用于肿瘤检测、恶性程度和转移性评估的细胞外囊泡纳米红外光谱检测装置和应用的制作方法

1.本发明属于医学检测领域，具体设计一种用于乳腺癌检测、恶性程度评估和转移性评估的纳米红外检测装置和应用。


背景技术：

2.肿瘤发病率和死亡率高，严重危害公众健康。乳腺癌的发病率呈逐年递增之势，是威胁女性健康的"头号杀手"。对乳腺癌等肿瘤恶性程度和转移性的早期精确评估对指导治疗方案，延长肿瘤患者生存期至关重要。
3.蛋白质在肿瘤发生发展过程中发生着丰度和结构的动态变化，这些肿瘤相关蛋白质异质性为阐明肿瘤发病机制提供了信息，是肿瘤诊断和药物设计的重要生物标志物。细胞外囊泡是由细胞释放的膜囊泡，携带自源细胞蛋白质、核酸、脂类等生物分子，并将这些生物分子传递至受体细胞，影响受体细胞的表型和功能，从而在肿瘤发生和进展中发挥关键作用。肿瘤来源细胞外囊泡蛋白质的异质性反映肿瘤的恶性程度和肿瘤进展和转移的能力。对细胞外囊泡肿瘤相关蛋白质表达的异质性已经被大量蛋白质组学分析证实，然而对细胞外囊泡蛋白质二级结构特征异质性的研究很少。同时，由于细胞外囊泡的异质性和纯化困难，大体积样品批量分析可能对检测灵敏度和特异性造成影响。单个细胞外囊泡蛋白质二级结构特征异质性的检测提供了细胞外囊泡亚群的全面信息，并从复杂的背景中直接识别出与肿瘤相关蛋白异质性，有助于理解恶性转化的机制和开发肿瘤的潜在生物标志物。然而，由于细胞外囊泡的纳米级尺度，对单个细胞外囊泡蛋白质二级结构特征的检测技术具有很高的挑战性。纳米红外光谱是扫描探针显微镜和红外光谱的结合，利用金属化尖端作为单个等离子体放大器，在尖端以下100nm2范围内增强和捕获分子的原位光学吸收。这种高光学空间分辨率使得纳米红外光谱可以获得纳米尺度生物样品的局部吸收光谱，可用于检测单个细胞外囊泡蛋白质结构异质性。基于纳米红外光谱的细胞外囊泡蛋白质结构异质性检测，为阐明肿瘤发生发展机制，开发肿瘤标志物提供重要信息和方法。


技术实现要素：

4.因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种可用于乳腺癌检测、恶性程度评估和转移性评估的细胞外囊泡蛋白质二级结构特征分析装置和应用。
5.为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种用于肿瘤细胞外囊泡蛋白质二级结构特征分析检测装置，所述装置包括：
6.(1)细胞外囊泡提取机构：通过离心提取细胞培养上清中的细胞外囊泡；
7.(2)细胞外囊泡表征机构：对所述细胞外囊泡提取机构提取得到的细胞外囊泡进行表征，以确定确实提取到了细胞外囊泡，其中，所述表征指标选自以下一种或多种：形貌、大小、浓度；
8.(3)细胞外囊泡蛋白表达量信息测定机构：对所述细胞外囊泡提取机构提取的细
胞外囊泡进行蛋白表达量信息的测定；优选地，所述目标蛋白选自以下一种或多种：cd63蛋白、cd81蛋白、calnexin蛋白、hsp70蛋白；
9.(4)细胞外囊泡纳米红外光谱测定机构：对所述细胞外囊泡提取机构提取的细胞外囊泡进行纳米红外光谱测定，所述表征指标选自以下一种或多种：形貌、近场红外振幅图像、近场红外吸收光谱；
10.(5)细胞外囊泡蛋白质二级结构特征信息分析机构：对所述细胞外囊纳米红外光谱表征机构测定的纳米红外吸收光谱进行蛋白质二级结构特征特征分析，所述蛋白质二级结构特征选自以下一种或几种：酰胺i带/酰胺ii带比值、α螺旋和卷曲、β片层、反平行β片层和β转角含量比例；
11.根据本发明第一方面的装置，其中，所述细胞选自以下一种或多种：乳腺上皮细胞mcf-10a，乳腺癌细胞mcf-7，mda-mb-231。
12.根据本发明第一方面的装置，其中，所述细胞外囊泡提取机构中，所述细胞外囊泡的提取方法选自以下一种或多种：超速离心法、微孔膜过滤法，包括以下步骤：
13.(a)取细胞培养上清进行离心，第一次离心弃沉淀，取上清第二次离心弃掉沉淀，再次取上清第三次离心弃掉沉淀；
