一种液相色谱-串联质谱法同时测定电子烟烟液中有机酸和烟碱含量的方法与流程

1.本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种液相色谱-串联质谱法同时测定电子烟烟液中有机酸和烟碱含量的方法。


背景技术：

2.电子烟烟液是电子烟产品的重要组成部分，电子烟烟液经电子烟器具雾化产生含有烟碱及其他物质的可吸入气溶胶。电子烟中烟碱盐种类主要有烟碱苯甲酸盐、乳酸盐、乙酰丙酸盐、水杨酸盐、酒石酸盐等，但是，尚未有文献报道同时测定电子烟烟液中烟碱及多种类型有机酸的分析方法。harvanko等(nicotine tob res,2019,22(7):1239-1243.)采用气相色谱-质谱联用法(gc-ms)及液相色谱-质谱法(lc-ms)对电子烟烟液中的有机酸类型进行定性测定，但是，gc-ms样品前处理需要复杂的衍生化过程，分析过程费时费力，hplc-ms仅对有机酸进行定性分析，没有进行方法验证，没有实现对目标物的定量分析，且该方法没有实现对烟碱的同时测定(烟碱使用气相色谱法进行定量分析)。再者，由于电子烟口味繁多，基质多样，可能存在数百种添加剂(sci rep,2019,9:1-9.)，hplc-ms使用单四级杆进行定性分析，可能存在基质干扰，目标物定性准确性不足。液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)具有快速、灵敏、重现性好、通量高等优点，在同时测定电子烟烟液中有机酸和烟碱含量方面有广阔的应用前景，但目前未见相关报道。


技术实现要素：

3.本发明的目的正是基于上述技术不足，建立了一种液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)同时测定电子烟烟液中有机酸和烟碱含量的方法，该方法实现了同时测定电子烟烟液中烟碱、苯甲酸、水杨酸、丙酮酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乙酰丙酸、乳酸、山梨酸、丁二酸的含量，具有操作简单、通量高、定性及定量准确、分离度好的优点，适合电子烟烟液中有机酸和烟碱的分析及测定。
4.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
5.一种液相色谱-串联质谱法同时测定电子烟烟液中有机酸和烟碱含量的方法，该方法包括如下步骤：
6.(1)称取电子烟烟液于离心管中，加入内标溶液和甲醇，涡旋振荡，备用；
7.(2)将步骤(1)得到的萃取液进行液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)分析；
8.(3)采用内标标准曲线法定量计算样品中目标物的含量。
9.优选地，在步骤(1)中，所述内标溶液为苯甲酸-d5和烟碱-d3的甲醇溶液，浓度分别为500μg/ml和400μg/ml。
10.优选地，在步骤(1)中，所述甲醇的体积为5～20ml，优选为10ml。
11.优选地，在步骤(1)中，所述涡旋振荡的时间为5～30分钟，优选为5分钟。
12.优选地，在步骤(2)中，所述液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)分析中使用的色谱柱
为phenomenex kinetex hilic(4.6
×
150mm，2.6μm)、phenomenex luna c18(2)(4.6
×
150mm，3μm)、waters xbridge beh amide(2.1
×
100mm，2.5μm)或thermo scientific acclaim trinity p1(3
×
100mm，3μm)色谱柱，优选为waters xbridge beh amide(2.1
×
100mm，2.5μm)色谱柱。
13.优选地，在步骤(2)中，所述液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)分析中使用的流动相为水及乙腈、5mmol/l乙酸铵溶液及含浓度为5mmol/l乙酸铵的乙腈/水(v:v＝95/5)溶液或者5mmol/l乙酸铵溶液(ph 9.0)及含浓度为5mmol/l乙酸铵的乙腈/水(v:v＝95/5，ph 9.0)溶液，优选为5mmol/l乙酸铵溶液(ph 9.0)及含浓度为5mmol/l乙酸铵的乙腈/水(v:v＝95/5，ph 9.0)。
14.优选地，在步骤(2)中，所述液相色谱-串联质谱分析的色谱条件还包括：柱温为40℃；梯度洗脱程序为：初始流速0.6ml/min，0.5min时流速降至0.4ml/min，7.2min时流速升至0.6ml/min，保持1.8min，运行总时间为9min；进样体积为1μl。
15.优选地，在步骤(2)中，所述液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)分析中使用的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；离子化方式：esi( )；检测模式：mrm模式；锥孔温度(cone temperature)：130℃；电喷雾电压(spray voltage)：4000v( )，3500v(-)；锥孔气流速(cone gas flow)：20psi；加热探针温度(heated probe temperature)：350℃；探针气流速(probe gas flow)：50psi；雾化器气流速(nebulizer gas flow)：55psi。
