊”)等。
[0075]
本发明人等对染色法进行了进一步深入研究，结果发现了在进行尿中有形成分的拍摄的分析装置中能够在不将背景中出现的杂质染色的情况下进行染色的染色成分。具体得到了以下见解：通过使用具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素作为对核进行染色的成分，在尿沉渣检查中尿中杂质的染色得以抑制，能够实现目标细胞的高灵敏度的检出。也如后述的试验例的结果所示，能够确认该效果在例如组合使用曙红黄或曙红蓝等对细胞质类进行染色的成分的情况下可得到优选的结果。进一步特定的方式中，清楚了本发明的超活染色液也能提高上皮细胞和/或管型等稀少成分的检出灵敏度，这些稀少成分有通常难以通过以往的方法来染色的倾向。
[0076]
本发明的超活染色液包含细胞质染色成分的情况下，对于细胞质染色成分相对于具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的混合比率，只要发挥本发明的效果，就没有特别限定。例如细胞质染色成分(优选曙红黄、曙红蓝等)相对于具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的优选的混合比率以摩尔比率计为0.2～10、优选为0.4～9、更优选为0.5～8、进一步优选为1～4。
[0077]
另外，对于本发明的超活染色液中的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的含量也是，只要发挥本发明的效果，就没有特别限定。例如，作为具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的含量，为1.0～15mmol/l，优选为1.5～12.0mmol/l，进一步优选为2.0～6.0mmol/l。
[0078]
本发明的超活染色液还包含细胞质染色成分的情况下，其含量也是，只要发挥本发明的效果，就没有特别限定。例如，作为细胞质染色成分(优选曙红黄、曙红蓝等)的含量，为0.3～12.0mmol/l，优选为1.0～12.0mmol/l，进一步优选为4.0～12.0mmol/l。
[0079]
为了降低尿待检体中所含的非晶质的盐类的影响，本发明的超活染色液优选还含有螯合剂。通过这样抑制非晶质的盐类的影响，从而尤其在利用图像处理式尿中有形成分分析装置的拍摄中，能够拍摄更清晰的图像。螯合剂可以使用该领域中公知的任意螯合剂，例如可以举出乙二胺四乙酸(edta)、次氮基三乙酸(nta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、羟基乙基乙二胺三乙酸(hedta)、三亚乙基四胺六乙酸(ttha)、1,3-丙二胺四乙酸(pdta)、1,3-二氨基-2-羟基丙烷四乙酸(dtpa-oh)、羟基乙基亚氨基二乙酸(hida)、二羟基乙基甘氨酸(dheg)、二醇醚二胺四乙酸(egta)、二羧基甲基谷氨酸(cmga)、(s,s)-乙二胺二琥珀酸(edds)、羟基亚乙基二膦酸(hedp)、次氮基三(亚甲基膦酸)(ntmp)、膦酰基丁烷三羧酸(pbtc)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(edtmp)、葡萄糖酸、o,o
’‑
双(2-氨基苯基)亚乙基二醇-n,n,n
’‑
四乙酸四钾盐水合物(bapta)、n,n-双(2-羟基乙基)甘氨酸(bicine)、反式-1,2-二氨基环己烷-n,n,n’,n
’‑
四乙酸一水合物(cydta)、亚氨基二乙酸(ida)、次氮基三乙酸(nta)、n,n,n’,n
’‑
四(2-吡啶基甲基)乙二胺(tpen)或它们的盐(例如，乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸氢三钠、及这些的水合物盐等)等。对于添加这样的螯合剂时的含量，只要发挥本发明的效果，就没有特别限定，例如为1～50mmol/l、优选设为5～30mmol/l、进一步优选设为10～25mmol/l为宜。
[0080]
本发明的超活染色液可以为使前述的染色成分溶解于任意溶剂而成的溶液。对于
此处使用的溶剂，只要能发挥本发明的效果，就没有特别限定，例如可以为水、无机溶剂、有机溶剂等任意液体。从不使观察的细胞成分萎缩的观点出发，优选为水或无机溶剂，而不是sm染色法中使用的乙醇等有机溶剂，尤其优选为水。