14.优选地，所述第一次离心速度为300g～1000g，优选为800g；第一次离心时间为10分钟；所述第二次离心速度为2000g～5000g，优选为2000g；第二次离心时间为20分钟；所述第三次离心速度为8000g～10000g，优选为10000g；第三次离心时间为1小时；所述离心温度为4℃；
15.(b)用滤膜过滤步骤(a)所得上清，过滤后的液体再次离心得沉淀，即得到细胞外囊泡；
16.优选地，所述滤膜孔径为100nm
–
500nm，优选为100nm和200nm；所述离心速度为100000～150000g，优选为100000g；所述离心时间为0.5～5小时，优选为2小时；所述离心温度为4℃。
17.优选地，所述细胞外囊泡的提取还包括以下步骤：
18.(c)将步骤(b)离心所得的沉淀，重悬在pbs中。
19.根据本发明第一方面的装置，其中，所述细胞外囊泡提取机构中，所述细胞培养上清的培养基含10％胎牛血清；
20.优选地，所述细胞外囊泡提取机构还包括以下操作机构：
21.在细胞外囊泡提取前将细胞培养上清的培养基换成用扣除细胞外囊泡的胎牛血清配制的培养基进行培养；优选地，所述更换时间为提取前24～48小时。
22.优选地，所述扣除细胞外囊泡的胎牛血清配制的培养基通过以下方法制备：
23.(i)将血清加入基础培养基中，使细胞培养基中血清浓度为30％；
24.(ii)将步骤(i)所得细胞培养基4℃条件下，超速离心；所述离心速度为100000～150000g，优选为134000g，所述离心时间为5～20小时，优选为10小时；
25.(iii)超速离心结束后，收集上清，用基础培养基将含30％血清的培养基稀释为fbs浓度为10％,加入1％的双抗；
26.(iv)用滤膜对培养基进行过滤，装瓶待用；优选地，所述滤膜孔径为0.22μm。
27.根据本发明第一方面的装置，其中，所述细胞外囊泡表征机构中，所述形貌表征的
机构为透射电镜，优选为生物型透射电镜；所述大小表征的机构为动态光散射机构和/或纳米颗粒跟踪分析机构；所述浓度表征的机构为纳米颗粒跟踪分析机构。
28.根据本发明第一方面的装置，其中，所述蛋白含量表征的机构为bca蛋白定量机构；所述蛋白表达量的测定机构为免疫印迹(western blot)机构。
29.所述bca蛋白定量，具体步骤和用量根据试剂盒的不同而不同。
30.所述免疫印迹机构测定蛋白表达量包括以下步骤：根据bca蛋白定量结果，取当量6～20μg蛋白的细胞外囊泡，利用电泳的方法跑胶对不同分子量大小的蛋白进行分离和鉴定；在对应分子量处孵育对应的抗体，并用化学发光法进行检测。
31.根据本发明第一方面的装置，其中，所述红外光谱测定机构测定单个细胞外囊泡蛋白质二级结构特征包括以下步骤：
32.(i)将细胞外囊泡分散滴在硅片基底上；
33.(ii)用纳米红外光谱仪扫描样品，在单个细胞外囊泡上采集红外光谱。光谱采集范围覆盖酰胺i和酰胺ii的特征波段；
34.(iii)利用二次导数光谱分析找出红外光谱中的特征峰位，利用特征峰位计算各种蛋白质结构在光谱中的面积占比；
35.(iv)利用受试者特征分析得到样本不同蛋白质结构与标准健康和恶性样本的关联值，用于评估样本细胞外囊泡的恶性程度。
36.本发明的第二方面提供了第一方面所述的装置在制备用于诊断和/或治疗癌症的医疗产品中的应用；优选地，所述癌症为乳腺癌；更优选地，所述应用为乳腺癌的诊断和/或恶性程度和/或转移性评估。
37.本发明涉及乳腺癌体外检测方面，涉及乳腺癌检测的蛋白质标志物领域，设计细胞外囊泡检测领域。本发明的主要目的是提供一种利用细胞外囊泡蛋白质二级结构特征进行乳腺癌体外检测方法。利用纳米红外光谱技术，可以对乳腺癌病人实现体外诊断，及恶性程度和转移性评估。该方法操作简便、成本低，检测过程迅速，节省样品量。除此之外，该方法有望对病情进行实时追踪，根据病情发展及时调节治疗方案，为实现个性化医疗提供了指导思路。