16.优选地，在步骤(2)中，目标化合物和内标的mrm质谱检测参数如下：
[0017][0018][0019]
优选地，在步骤(3)中，所述内标标准曲线法为：配制含有目标物的系列标准工作溶液，加入内标(苯甲酸-d5及烟碱-d3)，以各标准工作溶液中目标物与内标物的定量离子峰面积比为纵坐标，以各标准工作溶液中目标物的含量为横坐标制作标准工作曲线；将步骤(2)的分析结果代入标准曲线中，得到待测溶液中的目标物含量，再进一步计算得到样品中各目标物的含量。
[0020]
优选地，在步骤(3)中，所述系列标准工作溶液中各目标物的浓度范围为：烟碱为0.10～100μg/ml，柠檬酸为10-100μg/ml，酒石酸为5-100μg/ml，丙酮酸和乳酸为1-100μg/ml，乙酰丙酸为0.5-100μg/ml，其他有机酸为0.1-100μg/ml。
[0021]
优选地，所述有机酸包括苯甲酸、水杨酸、丙酮酸、乳酸、丁二酸、乙酰丙酸、山梨酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸等。
[0022]
优选地，在一个具体的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0023]
(1)称取电子烟烟液于离心管中，加入内标溶液和甲醇，涡旋振荡，备用；
[0024]
(2)将步骤(1)得到的萃取液进行液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)分析；
[0025]
其中，液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)分析使用的色谱条件：色谱柱为waters xbridge beh amide色谱柱(2.1
×
100mm，2.5μm)，柱温为40℃；流动相为5mmol/l乙酸铵溶液(ph 9.0)及含浓度为5mmol/l乙酸铵的乙腈/水(v:v＝95/5，ph 9.0)溶液，梯度洗脱程序为：初始流速0.6ml/min，0.5min时流速降至0.4ml/min，7.2min时流速升至0.6ml/min，保持1.8min，运行总时间为9min；进样体积为1μl。
[0026]
液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)分析使用的质谱条件：离子源：电喷雾离子源；离子化方式：esi( )；检测模式：mrm模式；锥孔温度(cone temperature)：130℃；电喷雾电压(spray voltage)：4000v( )，3500v(-)；锥孔气流速(cone gas flow)：20psi；加热探针温度(heated probe temperature)：350℃；探针气流速(probe gas flow)：50psi；雾化器气流速(nebulizer gas flow)：55psi；
[0027]
目标化合物和内标的mrm质谱检测参数如下：
[0028][0029]
注：“*”表示定量离子。
[0030]
(3)采用内标标准曲线法定量计算样品中目标物的含量。
[0031]
其中内标标准曲线法为：配制含有目标物的系列标准工作溶液，加入内标(苯甲酸-d5及烟碱-d3)，以各标准工作溶液中目标物与内标物的定量离子峰面积比为纵坐标，以各标准工作溶液中目标物的含量为横坐标制作标准工作曲线；将步骤(2)的分析结果代入标准曲线中，得到待测溶液中的目标物含量，再进一步计算得到样品中各目标物的含量；
[0032]
所述系列标准工作溶液中各目标物的浓度范围为：烟碱为0.10～100μg/ml，柠檬酸为10-100μg/ml，酒石酸为5-100μg/ml，丙酮酸和乳酸为1-100μg/ml，乙酰丙酸为0.5-100μg/ml，其他有机酸为0.1-100μg/ml。
[0033]
与现有技术相比较，本发明至少具有以下有益的技术效果：
[0034]
本发明基于lc-ms/ms技术，对色谱柱的选择、流动相组成、流动相流速和质谱条件
等进行了考察，建立了一种电子烟烟液中非挥发性有机酸和烟碱的分析方法，实现了苯甲酸、水杨酸、丙酮酸、乳酸、丁二酸、乙酰丙酸、山梨酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸和烟碱的同时分析方法，具有通量高、分离度好、操作简便、回收率及重复性好等优点，适合电子烟烟液中非挥发性有机酸和烟碱的分析。
附图说明
[0035]
图1为实施例1中hplc-ms/ms方法中标准工作溶液中目标物及其内标多反应监测(mrm)色谱图。
具体实施方式
[0036]
以下结合具体实施的方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
[0037]
实施例1：一种液相色谱-串联质谱法同时测定电子烟烟液中10种烟碱盐含量的方法
