一种脂质金磁纳米粒子及其制备方法和应用

1.本发明涉及纳米粒子制备和药物制剂领域，具体地说，涉及一种脂质包裹的金磁纳米粒子及其制备方法和应用。


背景技术：

2.纳米载体作为基因载体具有非常大的优势，作为一种非病毒载体近些年广泛应用于生物医学领域，尤其是在肿瘤治疗上，纳米载体可通过epr效用(高渗透和滞留效用)在肿瘤位置富集，而且纳米载体可以利用不同修饰增加药物的体内循环时间以及提高药物的生物利用度。纳米载体将基因药物输运进细胞是基因治疗的关键，目前的转染技术已经能够满足大多数细胞的转染需要，但仍存在一些难转染细胞尤其是一些难转染的肿瘤细胞增加了基因治疗的难度。
3.脂质纳米载体是细胞转染最常用载体，而纳米金以及磁性颗粒由于其优异的性能，被广泛应用于疾病的诊断和治疗中，如果将二者通过一种有效的方式结合起来，在疾病诊治方面将会有非常大的潜力，一方面脂质分子可以通过膜融合的方式与细胞结合，尤其是阳离子脂质它可以通过静电作用与质粒dna或rna结合并将其有效输运进细胞。另一方面金纳米粒子具有光热效应，在光照下对细胞有光穿孔的作用，有利于纳米粒子进入细胞。进一步地，磁性粒子在外界磁场下具有磁靶向性。因此，如果将脂质分子结合到金磁纳米粒子上，使其在获得良好的药物输运效果的同时，还使其获得负载质粒dna或小干扰rna等能力，而且结合了光热效应和磁靶向性，有望实现光热治疗与基因治疗的有效结合，对难治疗疾病尤其是肿瘤的治疗将具有非常好的效果。
4.文献(张珂.金磁纳米粒子的聚合物功能修饰及磁诱导体外转染研究[d].河南科技大学,2016)中公开了制备的金包磁的纳米粒子au@fe3o4，可用于提高磁性纳米粒子的稳定性和可修饰性，有外加磁场和不加磁场两种情况下均能够递送dna进行转染，外加磁场作用下的转染效率高于无外加磁场的效率，磁诱导效果显著；与嵌段共聚物相比，磁诱导效应还可以使peg-b-pampimb-au@fe3o4在较低的n/p比时就有较高的转染效率。
[0005]
而目前未见如本技术的脂质分子包裹的金磁纳米粒子，本技术发明人致力于开发一种脂质金磁纳米粒子的制备方法，通过该方法实现对难转染细胞的有效转染。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种脂质金磁纳米粒子及其制备方法和应用。
[0007]
第一方面，本发明提供了一种脂质金磁纳米粒子的制备方法。
[0008]
所述的脂质包裹的金磁纳米粒子的制备方法为：
[0009]
a)将金磁纳米粒子/金纳米粒子/磁性粒子溶解在溶剂中；
[0010]
b)将脂质分子溶于溶剂中，用旋转蒸发仪或自然挥发除去溶剂，制备得到脂质薄膜，薄膜水化后，经超声得到脂质混悬液；
[0011]
c)将步骤b)得到的脂质分子混悬液，与步骤a)得到的金磁纳米粒子溶液混合，超声，得到脂质包裹的金磁纳米粒子/金纳米粒子/磁性粒子。
[0012]
第二方面，本发明提供了一种载基因脂质金磁纳米粒子的制备方法。
[0013]
所述的制备方法在权利要求2的基础上还包括以下步骤：
[0014]
将权利要求1步骤c)中得到的脂质包裹的金磁纳米粒子/金纳米粒子/磁性粒子分别与基因水溶液混合，震荡得到载基因的脂质金磁纳米粒子。
[0015]
更优选地，所述步骤a)中的磁性颗粒为铁、钴、镍的一种或几种。
[0016]
更优选地，所述步骤a)中的金纳米粒子为金纳米颗粒、金纳米棒、氨基-聚乙二醇包裹纳米金、羧基聚乙二醇包裹纳米金、二马来酰亚胺聚乙二醇包裹纳米金、活性酯-聚乙二醇包裹纳米金、生物素聚乙二醇包裹纳米金、叶酸聚乙二醇包裹纳米金、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇包裹纳米金、叠氮-聚乙二醇包裹纳米金、异硫氰基荧光素-聚乙二醇包裹纳米金、罗丹明b-聚乙二醇包裹纳米金的一种或几种。
[0017]
更优选地，所述步骤b)中的脂质分子为磷脂酰胆碱类磷脂、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇化磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇化磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酸类磷脂、磷脂酰乙醇胺类磷脂、大豆磷脂、磷脂酰丝氨酸类磷脂、磷脂酰甘油类磷脂、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺和1,2-二油基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷中的一种或几种，以及叶酸、透明质酸、海藻酸、半乳糖、多巴胺修饰的脂质分子中的一种或几种。