[0081]
在特定的实施方式中，本发明的尿沉渣检查用的超活染色液优选实质上不含有有机溶剂。本说明书中，实质上不含有有机溶剂是指，超活染色液中的有机溶剂的含量不足5体积％、优选不足3体积％、更优选不足1。
[0082]
进而，出于含有的染色成分的稳定化及调整将试样与染色液混合时的ph的目的，还可以包含缓冲液。作为这样的缓冲液，可举出tris缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、good缓冲液等，tris缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液的ph容易根据浓度、温度而发生变动，因此更优选good缓冲液。
[0083]
good缓冲液为两性离子缓冲液，其大多使用作为两性电解质的氨基酸、特别是取代氨基乙磺酸类或n-取代甘氨酸类作为缓冲剂，其中，也包含一部分脂肪族胺、非两性离子缓冲液者。作为所述good缓冲剂，可例示出mes(pka6.15)、bis-tris(pka6.46)、ada(pka6.80)、pipes(pka6.80)、aces(pka6.90)、氯化胆胺(cholamine chloride)(pka7.10)、bes(pka7.15)、mops(pka7.20)、tes(pka7.50)、hepes(pka7.55)、hepps(pka8.00)、tricine(pka8.15)、甘氨酸酰胺(pka8.20)、bicine(pka8.35)、taps(pka8.40)、ches(pka9.50)及caps(pka10.40)等。
[0084]
作为本发明中使用的缓冲液，出于提高染色成分的稳定性的目的，优选在中性附近的ph具有缓冲能力的good缓冲液。更适当的是，优选在ph6～8具有缓冲能力的good缓冲液。
[0085]
进一步优选的是，可以说健康人的尿的ph通常在中性附近(通常为ph6.0～6.5左右)，将尿待检体和染色液混合的情况下，从能够进一步在保持其原样的状态下分析尿中的有形成分的状态的方面出发，优选在ph6.0～7.0具有缓冲能力的good缓冲液。
[0086]
具体而言，优选mes(pka6.15)、bis-tris(pka6.46)、ada(pka6.80)、pipes(pka6.80)、aces(pka6.90)。
[0087]
另外，本发明的超活染色液中可以在没有影响的范围内添加防腐剂、盐类、染色成分稳定化剂等。
[0088]
作为防腐剂，可举出proclin 150、proclin 200、proclin 300、proclin 950、叠氮化物、螯合剂、抗生素、抗菌剂等。
[0089]
作为抗生素，可举出庆大霉素、卡那霉素、氯霉素等。
[0090]
作为抗菌剂，可举出甲基异噻唑啉酮、咪唑烷基脲(imidazolidinyl urea)等。
[0091]
作为盐类，可举出氯化钠、氯化钾、氯化铝等。
[0092]
作为染色成分稳定化剂，可举出环糊精等。
[0093]
作为本发明的尿沉渣检查的分析中使用的试样，可以为源自从包括人在内的哺乳动物采取的尿的试样(也称为尿待检体)。例如，本发明中可以使用原尿、浓缩尿、离心分离后的尿沉渣等任意试样。进而，本发明的超活染色液可以不仅用于尿待检体、还可以用于例如血液、腹腔积液、脑脊髓液等生物体体液、饮料、食品等人所摄取的物质等。
[0094]
使用本发明的超活染色液进行尿沉渣检查的情况下，作为本发明的超活染色液与试样的混合比率，没有特别限定，例如可以设为1：1～1：10，优选为1：3～1：9，其中特别优选
为1：3～1：6。如后述的试验例的结果所示，通过以这样的比率将超活染色液和尿待检体混合，能够提高在尿沉渣检查中上皮细胞和/或管型等稀少成分的检出能力。
[0095]
因此，本发明的超活染色液以与试样成为如上所述的混合比率的方式使用的情况下，该超活染色液也可以说是用于提高尿沉渣检查中的稀少成分的检出能力的尿沉渣检查用的超活染色液。
[0096]
作为在尿沉渣检查中可观察到的上皮细胞，例如可举出肾小管上皮细胞、尿路上皮细胞、柱状上皮细胞、鳞状上皮细胞、肾小球上皮细胞等，但不限定于这些。另外，作为在尿沉渣检查中可观察到的管型，可举出透明管型、上皮管型、颗粒管型、蜡样管型、脂肪管型、红细胞管型、白细胞管型、空泡变性管型、盐类
·