[0038]
(1)仪器与试剂
[0039]
仪器：液相色谱-串联质谱仪(hplc-ms/ms)系统由美国agilent 1290超高效液相色谱仪(包括g7129b自动进样器、g7120a四元溶剂泵、g1316b柱温箱)及bruker evoq三重四极杆质谱仪(配esi离子源)组成，数据采集与处理软件为hystar software；超声仪(ym-100s，语盟)；电子天平(ae163，瑞士mettler公司，感量：0.0001g)；talboys数显型多管式旋涡混合器。
[0040]
试剂耗材：苯甲酸、乳酸、乙酰丙酸、水杨酸、丁二酸、山梨酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、丙酮酸及烟碱购于alfa aesar，纯度大于88％；苯甲酸-d5和烟碱-d3购于macklin，纯度大于98％，甲醇(色谱纯)购于merck，甲酸铵(纯度大于99％)购于macklin，所用超纯水由milli-q系统(milford，ma，usa)制得。
[0041]
(2)仪器工作条件
[0042]
本实验采用agilent 1290超高效液相色谱仪，色谱柱为waters xbridge beh amide(2.1
×
100mm，2.5μm)；流动相a：5mmol/l乙酸铵溶液(ph9.0)，流动相b：浓度为5mmol/l乙酸铵的乙腈/水(v:v＝95/5，ph 9.0)；进样量1μl，柱温40℃。梯度洗脱程序如下表所示：
[0043]
时间(min)a(％)b(％)流速(μl/min)0.000100600 0.500100400 7.005050400 7.200100600 9.000100600
[0044]
质谱条件：锥孔温度(cone temperature)：130℃；电喷雾电压(spray voltage)：4000v( )，3500v(-)；锥孔气流速(cone gas flow)：20psi；加热探针温度(heated probe temperature)：350℃；探针气流速(probe gas flow)：50psi；雾化器气流速(nebulizer gas flow)：55psi；目标化合物和内标的mrm质谱检测参数如下：
[0045][0046][0047]
液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)方法中标准工作溶液中目标物及其内标多反应监测(mrm)色谱图如图1所示。
[0048]
(3)样品前处理
[0049]
称取40mg电子烟烟液样品于15ml离心管中，加入100μl混合内标溶液(苯甲酸-d5浓度为500μg/ml，烟碱-d3浓度为400μg/ml)和10ml甲醇，振荡萃取5min，用0.22μm有机相滤膜过滤后置于色谱瓶中待测。
[0050]
(4)标准工作溶液配制
[0051]
①
、内标溶液的配制：分别准确称取50mg苯甲酸-d5、烟碱-d3，各置于10ml棕色容量瓶中，以甲醇定容，配制成浓度约为5mg/ml的内标储备液。取1ml苯甲酸-d5内标储备液、0.8ml烟碱-d3内标储备液，用甲醇定容至10ml，得到浓度为500μg/ml苯甲酸-d5、浓度为400μg/ml烟碱-d3内标溶液(内标)。其中烟碱-d3用于测定烟碱，苯甲酸-d5用于测定苯甲酸、乳酸、乙酰丙酸、水杨酸、丁二酸、山梨酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸和丙酮酸。
[0052]
②
、一级标准储备液的配制
[0053]
准确称取苯甲酸、乳酸、乙酰丙酸、水杨酸、丁二酸、山梨酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、丙酮酸和烟碱各2.0g，分别置于25ml棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度线，配制成浓度约为80mg/ml的标准品储备溶液。该溶液应在4℃～8℃条件下避光保存。
[0054]
③
、二级标准储备液的配制
[0055]
精密吸取一定体积的苯甲酸、乳酸、乙酰丙酸、水杨酸、丁二酸、山梨酸、柠檬酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸和烟碱储备液，置于50ml棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度线，配制成浓度为5mg/ml的混合二级标准储备溶液。
[0056]
④
、标准工作溶液的配制
[0057]
准确移取混合二级标准储备溶液和内标溶液，用甲醇配制成最终浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、20、40、50、80、100μg/ml的标准工作溶液，其中内标中苯甲酸-d5最终浓度为5μg/ml、烟碱-d3最终浓度为4μg/ml。
[0058]
(5)样品测定
[0059]