38.为实现上述目的，本发明的方案如下：
39.本发明所述应用至少包括乳腺癌的诊断，恶性程度评估，转移性评估等。
40.所述目标细胞外囊泡蛋白质二级结构特征特征至少包括酰胺i带/酰胺ii带比值、α螺旋和卷曲、β片层、反平行β片层和β转角含量比例等。
41.具体地，肿瘤组织提取细胞外囊泡步骤为：
42.(i)术中提取乳腺癌患者肿瘤组织，肿瘤组织储存于-80℃冰箱。
43.(ii)取步骤(i)所得肿瘤组织，在分离液中涡旋消化；所述肿瘤组织重量为50～200mg，优选为150mg，所述分离液为12.5μl酶a、50μl酶r、100μl酶h和2.2ml无血清细胞冻存培养基；所述涡旋次数为2～10次，优选为3次。
44.(iii)取步骤2所得组织悬液，第一次离心弃沉淀，取上清第二次离心弃掉沉淀，再次取上清第三次离心弃掉沉淀；
45.优选地，所述第一次离心速度为300g～1000g，优选为300g；第一次离心时间为10分钟；所述第二次离心速度为2000g～5000g，优选为2000g；第二次离心时间为10分钟；所述
第三次离心速度为8000g～10000g，优选为10000g；第三次离心时间为20分钟；所述离心温度为4℃；
46.(iv)用滤膜过滤步骤(iii)所得上清，过滤后的液体再次离心得沉淀，即得到细胞外囊泡；
47.优选地，所述滤膜孔径为0.22μm，；所述离心速度为100000～150000g，优选为150000g；所述离心时间为0.5～10小时，优选为7小时；所述离心温度为4℃。
48.优选地，所述细胞外囊泡的提取还包括以下步骤：
49.(v)将步骤(iv)离心所得的沉淀，重悬在pbs中。
50.本发明提供了一种单个细胞外囊泡纳米红外光谱蛋白二级结构分析方法，所述方法包括：
51.(1)检测受试者肿瘤组织来源细胞外囊泡酰胺i带/酰胺ii带比值、α螺旋和卷曲、β片层、反平行β片层和β转角含量在诊断或辅助诊断受试者是否为乳腺癌患者中的应用。
52.(2)检测受试者肿瘤组织来源细胞外囊泡酰胺i带/酰胺ii带比值、α螺旋和卷曲、β片层、反平行β片层和β转角含量对乳腺癌受试者肿瘤恶性程度和转移性进行评估中的应用。
53.本发明的用于乳腺癌检测、恶性程度评估和转移性评估的细胞外囊泡检测装置可以具有但不限于以下有益效果：
54.本发明公开了借助纳米红外光谱技术检测细胞外囊泡蛋白质二级结构特征作为诊断乳腺癌，及其恶性程度和转移性评估的应用。
55.本发明所述的蛋白质二级结构特征包括酰胺i带/酰胺ii带比值、α螺旋和卷曲、β片层、反平行β片层和β转角含量。
附图说明
56.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
57.图1示出了对所述三种细胞系提取的细胞外囊泡进行粒径测量结果。
58.图2示出了对所述三种细胞系提取的细胞外囊泡进行透射电镜表征图。
59.图3示出了免疫印迹法对所述三种细胞系提取的细胞外囊泡cd63、cd81、calnexin、hsp70和gapdh蛋白表达量测定的结果。
60.图4示出了在ν＝1430
–
1800cm-1
波长下对所述细胞系提取的细胞外囊泡的近场红外强度表征结果。
61.图5示出了对所述细胞系提取的细胞外囊泡的纳米红外吸收光谱。
62.图6示出了所述三种细胞系提取的细胞外囊泡酰胺i带/酰胺ii带比值。
63.图7示出了对所述细胞系提取的细胞外囊泡的纳米红外吸收光谱二阶求导的蛋白质二级结构特征的指认。
64.图8示出了所述三种细胞系提取的细胞外囊泡α螺旋和卷曲、反平行β折叠和β转角、平行β折叠含量比例的结果。
65.图9示出了所述三种细胞系提取的细胞外囊泡酰胺i带/酰胺ii带比值、螺旋和卷曲、反平行β折叠和β转角、平行β折叠的含量比例对评估肿瘤恶性程度灵敏度和特异性的受试者特征分析(roc)结果。