结晶管型、巨噬细胞管型、纤维蛋白管型、血铁黄素管型(hemosiderin cast)、肌红蛋白管型、bence jones蛋白管型等，但不限定于这些。通过改变本发明的超活染色液与试样的混合比率，能够提高这样的上皮细胞和/或管型的稀少成分的检出率。
[0097]
(2.尿沉渣检查方法)
[0098]
本发明的超活染色液可以在进行超活染色的任意尿沉渣检查法中使用。一个实施方式中，本发明的尿沉渣检查方法可以为包括利用前述本发明的超活染色液对尿待检体进行染色的工序的尿沉渣检查方法。此处，尿沉渣检查方法例如可以为检查技师通过手动进行超活染色的尿沉渣检查，也可以为利用自动化地进行超活染色的尿中有形成分分析装置的尿沉渣检查。作为利用使用超活染色液的尿中有形成分分析装置的尿沉渣检查法，可以为基于流式细胞仪法的尿沉渣检查，也可以为利用使用直接以自动化方式进行显微镜下的尿中有形成分分析的图像处理式尿中有形成分分析装置的尿沉渣检查。从通过抑制尿中杂质的染色，从而背景噪音降低，能够容易实现焦点集中于目标细胞的拍摄，能够抑制发生尿中有形成分的错误分类的观点出发，优选为利用图像处理式尿中有形成分分析装置的尿沉渣检查。
[0099]
在特定的实施方式中，本发明中进行的利用尿中有形成分分析装置的尿沉渣检查包括利用前述本发明的超活染色液对尿待检体进行染色的工序。该染色工序可以通过该领域中公知的任意方法进行，例如，可以在样品管、反应管等容器内或拍摄中所用的载玻片(沉渣用板、镜检板)上，以规定的比例添加前述的超活染色液和尿待检体并混合，由此对尿待检体进行染色。尿待检体优选在用于尿沉渣检查前进行搅拌后使用。另外，可以在采取有尿待检体的容器内添加本发明的超活染色液并混合，也可以在预先添加有超活染色液的容器内添加尿待检体并混合。
[0100]
已经获知，本发明的超活染色液通过以规定的比率与尿待检体混合，从而上皮细胞和/或管型等稀少成分的检出能力会提高。因此，强烈要求这种稀少成分的检出能力提高的情况下，本发明的超活染色液和尿待检体优选以成为1：3～1：9的比率进行混合而进行染色、更优选以成为1：3～1：6的比率进行染色。
[0101]
因此，一个实施方式中，本发明的尿沉渣检查用的超活染色液为，按照在与尿待检体混合时超活染色液和尿待检体以成为1：3～1：9的比率进行混合的方式使用的尿沉渣检查用的超活染色液。其中优选的实施方式为含有具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素及细胞质染色成分、细胞质染色成分相对于具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的摩尔比为0.5～8、并且按照超活染色液和尿待检体以成为1：3～1：9的比率进行混合的方式使
用的尿沉渣检查用的超活染色液。
[0102]
一个实施方式中，本发明中进行的利用尿中有形成分分析装置的尿沉渣检查包括在尿中有形成分分析装置中对进行了染色的尿待检体进行拍摄的工序。拍摄工序可以在具备在显微镜下对进行了染色的尿待检体进行拍摄的机构的尿中有形成分分析装置中实施。例如可以在具备下述机构的尿中有形成分分析装置中实施：对用超活染色液进行了染色的尿待检体中的有形成分进行拍摄的载物台(stage)、放大尿待检体中的有形成分的标本图像的机构、将焦点集合于标本图像并对该图像进行拍摄的机构、和根据需要对拍摄到的图像进行处理从而识别为各种成分的机构等。已知这种图像处理式尿中有形成分分析装置的尿沉渣检查存在以下不充分的情况：上皮细胞、管型的详细的分类存在由机种引起的差异(非专利文献1)。根据本发明，即使为这样的上皮细胞、管型，也能够提高检出能力，因此对利用图像处理式尿中有形成分分析装置的尿沉渣检查特别有益。
[0103]
(3.尿沉渣检查中抑制杂质染色的方法)
[0104]
如前所述，根据本发明，通过使用含有特定色素的超活染色液，能够高度抑制尿沉渣检查中的杂质的染色。
[0105]
因此，本发明从进一步另外的观点出发，提供一种尿沉渣检查中抑制杂质染色的方法，其包括利用前述本发明的尿沉渣检查用的超活染色液对尿待检体进行染色的工序。该方法中使用的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的种类、浓度、其他可配混的细胞质染色成分等任意成分的种类、浓度、本发明的超活染色液与尿待检体的混合比率等使用方法等与前述“1.尿沉渣检查用的超活染色液”及“2.尿沉渣检查方法”中的说明同样。
[0106]
(4.尿沉渣检查中提高稀少成分检出能力的方法)
