调控皮肤微生态多样性的组合物的制作方法

1.本发明涉及天然药物化学领域和化妆品领域，具体涉及一种能够调控皮肤微生态多样性的银耳子实体、羟乙基脲、d泛醇结合水解丝胶蛋白的组合物。


背景技术：

2.人体微生物在人体生理及器官功能方面发挥着关键作用，控制着疾病的发生与发展，例如糖尿病、肥胖等疾病与肠道微生物的失衡相关，哮喘与咽部微生物的失衡相关等。皮肤作为解剖学和生理的重要边界器官，主动或被动的接触各种外界物质，也是身体与外界接触的主要屏障，栖居着多种微生物群，其数量以万亿计，皮肤微生物、宿主以及外环境三者相互作用构成了皮肤微生态平衡。人体面部肌肤的微生态菌群是丰富而多样的，这些微生物群落包括有规律地定居于特定部位或特定年龄的常驻菌，如表皮葡萄球菌、丙酸杆菌等最主要的优势菌，还有暂时寄居，被称为过路菌，如金黄色葡萄球菌、棒状杆菌、链球菌等。大部分微生物对机体无害甚至有益，它们根据皮肤表面不同的生态环境所定植，与皮肤表面组织细胞之间维持着微妙的平衡，形成“微生态屏障”。正常的微生物群对维持机体的生理机能发挥着积极作用，任何物理或化学因素所导致的微生态环境失调都会对机体的健康造成影响，比如：化妆品、药物、衣物等。这些外界物质的存在有很大的可能会破坏皮肤表面的微生态的平衡，造成各种各样的肌肤的问题，已有研究表明特应性皮炎、痤疮、头皮屑、敏感泛红等皮肤问题与皮肤微生物的失衡存在密切的相关性。
3.随着化妆品使用频率日趋升高，其复杂的成分中包含了许多化学物质，如为了保证化妆品在货架期和使用期间具有很好的防腐性能而添加的防腐剂、香精香料、抗氧剂、除臭剂等，大量的中外研究表明，防腐剂是皮肤致敏的主要元凶之一。欧洲学者一项长达11年的跟踪调查显示，防腐剂导致过敏的占比高达58％。除此之外，长期使用防腐剂可扰乱皮肤常驻菌丛，从而改变皮肤的微生态环境,如使ph、湿度、油脂含量等发生变化并影响汗腺和皮脂腺的分泌功能，使皮肤的自净和代谢功能受到阻碍。在化妆品配方的实际应用中，不同形式的化妆品中防腐剂的使用量差异非常大，因此仅考虑防腐剂种类对于菌群的作用并不能真实反映实际应用中所遇到的问题。举例说明，面贴膜型化妆品的每次面膜液使用量在25ml左右，是普通膏霜型化妆品单次用量(约0.75～1.25g)的20～50倍，等比加入的防腐剂单次用量也会同时增加20～50倍，对微生态菌群扰动程度两者将具有显著差异。而面贴膜类产品，最近从化妆品品类中异军突起，成为广大消费在热捧的。部分消费者的使用频率甚至达到每天两次。如果面贴膜类产品对微生态菌群扰动程度更大，对于消费者的微生态健康而言，将存在更大的隐患。
4.因此，本发明提供了一种在肌肤上对微生态平衡具有优异的调理作用的组合物，该组合物还可以作为功效添加剂用于面贴膜类产品，用于调控微生态多样性。


技术实现要素：

5.一方面，本发明提供了一种调控皮肤微生态多样性的组合物，包含羟乙基脲、银耳
子实体、泛醇和水解丝胶蛋白。
6.在优选的实施方式中，羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白的重量比为0.1-10：0.1-3：0.1-4：0.1-1。在更优选的实施方式中，羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白的重量比为6：1：0.1-4：0.1-1。
7.在优选的实施方式中，本发明的组合物制成面膜形式。
8.在优选的实施方式中，本发明的组合物是冻干形式。在更优选的实施方式中，冻干形式制成片剂、丸剂或絮状形式。
9.在优选的实施方式中，本发明的组合物不含防腐剂。
10.另一方面，本发明涉及包含羟乙基脲、银耳子实体、泛醇和水解丝胶蛋白的组合物在制备用于调控皮肤微生态多样性的皮肤外用剂中的应用。
11.在优选的实施方式中，皮肤外用剂选自：乳液、膏霜、爽肤水。在优选的实施方式中，皮肤外用剂包含0.001-50重量％的组合物。
12.附图简要说明
13.图1显示了一种实施方式的面膜模具凹槽的图片。
14.图2显示了测试例3的细胞毒性评价结果，其中左侧为实施例2的细胞存活状态图片，右侧为实施例19的细胞存活状态图片。采用电子显微镜，olympus bx53，放大倍数40x。
15.图3(a)显示了面膜使用前后组间多样性shannon指数的变化(otu水平)。shannon指数是用来评估样本中物种组成的丰富度和均匀度。指数越大表示该生态的物种越丰富，生物多样性越高。反之，shannon指数越低，皮肤微生态菌群的多样性越低。
16.图3(b)显示了面膜使用前后组间多样性chao1指数比较(otu水平)。chao1指数估算样品中所含otu数目的指数，数值越大代表样本中所含物种越多。