66.图10示出了无转移乳腺癌患者和淋巴结转移乳腺癌患者肿瘤组织来源细胞外囊泡酰胺i带/酰胺ii带比值。
67.图11示出了所述肿瘤组织来源细胞外囊泡螺旋和卷曲、反平行β折叠和β转角、平行β折叠的含量比例结果。
68.图12示出了所述肿瘤组织提取的细胞外囊泡酰胺i带/酰胺ii带比值、螺旋和卷曲、反平行β折叠和β转角、平行β折叠的含量比例对评估肿瘤转移性灵敏度和特异性的受试者特征分析结果。
具体实施方式
69.下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施仅仅是用于更详细具体地说明只用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
70.本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
71.除非特别指明，以下实施例中所用的细胞系mcf-10a,mcf-7,mda-mb-231均购自中国医学科学院。
72.除非特别指明，以下实施例中所用的乳腺癌患者肿瘤组织，来自中国科学技术大学附属第一医院。
73.除非特别指明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液。
74.除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。
75.以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
76.试剂：
77.pbs来源于thermo fisher。
78.滤膜，购自millex-gp。
79.碳膜支持铜网，购自中镜科仪。
80.pvdf膜，购自millipore,bedford,ma。
81.bca蛋白定量试剂盒，购自索莱宝公司。
82.所有抗体均购自abcam公司。
83.仪器：
84.超速离心机，购自贝克曼公司、型号optima xpn。
85.透射电镜，购自日立公司。、型号hitachi 7700。
86.纳米颗粒示踪仪，购自马尔文公司，型号nanosight lm14。
87.超高灵敏度化学发光成像系统，购自bio-rad。
88.纳米红外光谱，(可购于neaspec)。
89.实施例1
90.本实施例用于说明本发明方法对细胞系来源细胞外囊泡的提取。
91.(1)待细胞生长至密度50％时，换上由事先扣除细胞外囊泡的血清配制的培养基，将其放在细胞培养箱中48h。
92.(2)取12皿细胞的细胞培养上清液至50ml离心管中，4℃条件下，离心800g，10分钟。
93.(3)取步骤(2)离心后上清液，离心2000g，20分钟，4℃。
94.(4)取步骤(3)离心后上清液离心10000g，1小时，4℃。
95.(5)取步骤(4)离心后上清液，用100nm和200nm滤膜进行过滤，滤液收至新的离心管中。
96.(6)将过滤后的样品装入超速离心管，离心100000g，2小时，4℃。
97.(7)超速离心后弃去上清培养基，将底部沉淀重悬至pbs缓冲液中，离心100000-150000g，2小时，4℃。
98.(8)弃去上清的pbs缓冲液，将提取得到的细胞外囊泡重悬在100-500μl体积的pbs缓冲液中，pbs缓冲液提前用0.22μm的滤膜过滤。
99.实施例2
100.本实施例用于说明本发明方法对提取出的细胞外囊泡进行形貌及尺寸表征。
101.(1)取实施例1中分离出的细胞外囊泡悬液20μl，pbs稀释50倍至1ml。用纳米颗粒示踪仪进行检测，激光器为405nm。用注射器将稀释后的细胞外囊泡注入样品池中，用高敏感度的金属氧化物半导体(cmso)相机进行检测，收集时间为60s,检测限设置为7，每个样品做三次平行，每两个样品之间用pbs缓冲液仔细清洗样品池三遍。检测完毕后，用纳米颗粒示踪仪数据分析软件nta software,version 2.3对测试结果进行分析。图1是纳米颗粒示踪仪测得的实施例1中细胞外囊泡的尺寸分布及数量。