[0018]
更优选地，所述步骤b)中的溶剂为纯水、生理盐水、磷酸盐缓冲盐溶液(pbs)、葡萄糖注射液中的一种或多种。
[0019]
更优选地，所述步骤d)中的基因为质粒、sirna、microrna、pirna、circlerna和lncrna中的一种或多种。
[0020]
第三方面，本发明提供了一种脂质金磁纳米粒子
[0021]
所述脂质金磁纳米粒子由如上任一项所述的制备方法制备而成。
[0022]
第四方面，本发明提供了脂质金磁纳米粒子的用途
[0023]
如上所述的脂质金磁纳米粒子在肿瘤治疗、免疫治疗、基因治疗、靶向载药、光热疗法中的应用。
[0024]
本发明优点在于：
[0025]
1、纳米金具有光热效应，不同于传统基因载体主要借助细胞内吞进入细胞，脂质金磁纳米粒子在光照下可以通过光穿孔进入细胞，进而提高细胞转染效率。而且脂质金磁纳米粒子可以实现磁靶向给药，并结合纳米金的光热效应，实现光热与基因的联合治疗。
[0026]
2、本制备方法简单便捷、重复性好、绿色无污染、粒径均一、产量高，负载基因后对一些难转染细胞有非常好的转染效率，在肿瘤治疗、免疫治疗、基因治疗、靶向载药、光热疗法领域具有广阔的应用前景。
附图说明
[0027]
附图1为本发明的一个较佳实施例的脂质金磁纳米粒子的透射电子显微镜照片；
[0028]
附图2为本发明的一个较佳实施例的脂质金磁纳米粒子制备流程示意图；
[0029]
附图3为本发明的一个较佳实施例的载sirna-mdr1的脂质金磁纳米粒子干预卵巢
癌a2780紫杉醇耐药细胞后荧光定量pcr检测耐药基因的表达结果图；
[0030]
附图4为本发明的一个较佳实施例的载sirna-mdr1的脂质金磁纳米粒子干预卵巢癌skov3紫杉醇耐药细胞后荧光定量pcr检测耐药基因的表达结果图；
[0031]
附图5为本发明的一个较佳实施例的载sirna-mdr1的脂质金磁纳米粒子干预人肺癌a549紫杉醇耐药细胞后荧光定量pcr检测耐药基因的表达结果图；
[0032]
附图6为本发明的一个较佳实施例的载egfr质粒的脂质金磁纳米粒子干预人白血病细胞k562细胞后荧光定量pcr检测耐药基因的表达结果图；
[0033]
附图7为本发明的一个较佳实施例的载egfr质粒的脂质金磁纳米粒子干预人乳腺癌mcf-7细胞后荧光定量pcr检测耐药基因的表达结果图；
[0034]
附图8为本发明的一个较佳实施例的载egfr质粒的脂质金磁纳米粒子干预人卵巢癌skov3细胞后荧光定量pcr检测耐药基因的表达结果图。
具体实施方式
[0035]
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，非限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。实施例中所用的细胞、材料、试剂等，除特殊说明的，其他均可从商业途径得到。
[0036]
下述实施例中涉及的基因来源和/或功能以及细胞来源说明如下：
[0037]
sirna-mdr1：购买于广州锐博生物技术有限公司，编码多耐药基因(mdr1)的小干扰rna，可通过检测阳性转染细胞mdr1的表达水平验证其转染及表达效率；egfr过表达质粒由复旦大学附属金山医院临床医学研究中心构建，用于检测脂质金磁纳米粒子转染质粒的效率。
[0038]
人卵巢癌skov3细胞购自atcc；人卵巢癌skov3紫杉醇耐药细胞由复旦大学附属金山医院临床医学研究中心构建；人肺癌a549紫杉醇耐药细胞购自江苏凯基生物技术股份有限公司；人白血病细胞k562细胞购自atcc；人卵巢癌a2780紫衫醇耐药细胞购自江苏凯基生物技术股份有限公司；人乳腺癌mcf-7购自atcc。
[0039]
以下实施例展示的脂质金磁纳米粒子的制备流程如图2所示，将脂质分子包裹在金磁纳米粒子/金纳米粒子/磁性纳米粒子的表面，进一步与基因混合制备得到载基因的脂质金磁纳米粒子。
[0040]
实施例1：脂质金磁纳米粒子的制备
[0041]
将二油基磷脂酰乙醇胺(dope,50mg)和(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(dotap,50mg)溶于4ml氯仿中，40℃旋转蒸发制成脂质体薄膜，随后加入4mg/ml质量相同的金磁颗粒水溶液，超声形成脂质包覆的金磁粒子，透射电镜观察形貌，呈规则球形结构(图1)。
[0042]
实施例2：脂质金磁纳米粒子的制备
[0043]
将二油基磷脂酰乙醇胺(dope,50mg)和(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(dotap,50mg)溶于4ml氯仿中，40℃旋转蒸发制成脂质体薄膜，随后加入4mg/ml质量相同的金纳米粒子水溶液，超声形成脂质包覆的金纳米粒子。