17.图4显示属水平上物种组成丰度，其中，属水平面部细菌组成以丙酸菌属和葡萄球菌属为主，五组丰度大于1％且有分类命名的优势菌属有18个，比例达皮肤细菌总量的85％。b面膜使用后假单胞菌属(pseudomonas)(0.47
±
0.52vs 2.18
±
1.90，p＝0.019)和黄单胞菌属(xanthomonas)(0.06
±
0.13vs 2.11
±
2.07，p＝0.006)显著性上升。e面膜使用后葡萄球菌属(27.31
±
18.74vs 17.01
±
11.18，p＝0.028)显著性下降，而b面膜无显著变化(21.08
±
16.4vs 19.44
±
15.41，p＝0.829)，说明e面膜中的防腐剂抑制表皮葡萄球菌的生长。
具体实施方式
18.本发明提供了一种面部肌肤微生物多样性调控的冻干组合物，该冻干组合物即可以负载在日常使用的面膜布上，作为日常面膜产品替代品使用。也可以通过冻干赋型为片剂、丸剂、絮状等形态产品使用。还可以作为功效添加剂添加到化妆品乳液、膏霜、爽肤水等产品中，用于调控皮肤微生态多样性。
19.长期使用该冻干组合物对面部肌肤微生物产生积极影响。选用高通量测序技术中miseq测序平台进行测定，该冻干组合物面膜的使用对皮肤微生物群落组成具有积极的、正面的影响，对人体皮肤健康优势非常的明显。
20.本发明提供了一款具有较佳性能的功效组合物。同时，采用现代化妆品技术进行前处理，组合形成安全性高、生物利用度高的组合物。
21.为了提供更简明的描述，本文给出的一些数量表述没有用术语“约”修饰。应当理解，无论是否明确地使用了术语“约”，本文所给出的每个量都意在指代实际的给定值，并且还意在指代由本领域的普通技术人员可合理推测出的这些给定值的近似值，包括这些给定值的由实验和/或测量条件所引起的近似值。
22.为了提供更简洁的描述，本文中一些数量表述被叙述为约x量至约y量的范围。应当理解，当叙述范围时，该范围并不限制于所叙述的上下界限，而应包括约x量至约y量的整个范围或它们之间的任何量。
23.羟乙基脲
24.羟乙基脲，是尿素的衍生物，分子式为c3h8n2o2，分子量104.1。羟乙基脲是无色至淡黄色透明液体，能较好地渗透进入皮肤角质层，增强皮肤水分含量，缓解干燥。在一些实施方式中，调控皮肤微生态多样性的组合物包含羟乙基脲。
25.在一些实施方式中，本技术组合物包含1-10重量％的羟乙基脲。在优选的实施方式中，本技术组合物包含1-5重量％的羟乙基脲。
26.银耳子实体
27.银耳子实体是由主链α-(1-3)甘露糖、侧链岩藻糖、木糖和葡萄糖醛酸形成的氨基酸及核酸的合成体，聚合度大约100万的酸性异聚多糖类。银耳子实体溶于水后形成无色透明的粘性液体。具有较好的肌肤保湿性能。在一些实施方式中，调控皮肤微生态多样性的组合物包含银耳子实体。
28.在一些实施方式中，本技术组合物包含0.1-5重量％的银耳子实体。在优选的实施方式中，本技术组合物包含0.1-1重量％的银耳子实体。
29.泛醇
30.泛醇，又称维生素原b5，是维生素b5的前体，分子式为c9h
19
no4，分子量205.25。在一些实施方式中，本技术使用d泛醇。d泛醇被肌肤吸收后通过氧化迅速转化为泛酸，在表皮细胞内转化为乙酰辅酶a，进而参与肌肤新陈代谢的过程，具有保湿和修护的功能。在一些实施方式中，调控皮肤微生态多样性的组合物包含泛醇。
31.在一些实施方式中，本技术组合物包含1-8重量％的泛醇。在优选的实施方式中，本技术组合物包含1-5重量％的泛醇。
32.水解丝胶蛋白
33.皮肤角质层中应保持10～20％的水分，才能使皮肤丰满而富有弹性。当皮肤角质层中的水分在10％以下时。皮肤即呈干燥甚至开裂。角质层中之所以能含有一定量的水分，一方面由于皮脂膜防止水分蒸发，另一方面角质层中含有天然保湿因子(natural moistarizing factor。nmf)，它对皮肤保湿起着极为重要的作用。天然保湿因子主要由氨基酸类、吡咯烷酮羧酸、乳酸盐、尿素、糖类、有机酸、多肽等物质组成。假如从角质层中将这些水溶性成分去除，皮肤的吸湿性将丧失。
34.水解丝胶蛋白来源于蚕丝，是保护蚕丝外部的膜层天然高分子蛋白质，约占蚕丝重量的20～30％，富含有丝氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸等极性氨基酸。水解丝胶蛋白与人体肌肤天然保湿因子(nmf)中的氨基酸结构相近，含氮量在15％左右，具有较好的保湿、抗氧化、营养肌肤的作用。
35.丝胶含有18种氨基酸，90％以上的氨基酸能被人体吸收，含有人体所必需的氨基