102.(2)取实施例1中分离出的细胞外囊泡悬液10μl滴在超薄碳膜支持铜网上，两次水洗后，用1％的醋酸双氧铀负染，80kv透射电镜拍摄，形貌表征如图2所示。
103.实施例3
104.本实施例用于说明本发明方法对提取出的细胞外囊泡进行蛋白表达测定。
105.(1)取实施例1中分离出的细胞外囊泡悬液100μl，加入100μl蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂)，充分混合，于冰上裂解1小时。裂解完全后，使按照bca蛋白定量试剂盒说明书对细胞外囊泡蛋白含量进行定量。
106.(2)取上样量为10μg的细胞外囊泡蛋白，加入聚丙烯酰胺凝胶中，110v条件下恒压跑电泳100分钟。将凝胶转至孔径0.45μm的pvdf膜上。5％的脱脂奶粉室温震荡封闭一小时。将封闭好的pvdf膜浸泡在一抗中，4℃孵育12小时。用0.1％tween 20-tris缓冲盐溶液，室温震荡洗涤3次，每次5分钟。将洗涤后的pvdf膜浸泡在含有辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中，室温震荡孵育1小时，然后用0.1％tween 20-tris溶液清洗，室温震荡洗涤3次，每次5分钟。最后，将膜浸于荧光显色剂中，在超高灵敏度化学发光成像系统中成像，结果如图3所示。
107.实施例4
108.本实施例用于说明本发明方法对所述细胞系提取出的细胞外囊泡进行纳米红外光谱表征和细胞外囊泡蛋白质二级结构特征分析。
109.(1)将细胞外囊泡分散滴在硅片基底上。
110.(2)用纳米红外光谱仪扫描样品，结果如图4所示。在单个细胞外囊泡上采集红外光谱，结果如图5所示。光谱采集范围覆盖酰胺i和酰胺ii的特征波段，计算酰胺i带/酰胺ii
带比值，结果如图6所示。
111.(3)利用二次导数光谱分析找出红外光谱中的特征峰位，结果如图7所示。利用特征峰位计算各种蛋白质二级结构在光谱中的面积占比，结果如图8所示。
112.(4)利用受试者特征分析得到样本不同蛋白质结构与无转移和淋巴结转移肿瘤样本的关联值，用于评估样本细胞外囊泡的恶性程度和转移性，结果如图9所示。
113.实施例5
114.本实例用于说明本发明方法对肿瘤组织来源细胞外囊泡的提取和形貌表征。
115.(1)取所述乳腺癌患者肿瘤组织150mg，加入2.5μl酶a、50μl酶r、100μl酶h和2.2ml无血清细胞冻存培养基，涡旋3次。
116.(2)取步骤(1)所得组织悬液，离心300g，10分钟，4℃。
117.(3)取步骤(2)离心后上清液，离心2000g，10分钟，4℃。
118.(4)取步骤(3)离心后上清液，离心10000g，20分钟，4℃。
119.(5)用0.22μm滤膜过滤步骤(4)所得上清，过滤后的液体离心150000g，7小时，4℃，将所得沉淀重悬在pbs缓冲液中。
120.(6)取步骤(5)分离出的细胞外囊泡悬液10μl滴在超薄碳膜支持铜网上，两次水洗后，用1％的醋酸双氧铀负染，80kv透射电镜拍摄，形貌表征如图10所示。
121.实施例6
122.本实施例用于说明本发明方法对所述肿瘤组织提取的细胞外囊泡进行纳米红外光谱表征和细胞外囊泡蛋白质二级结构分析。
123.(1)将细胞外囊泡分散滴在硅片基底上。
124.(2)用纳米红外光谱仪扫描样品，在单个细胞外囊泡上采集红外光谱。光谱采集范围覆盖酰胺i和酰胺ii的特征波段，计算酰胺i带/酰胺ii带比值，结果如图10所示。
125.(3)利用二次导数光谱分析找出红外光谱中的特征峰位，利用特征峰位计算各种蛋白质二级结构在光谱中的面积占比，结果如图11所示。
126.(4)利用受试者特征分析得到样本不同蛋白质结构与无转移和淋巴结转移肿瘤样本的关联值，用于评估样本细胞外囊泡的恶性程度和转移性，结果如图12所示。