[0107]
如前所述，根据本发明，通过使用含有特定色素的超活染色液，而且通过进而将该超活染色液以特定的混合比率与尿待检体混合，能够提高已知尿沉渣检查中检出容易不充分的上皮细胞和/或管型等稀少成分的检出能力。
[0108]
因此，本发明从进一步另外的观点出发，提供一种尿沉渣检查中提高稀少成分检出能力的方法，其包括利用前述本发明的尿沉渣检查用的超活染色液对尿待检体进行染色的工序。该方法中使用的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的种类、浓度、其他可配混的细胞质染色成分等任意成分的种类、浓度、本发明的超活染色液与尿待检体的混合比率等使用方法等与前述“1.尿沉渣检查用的超活染色液”及“2.尿沉渣检查方法”中的说明同样。
[0109]
实施例
[0110]
以下通过实施例示出本发明的效果，但这些实施例不对本发明有任何限定。
[0111]
(实施例1)适于有形成分分析装置的染色液的比较
[0112]
使用尿作为试样，使用以下的染色液、装置，对适于有形成分分析装置的染色液进行研究。需要说明的是，染色液和待检体以1：4混合并实施测定。
[0113]
[染色液的制备]
[0114]
制备包含下述组成的染色液。
[0115]
(染色液1)
[0116]
mes-naoh 100mm ph6.3
[0117]
甲基蓝3mmol/l
[0118]
曙红黄6mmol/l
[0119]
作为比较，使用sternheimer染色液(s染色液)、sternheimer-malbin染色液(sm染色液)及prescott-brodie染色法(pb染色液)、hansel染色液(h染色液)。
[0120]
[测定]
[0121]
使用尿中有形成分分析装置uscanner(注册商标)(e)(东洋纺制)，分别使用上述染色液1及s染色液、sm染色液、pb染色液、h染色液，按照装置的包装说明书的测定法，对尿试样进行测定。
[0122]
将尿试样的拍摄结果示于图1～5。进而，为了使背景的杂质的染色的程度更明确，将使用各个染色液的情况下的2值化图像示于图6～10。如图所示，确认了，对于s染色液、sm染色液、pb染色液及h染色液而言，会将背景中出现的杂质染色，成为成分的错认原因，装置中的准确的分析困难，但染色液1未将杂质染色，能够更准确地进行有形成分的分析。sm染色液为在95％乙醇中将作为不具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的结晶紫和番红o混合而成的染色液，h染色液为在含有甲醇和乙醇的磷酸缓冲生理食盐水中将作为吩噻嗪系色素的亚甲基蓝和曙红黄混合而成的染色液。根据本实施例的结果可知，至少包含具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素(甲基蓝)是重要的。
[0123]
(实施例2)染色成分的混合比率的研究1
[0124]
改变染色成分的混合比率，制作以下的染色液。与实施例1同样地使用尿作为试样，使用uscanner(注册商标)(e)实施测定，进行适于有形成分分析装置的染色液染色成分的混合比率的研究。需要说明的是，染色液和待检体以1：3混合，作为对照，通过目视对相同尿试样进行镜检。
[0125]
[染色液的制备]
[0126]
(染色液2～8)
[0127]
pipes-naoh 100mm ph6.5
[0128]
甲基蓝(mb)参照以下表1
[0129]
曙红黄(ey)参照以下表1
[0130]
[表1]
[0131]
染色液2染色液3染色液4染色液5染色液6染色液7染色液8mb(mmol/l)12.06.03.02.01.52.01.0ey(mmol/l)6.06.06.08.012.00.310.0ey/mb比0.51.02.04.08.00.210.0
[0132]
将尿试样的分析结果示于表2。对于研究的染色液，染色液2～6为与对照的镜检结果同样良好的分析结果，对于染色液7、染色液8，确认了难以进行准确的成分分析。根据以上可知，曙红黄相对于甲基蓝的优选混合比率以摩尔比率计为0.5～8。
[0133]
[表2]
[0134][0135]
(实施例3)稀少成分的分析研究
[0136]
改变染色液与待检体的混合比率，研究是否能实现稀少成分的检出。染色液使用以下记载的染色液9，与实施例1同样地使用尿作为试样，使用uscanner(注册商标)(e)实施测定。作为对照，以染色液：待检体＝1：4混合，通过目视对相同尿试样进行镜检。