酸达17％以上，极性氨基酸占80.41％，非极性氨基酸占19.59％，具有良好的吸放湿性能，加入到化妆品中，能起到类似天然保湿因子的作用。此外，丝胶蛋白是一种球状蛋白质，其二级结构主要以无规卷曲为主，占41.6％，其次是β-折叠和β-转角，分别占总量的30.5％和23.6％，α-螺旋的含量较低，仅占4.3％，具有抗氧化功能，能抵御日光、微波、化学物质、大气污染物对肌肤的侵蚀，能很好地抑制活性氧的发生，防止皮肤起皱老化，比具有抗氧化功能的维生素c的效果还好；由于其具有天然的属性和生物亲和性，所以安全性极佳。但是在氨基酸与细胞的接触中，部分氨基酸的浓度、酸碱性、等电点等原因会对细胞具有一定的毒性。
36.在一些实施方式中，本技术组合物包含0.1-1重量％的水解丝胶蛋白。在优选的实施方式中，本技术组合物包含0.1-0.5重量％的水解丝胶蛋白。
37.调控皮肤微生态多样性的组合物
38.面部肌肤微生态保持良好的多样性分布，即微生态微生物群落的平衡是肌肤健康的基础。肌肤问题始于皮肤微生态微生物群落平衡和多样性被打破，即一种或几种微生物变为统治地位，如面部痤疮的发生，是由于面部痤疮丙酸杆菌不平衡的过度繁殖高度相关；特应性皮肤炎症的产生，表面上是肌肤粗糙、干燥、屏障破坏，实际上与金黄色葡萄球菌的过量繁殖相关。尿布疹的封闭环境下白色念珠菌的过度生长，使得肌肤表面其他健康的菌群的数量和多样性得到了抑制。另外如夜臭与类白喉杆菌有关，头屑与糠秕孢子菌息息相关等等。人体皮肤表面定居者大量的微生物(106个/cm2),并且这些微生物和皮肤表面不同的生态位，形成了复杂的生态系统
‑‑‑
皮肤微生态。皮肤表面的菌群分为常驻菌群和暂住菌群，其中大多数对我们机体都是有益的，如清理皮肤表面的垃圾(凋亡的细胞)，分解多余的脂质，通过竞争性抑制抵抗外来病原菌入侵等。当彼此平衡和多样性关系被打破的时候，作为人体肌肤第一道屏障的微生态系统，有可能受到条件致病菌的侵害，引起多种感染性疾病和皮肤问题，皮肤功能就会紊乱。
39.本发明意外地发现，包含羟乙基脲、银耳子实体、泛醇和水解丝胶蛋的组合物能够大大地丰富皮肤菌群的多样性和丰富程度，提升肌肤健康。本发明意外地发现，泛醇与丝胶蛋白组合具有非常明显的促进肌肤微生态菌落多样性的协同增效作用。单独使用泛醇或丝胶蛋白虽然未对肌肤微生态菌落多样性和丰富度造成不利影响，基本保持了微生态系统的现有平衡，但是，单独使用未能正向地丰富和多样化肌肤微生态菌落。只有将泛醇与丝胶蛋白组合使用后，才能实现调控皮肤微生态平衡的作用。这无疑是为肌肤的健康和肌肤问题的解决开辟了一条新的解决方案。
40.本发明还发现，防腐剂对于肌肤表面微生态的健康和平衡具有显著的破坏作用。从防腐剂的作用机制来看，一是破坏微生物细胞壁或抑制微生物细胞壁的形成；二是破坏微生物的细胞膜或影响细胞膜的功能，使微生物细胞内物质泄漏而致死；三是抑制微生物细胞内的酶或蛋白质合成或使蛋白质变性，致使微生物死亡。因此，从人体安全端来说，防腐剂在一定浓度范围内对人体皮肤本身不造成刺激、安全和毒理方面的问题，但是从对微生态菌群多样性和丰富度方面来说，还是有潜在的影响和可能的长期破坏作用。
41.在一些实施方式中，本发明组合物中羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白的重量比为0.1-10：0.1-3：0.1-4：0.1-1。在优选的实施方式中，本发明组合物中羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白的重量比为6：1：0.1-4：0.1-1。在优选的实施方式中，本发
明组合物中羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白的重量比为6：1：0.1-4：0.1-0.5。
42.在优选的实施方式中，本发明调控皮肤微生态多样性的组合物制成冻干产品。
43.调控皮肤微生态多样性的组合物的应用
44.在优选的实施方式中，本发明调控皮肤微生态多样性的组合物可以制成面膜形式。
45.在一些实施方式中，可以将调控皮肤微生态多样性的组合物负载到面膜布上，冷冻干燥后作为面膜使用。在一个具体的实施方式中，冷冻干燥条件如下：置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。通过冷冻真空干燥制备工艺在获得的面贴膜在肌肤上对微生态平衡的优秀的调理应用。
46.在一些实施方式中，本发明调控皮肤微生态多样性的组合物可以制成片剂、丸剂、絮状形式。