[0044]
实施例3：脂质金磁纳米粒子的制备
[0045]
将二油基磷脂酰乙醇胺(dope,50mg)和(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(dotap,50mg)溶于4ml氯仿中，40℃旋转蒸发制成脂质体薄膜，随后加入4mg/ml质量相同的磁性纳
米粒子水溶液，超声形成脂质包覆的磁性纳米粒子。
[0046]
实施例4：载基因脂质金磁纳米粒子的制备
[0047]
将实施例1中得到的脂质包覆的金磁粒子(5mg/ml)与sirna(sirna-mdr1，20μm)等体积混合，并在室温下震荡20秒，制备负载sirna的脂质金磁粒子。
[0048]
实施例5：载基因脂质金磁纳米粒子的制备
[0049]
将实施例2中得到的脂质包覆的金纳米粒子(5mg/ml)与sirna(sirna-mdr1，20μm)等体积混合，并在室温下震荡20秒，制备负载sirna的脂质金纳米粒子。
[0050]
实施例6：载基因脂质金磁纳米粒子的制备
[0051]
将实施例3中得到的脂质包覆的磁性纳米粒子(5mg/ml)与sirna(sirna-mdr1，20μm)等体积混合，并在室温下震荡20秒，制备负载sirna的脂质磁性纳米粒子。
[0052]
实施例7：脂质金磁纳米粒子的应用
[0053]
人卵巢癌a2780/ptx耐紫杉醇细胞铺到6孔板中，24小时后，加入实施例4制备的载mdr1-sirna的脂质金磁粒子(sirna浓度为100nm)，分别用商业化转染试剂xtreme、lipo3000、lipo2000作为对照，自然光照30分钟，继而培养48小时，用荧光定量pcr(q-pcr)检测耐药基因mdr1的表达水平。结果显示，脂质金磁粒子组的敲低效率高于90％，转染效果优于xtreme、lipo3000、lipo2000(图3)。
[0054]
实施例8：脂质金磁纳米粒子的应用
[0055]
人卵巢癌skov3耐紫杉醇细胞铺到6孔板中，24小时后，加入实施例5制备的载mdr1-sirna的脂质金磁粒子(sirna浓度为100nm)，分别用商业化转染试剂xtreme、lipo3000、lipo2000作为对照，自然光照30分钟，继而培养48小时，用荧光定量pcr(q-pcr)检测耐药基因mdr1的表达水平。结果显示，脂质金磁粒子组的敲低效率高于90％，转染效果优于xtreme、lipo3000、lipo2000(图4)。
[0056]
实施例9：脂质金磁纳米粒子的应用
[0057]
人肺癌a549紫杉醇耐药细胞铺到6孔板中，24小时后，加入实施例6制备的载mdr1-sirna的脂质金磁粒子(sirna浓度为100nm)，分别用商业化转染试剂xtreme、lipo3000、lipo2000作为对照，自然光照30分钟，继而培养48小时，用荧光定量pcr(q-pcr)检测耐药基因mdr1的表达水平。结果显示，脂质金磁粒子组的敲低效率高于90％，转染效果优于xtreme、lipo3000、lipo2000(图5)。
[0058]
实施例10：脂质金磁纳米粒子的应用
[0059]
人白血病细胞k562按40万个/孔铺到6孔板中，将实施例1得到的脂质金磁纳米粒子与表皮生长因子受体egfr过表达质粒混合，按质粒0.5μg/孔转染细胞，负载空质粒的脂质金磁纳米粒子作为阴性对照，自然光照30分钟，继而培养48小时，用荧光定量pcr(q-pcr)检测egfp的表达水平。结果显示，脂质金磁粒子负载egfr质粒成功过表达egfr(图6)。
[0060]
实施例11：脂质金磁纳米粒子的应用
[0061]
人乳腺癌mcf-7按40万个/孔铺到6孔板中，将实施例2得到的脂质金磁纳米粒子与表皮生长因子受体egfr过表达质粒混合，按质粒0.5μg/孔转染细胞，负载空质粒的脂质金磁纳米粒子作为阴性对照，自然光照30分钟，继而培养48小时，用荧光定量pcr(q-pcr)检测egfp的表达水平。结果显示，脂质金磁粒子负载egfr质粒成功过表达egfr(图7)。
[0062]
实施例12：脂质金磁纳米粒子的应用
[0063]
人卵巢癌skov3细胞按40万个/孔铺到6孔板中，将实施例3得到的脂质金磁纳米粒子与表皮生长因子受体egfr过表达质粒混合，按质粒0.5μg/孔转染细胞，负载空质粒的脂质金磁纳米粒子作为阴性对照，自然光照30分钟，继而培养48小时，用荧光定量pcr(q-pcr)检测egfp的表达水平。结果显示，脂质金磁粒子负载egfr质粒成功过表达egfr(图8)。
[0064]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。