将步骤(4)所得标准曲线溶液和步骤(3)所得样品溶液分别进行hplc-ms/ms分析，标准工作溶液中目标物及其内标多反应监测(mrm)色谱图见附图。以各标准工作溶液中目标物与内标物的定量离子峰面积比为纵坐标，以各标准工作溶液中目标物的含量为纵坐标制作标准工作曲线；将步骤(3)的分析结果代入标准曲线中，得到待测溶液中的目标物含量，再进一步计算得到样品中各目标物的含量。
[0060]
(6)方法验证
[0061]
根据最低级标准工作溶液，按照3倍信噪比计算该方法的检出限，按照低、中、高3种添加水平计算加标回收率，每个水平添加5个平行样品，根据平行测试结果计算测试精密度。该方法的线性范围、线性系数、检出限、平均加标回收率、平均精密度如表1所示。
[0062]
表1各目标物线性范围、线性系数、检出限、平均加标回收率及平均精密度
[0063][0064]
(7)实际样品分析
[0065]
根据上述测定方法，选择5个电子烟烟液样品，测得目标物含量如表2所示：
[0066]
表2典型电子烟烟液样品中烟碱和有机酸含量结果(mg/g)
[0067][0068]
注：“/”表示未检出
[0069]
实施例2：色谱柱的选择实验
[0070]
考虑到有机酸的强极性化学性质，因此，主要选择了phenomenex公司的kinetex hilic(4.6
×
150mm，2.6μm)和luna c18(2)(4.6
×
150mm，3μm)、waters公司的xbridge beh amide(2.1
×
100mm，2.5μm)，以及thermo的scientific acclaim trinity p1(3
×
100mm，3μm)四种色谱柱比较。具体实验过程如实施例1所示。
[0071]
研究发现：
[0072]
①
、根据色谱柱推荐流动相(甲醇-甲酸铵溶液)，kinetex hilic色谱柱对有机酸分离效果不理想，且苹果酸、酒石酸、柠檬酸及烟碱在色谱柱上无保留，通过优化流动相条件对未保留化合物无改善；scientific acclaim trinity p1色谱柱对有机酸分离效果明显，但水杨酸、苹果酸、柠檬酸及烟碱在色谱柱上无保留。
[0073]
②
、luna c18(2)色谱柱对所有有机酸和烟碱均有保留，但乙酰丙酸和乳酸基线噪音较大，多数有机酸保留时间集中，分离效果不佳。进一步优化流动相洗脱比例和时间，改善效果不明显。
[0074]
③
、根据色谱柱推荐流动相(乙腈-乙酸铵溶液)，所有目标物均能够在xbridge beh amide色谱柱上保留，通过进一步优化流动相及梯度洗脱条件，取得较理想的分离效果。
[0075]
故最终确定的色谱柱为xbridge beh amide(2.1
×
100mm，2.5μm)色谱柱。
[0076]
实施例3：流动相的选择实验
[0077]
为了考察流动相对检测方法的影响，选择了以下几种流动相进行研究，水及乙腈、5mmol/l乙酸铵溶液及浓度为5mmol/l乙酸铵的乙腈/水(v:v＝95/5)、5mmol/l乙酸铵溶液(ph 9.0)及浓度为5mmol/l乙酸铵的乙腈/水(v:v＝95/5，ph 9.0)。除流动相外，其余方法参照实施例1。
[0078]
结果发现：
[0079]
①
、流动相中使用水或乙腈等溶剂，目标物中柠檬酸、酒石酸、乳酸、丁二酸未保留，影响化合物保留效果。
[0080]
②
、流动相中水相和有机相分别添加乙酸铵(5mmol/l乙酸铵溶液及浓度为5mmol/l乙酸铵的乙腈/水(v:v＝95/5))，目标物均有保留，柠檬酸、酒石酸响应较低。
[0081]
③
、调整流动相ph，使水相和有机相的ph均为9.0(5mmol/l乙酸铵溶液(ph 9.0)及浓度为5mmol/l乙酸铵的乙腈/水(v:v＝95/5，ph 9.0))，取得了较为理想的效果。
[0082]
故最终确定的流动相组成为方案
③
。
[0083]
实施例4：流动相流速的选择实验
[0084]
为了考察流动相流速对检测方法的影响，流动相的流速设置为0.4ml/min；以及初始流速0.6ml/min，0.5min时流速降至0.4ml/min，7.2min时流速升至0.6ml/min，保持1.8min，运行总时间为9min。除流动相的流速外，其余方法参照实施例1。
[0085]
研究发现：
[0086]
①
、0.4ml/min实验条件下，烟碱和水杨酸分离效果较差，且分析时间过长。
[0087]
②
、0.6ml/min，0.5min时流速降至0.4ml/min，7.2min时流速升至0.6ml/min，保持1.8min的梯度流速模式，兼顾了分离度及分析时间。
[0088]
故最终确定的流动相流速条件为初始流速0.6ml/min，0.5min时流速降至0.4ml/min，7.2min时流速升至0.6ml/min，保持1.8min。
[0089]
实施例5：质谱温度的选择实验
[0090]
为了考察锥孔温度对检测方法的影响，选择了100℃、120℃、130℃、150℃、200℃及300℃几种锥孔温度进行研究，除锥孔温度外，其余方法参照实施例1。
[0091]
结果发现：
[0092]
①
、锥孔温度对柠檬酸、乳酸、酒石酸和丁二酸影响较大，锥孔温度为100℃-130℃时，其中锥孔温度为120℃时柠檬酸响应最大，酒石酸、乳酸、丁二酸在温度为130℃时响应最大。
[0093]
②
、锥孔温度为130℃-300℃时，柠檬酸、乳酸、酒石酸和丁二酸响应递减。
[0094]
故最终确定的锥孔温度为130℃。