47.在另一些实施方式中，本发明调控皮肤微生态多样性的组合物可以作为功效添加剂应用于皮肤外用剂中。在一些实施方式中，所述皮肤外用剂选自：乳液、膏霜、爽肤水等。根据制剂的不同类型添加不同的用量。
48.所述皮肤外用剂是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念。所述皮肤外用剂可以是基础化妆品、面部妆容化妆品、身体用化妆品、头发护理用化妆品等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。所述皮肤外用剂中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。
49.皮肤外用剂优选为化妆品，例如化妆水、精华液、乳霜等。本发明的组合物除了可以单独作为皮肤外用剂使用，亦可以添加剂的方式使用在皮肤外用剂中，其重量百分比为0.001％～50％(w/w)。优选的重量百分比为1％～20％(w/w)。更优选的重量百分比为2％～10％(w/w)。最优选的重量百分比为3％～8％(w/w)。
50.实施例
51.下面结合具体实施例，以进一步阐述本发明。有必要在此指出的是，实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。
52.以下实施例中采用的实验材料如下：
53.d泛醇，由帝斯曼(中国)有限公司提供。
54.羟乙基脲，有阿克苏
·
诺贝尔(中国)有限公司提供。
55.银耳子实体，由上海辉文生物技术有限公司提供。
56.水解丝胶蛋白，由帝斯曼(中国)有限公司提供。
57.实施例1：组合物的制备
58.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：4：0.1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，
使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
59.实施例2：组合物的制备
60.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：4：0.5，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
61.实施例3：组合物的制备
62.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
63.实施例4:组合物的制备
64.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：4：1.5，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
65.实施例5:组合物的制备
66.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：4：2，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
67.实施例6:组合物的制备
68.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：4：5，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分
钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
69.实施例7:组合物的制备
70.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：0.1：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
71.实施例8:组合物的制备
72.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：1：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
73.实施例9:组合物的制备
74.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：2.5：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
75.实施例10:组合物的制备