[0137]
[染色液的制备]
[0138]
制备包含下述组成的染色液。
[0139]
(染色液9)
[0140]
mes-naoh 100mm ph6.0
[0141]
乙二胺四乙酸氢三钾20mmol/l
[0142]
甲基蓝2mmol/l
[0143]
曙红黄4mmol/l
[0144]
将尿试样的分析结果示于表3。与镜检相比较，确认了，随着使染色液：待检体的比率从1：9到1：3，能够进一步检出的成分增加。特别是确认上皮细胞(本例中确认肾小管上皮)、管型等稀少成分的检出能力提高了。另外可知，即使在待检体的比率上升、染色液的比率降低的情况下，通过使用本发明的染色液，也能够充分实现成分的染色。
[0145]
[表3]
[0146][0147]
(实施例4)染色成分的混合比率的研究2
[0148]
为了确认使用其他具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素的情况下也可得到同样的效果，进行以下的试验。
[0149]
首先，改变染色成分的混合比率，制作以下的染色液。本试验例中，使用亮蓝g作为
具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素，进而使用曙红蓝作为细胞质染色成分。使用尿作为试样，使用uscanner(注册商标)(e)实施测定，进行适于有形成分分析装置的染色液染色成分的混合比率的评价。需要说明的是，染色液和待检体以1：3混合，作为对照，通过目视对相同尿试样进行镜检。
[0150]
[染色液的制备]
[0151]
(染色液10～16)
[0152]
pipes-naoh 100mm ph6.5
[0153]
乙二胺四乙酸氢三钾20mmol/l
[0154]
亮蓝g(bg)参照以下表4
[0155]
曙红蓝(eb)参照以下表4
[0156]
[表4]
[0157][0158]
将该尿试样的分析结果示于表5。将包含与甲基蓝同样为可溶性且分子量为700～900的具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素(亮蓝g)的染色液和细胞质染色成分以规定量混合的情况下，确认为与对照的镜检结果同样良好的分析结果。具体而言，确认了染色液10～14为与对照的镜检结果同样良好的分析结果，但染色液15、染色液16难以准确地进行分析。根据以上显示，曙红蓝相对于亮蓝g的优选混合比率以摩尔比率计为0.5～8。根据本试验例的结果能够确认，通过任意具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素及任意细胞质染色成分的组合，可得到同样的效果。
[0159]
[表5]
[0160][0161]
(实施例5)染色成分的组合研究
[0162]
进而，改变染色成分的组合，制作以下的染色液。使用尿作为试样，使用uscanner(注册商标)(e)实施测定，进行适于有形成分分析装置的染色液染色成分的混合比率的研究。需要说明的是，染色液和待检体以1：3混合，作为对照，通过目视对相同尿试样进行镜检。
[0163]
[染色液的制备]
[0164]
(染色液17)
[0165]
pipes-naoh 100mm ph6.5
[0166]
乙二胺四乙酸氢三钾20mmol/l
[0167]
甲基蓝(mb)3mmol/l
[0168]
曙红蓝(eb)6mmol/l
[0169]
(染色液18)
[0170]
pipes-naoh 100mm ph6.5
[0171]
乙二胺四乙酸氢三钾20mmol/l
[0172]
亮蓝g(bg)3mmol/l
[0173]
曙红黄(ey)6mmol/l
[0174]
将尿试样的分析结果示于表6。确认了，通过使用以规定量混合有具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素(甲基蓝或亮蓝g)和细胞质染色成分(曙红蓝或曙红黄)的染色液，可得到与对照的镜检结果同样良好的分析结果。根据以上的结果确认了，本发明的效果可以通过具有阴离子性官能团的三芳基甲烷系色素及细胞质染色成分的任意的组合来发挥。
[0175]
[表6]
[0176][0177]
产业上的可利用性
[0178]
通过本发明，在使用有形成分分析装置通过拍摄对试样中的有形成分进行分析中，能够实现准确的测定和稀少成分的更高度的分析。