76.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：5：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
77.实施例11:组合物的制备
78.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：6：1，混合后经
250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
79.实施例12:组合物的制备
80.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：8：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
81.实施例13:组合物的制备
82.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：0.1：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
83.实施例14:组合物的制备
84.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：0.5：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
85.实施例15:组合物的制备
86.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1.5：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
87.实施例16:组合物的制备
88.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：2：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
89.实施例17:组合物的制备
90.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：2.5：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
91.实施例18:组合物的制备
92.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：3：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
93.实施例19:组合物的制备
94.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝0.1：1：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
95.实施例20:组合物的制备
96.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝1：1：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
97.实施例21:组合物的制备
98.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝3：1：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
99.实施例22:组合物的制备
100.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
101.实施例23:组合物的制备
102.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝8：1：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
103.实施例24:组合物的制备
104.按重量比例称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝10：1：4：1，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽(见图1所示)，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
105.实施例25
106.称取羟乙基脲40克，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
107.实施例26
108.称取银耳子实体40克，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
109.实施例27
110.称取泛醇40克，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
111.实施例28
112.称取水解丝胶蛋白40克，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
113.实施例29
114.按重量称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：4：0，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
115.实施例30
116.按重量称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白＝6：1：0：0.5，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。采用脸型膜具凹槽，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
117.测试例1：复溶性测试
118.按团标t/caffci 29-2019所述方法来进行复溶性测试，称取试样50mg(
±
1mg)于
10ml具塞试管中，用移液管准确加入2ml蒸馏水，立刻盖住瓶塞，全手掌握住试管，拇指按住瓶塞，上下约30cm幅度振摇10s后静置观察。表1显示了复溶性测试结果。
119.表1
[0120][0121][0122]
冻干相关产品的复溶性是使用体验的重要评价指标，对于皮肤美容制剂的使用过程中，人们对于产品使用的需求也是有不同。易于溶解、快速短时间完全溶解，是冻干产品的复溶评价指标，而半溶解，难溶解等现象的存在是不能接受的。
[0123]
对于实施例1～6来看，水解丝胶蛋白的浓度含量逐渐升高，由于丝胶蛋白的分子量一般在14～314kd之间，需要经过水解，才能最大程度地发挥其功效。经过水解工艺的处理后，采用的水解丝胶蛋白的相对分子量在5～14kd之间，富含各种氨基酸的组合(多肽类，
小分子蛋白等)，浓度越高存在更多的高分子粘连和缠绕，在冻干过程中，对于水的结合能力增强，不易形成蜂窝状的冻干结构。
[0124]
对于实施例7～12来看，从泛醇本身的结构来看，是一种具有旋光性的立体异构体，又被称为右旋-n-(α-γ-二羟基-β，β-二甲基丁酰)-β-氨基丙醇，具有较高的粘度，虽然溶于水，但是由于本身的高粘度，且与银耳子实体的溶液相配合导致了在较高用量下的溶解度下降，冻干复溶性差也就可以理解了。银耳子实体溶解于水后的高粘稠的特点，使得与之相混合的羟乙基脲物质溶解度降低，复溶性和溶解性都收到较大影响。
[0125]
实施例31～60
[0126]
个性化护肤的热潮方兴未艾，对于可能的定制化场景，可能通过现场配制，一次性使用等方式，来达到快速美容护肤的目的。基于此，对于实施例1～30中按照重量比例配制的组合物亦可以通过现场配制的方式成为皮肤制剂，从而直接用于护肤，即不再需要长期的保存和稳定需求，也就是说，不再需要使用冻干的形式进行产品的使用和保存。这样使用场景下的产品更加关注产品的安全性、功效性等。
[0127]
分别按照实施例1～30的重量比例，称取羟乙基脲：银耳子实体：泛醇：水解丝胶蛋白四种物质，混合后经250rpm搅拌5分钟得40克组合物，加入80℃热水460克，提高搅拌速度至400rpm，持续10分钟，得500g均匀组合物。
[0128]
测试例2：应用鸡胚绒毛尿囊膜试验评价产品的安全刺激性
[0129]
白莱杭鸡受精种蛋，购自上海归兴家禽有限公司，普通级，置rcom maru max鸡胚孵化箱中孵化，气室端朝上，温度37.6
±
0.1℃、相对湿度46
±
1％，每小时水平方向倾斜45度自动翻蛋一次，自动换气，至第10天时应用。取10日龄鸡胚，除去气室顶端蛋壳，加1ml 37℃预温的生理盐水于蛋壳膜上使其润湿后吸去，再用弯头小镊小心剥去蛋壳膜，暴露出尿囊膜(cam)。将鸡胚置于leica体视显微镜下，放大16倍，观察面积为11.0
×
8.25mm2，调节焦距至能清晰的见到尿囊膜血管中的血液流动情况。
[0130]
采用终点评价法：取实施例备用样品，用20ml去离子水复溶后，取用0.3ml加于cam上。对于实施例31～60，直接取用0.3ml样品加于cam上。开始计时，3min后用37℃预温的生理盐水将样品轻轻的冲洗干净，30s后观察cam血管出血、血管融解和凝血的程度，各按轻、中、重度分别评为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0分，每个样品均用6个鸡胚进行实验，最后计算6个鸡胚的刺激积分总和。受试样品刺激性分级：总分＜1分，无刺激性；总分＜5分，轻度刺激性；总分＜10分，中度刺激性；总分＞10分，重度刺激性。表2显示了鸡胚绒毛尿囊膜试验评价产品安全刺激实验结果。
[0131]
表2
[0132]
[0133][0134]
鸡胚绒毛尿囊膜法是一种简便、经济、实验周期短、不需要特殊设备的检验皮肤制剂是否具有刺激性的评价技术之一。通过观察尿囊膜暴露于皮肤制剂后血管的刺激反映(观察尿囊膜血管及学管网的形态、颜色和通透性的变化，以及蛋白质变性现象和受损程
度)，计算刺激分值对制剂进行评价，灵敏度非常高。作为组合物的安全刺激性的筛选方法，可以很好地帮助筛选出性价比高、安全性佳、刺激性地的组合物。从四类分级的结果来看，即无刺激、轻度刺激、中度刺激和重度刺激，部分的组合物呈现了非常好的安全性结果，尤其是实施例1，2，13，19，20，29和30。比较相同比例的组合物与冻干复溶之后的刺激性结果来看，具有高度的近似，如实施例1与31，实施例2与32，实施例13与43，实施例19，20与实施例49，50等，都呈现了类似了无刺激的安全性结果。说明这些组合物在新鲜配制和冻干保存过程中，呈现出高度的均一性。故在接下来的细胞毒理研究的过程中，进一步验证。
[0135]
测试例3：利用cell counting kit-8(cck-8)评价产品的细胞毒性
[0136]
cck-8法是用于测定细胞毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。该试剂中含有wst-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐)，它在电子载体(1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯)的作用下，能使细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臜产物，生成的甲臜物数量与活细胞的数量成正比。cck-8法通过比色测定即可推算出活细胞数量，以酶联免疫检测仪测定其光密度，与对照组比较可得到试验组的比率，从而测定受试样品的细胞毒性。
[0137]
采用人体皮肤角质形成细胞(epikutis，批号es211204)培养，在96孔板中每孔加入细胞100μl(按8x 103个/孔的接种密度接种)，细胞置于37℃的5％co2细胞培养箱(thermo,150i)中培养，设置3个重复孔。待96孔板中细胞铺板率达到40～60％时进行给药，即每孔加入10μl采用实施例配制浓度样品的培养液(质量比例为20％)；对照组每孔加入10μl培养液；给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％co2)培养孵育共24h。每孔加入10μl的cck-8溶液，37℃、5％co2培养孵育1～4h。采用酶标仪(biotek,epoch)测定450nm处的吸光度(od值)。
[0138]
细胞存活率结果计算将各测试孔的od值除以本底od值(未给药空白组)，各重复孔的od值取平均数
±
sd。
[0139]
细胞存活率％＝(加药细胞od/对照细胞od)
×
100％。
[0140]
经实验数据测试，所有样品的细胞毒性比较均以20％的浓度开展。
[0141]
表3显示了采用cck-8方法评价产品细胞毒性的结果。
[0142]
表3
[0143][0144]
注：“*”代表经t检验，该样品在对应浓度下，对线粒体活性的影响效果与阴性对照相比具有差异，*p＜0.05.
[0145]
皮肤角质层中应保持10～20％的水分，才能使皮肤丰满而富有弹性。当皮肤角质层中的水分在10％以下时。皮肤即呈干燥甚至开裂。角质层中之所以能含有一定量的水分，一方面由于皮脂膜防止水分蒸发，另一方面角质层中含有天然保湿因子(natural moistarizing factor。nmf)，它对皮肤保湿起着极为重要的作用。天然保湿因子主要由氨基酸类、吡咯烷酮羧酸、乳酸盐、尿素、糖类、有机酸、多肽等物质组成。假如从角质层中将这些水溶性成分去除，皮肤的吸湿性将丧失。丝胶含有18种氨基酸，90％以上的氨基酸能被人体吸收，含有人体所必需的氨基酸达17％以上，极性氨基酸占80.41％，非极性氨基酸占19.59％，具有良好的吸放湿性能，加入到化妆品中，能起到类似天然保湿因子的作用。此外，丝胶蛋白是一种球状蛋白质，其二级结构主要以无规卷曲为主，占41.6％，其次是β-折叠和β-转角，分别占总量的30.5％和23.6％，α-螺旋的含量较低，仅占4.3％，具有抗氧化功能，能抵御日光、微波、化学物质、大气污染物对肌肤的侵蚀，能很好地抑制活性氧的发生，防止皮肤起皱老化，比具有抗氧化功能的维生素c的效果还好；由于其具有天然的属性和生物亲和性，所以安全性极佳。但是在氨基酸与细胞的接触中，部分氨基酸的浓度、酸碱性、等电点等原因会对细胞具有一定的毒性。从细胞毒性的结果来看，通过鸡胚绒毛尿囊膜优选的组合物基本呈现了较低的细胞毒性，但是对于具体的组合物来看，实施例1，2，29，30均呈现了极低的细胞毒性，而实施例13，19，20则呈现了轻微的细胞毒性。对比新鲜配制的相同
比例的组合物来看，呈现了极其接近的细胞毒性的结果，进一步说明了，冻干组合物在保存期内呈现了非常好的稳定性和活性物的活性保持性。故在接下来的微生态测试中，仅使用了冻干赋形后的面膜产品作为测试对象，作为进一步的对比例，模拟常规的面膜中较常采用的防腐体系作为湿面膜组合。
[0146]
实施例61：组合物制备(对比例)
[0147]
按实施例2制备方法，得500g均匀组合物，添加1g苯氧乙醇(按0.2％质量分数)和1g馨鲜酮(按0.2％质量分数)，搅拌混合均匀。采用脸型膜具凹槽，每个膜具中倒入20克组合物溶液，使面膜液均匀、平整分布于模具内。置于-80℃冰箱冷冻2小时，再放入冻干机中(真空冷冻干燥机，型号fd-2型，北京博医康实验仪器有限公司)冷冻干燥，升华干燥设置-80～-40℃，真空度1～30pa，时间3～21小时，解析干燥设置-10～ 20℃，真空度1～30pa，时间1～10小时，含水量控制在0～6％之间，得疏松、绵状轻薄面膜。备用。
[0148]
测试例4：面部肌肤微生态测试
[0149]
1)志愿者入选标准及分组
[0150]
志愿者均来自在校女大学生，年龄在20～25岁。受试者面部皮肤需健康，无任何疾病。在7天之内，受试者皮肤表面不能涂抹任何抗生素或激素类产品，且一个月内未口服过任何抗生素或抗菌类药品。受试者均阅读并签署知情同意书。共筛选出100人，a～e组(共5组)，分别随机纳入20人。a组使用实施例1样品；b组使用实施例2样品；c组使用实施例29样品；d组使用实施例30样品；e组使用实施例61样品。
[0151]
2)样本采集
[0152]
前期准备：志愿者测试前5天，不允许使用任何化妆品及彩妆。
[0153]
试验过程：受试者均被要求取样前8小时不能进行面部清洁和涂抹任何化妆品；测试时间为三周，志愿者需每天使用一次被分派的实施例面膜(面膜使用方法为将实施例面膜覆盖于面部位置，采用喷洒20ml纯净水的方式使面膜均匀涂布于肌肤)，且不允许使用其他任何化妆品及彩妆。分别对志愿者使用面膜前后进行面部皮肤微生物进行取样。取样方法为两支无菌棉拭子蘸取润湿液(0.9％nacl-0.1％吐温20)，分别在受试者面颊皮肤左右对称部位区域擦拭10次，期间注意转动棉拭子持续时间约5s，然后将棉拭子放入收集管内。采集过后，样品放于干冰中保存，随后转入-80℃保存，并尽快提取dna。
[0154]
3)dna抽提和pcr扩增
[0155]
本发明采用qigen的dneasy blood&tissue kit提取皮肤表面细菌总dna。dna浓度和纯度利用nanodrop2000进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna提取质量。用27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)和338r(5
’‑
tgctgcctcccgtaggagt-3’)引物对v1-v2可变区进行pcr扩增，(真菌的pcr扩增目的区域基因组为间隔转录间隔区1区(internal transcribed spacer 1，its1)，引物为its1f(5
’‑
cttggtcatttagaggaagtaa-3’)和its2r(5
’‑
gctgcgttcttcatcgatgc-3’))，扩增程序为：95℃预变性3min，27个循环(95℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸45s)，最后72℃延伸10min(pcr仪：abi9700型)。扩增体系为20ul，4ul 5*fastpfu缓冲液，2ul 2.5mm dntps，0.8ul引物(5um)，0.4ulfastpfu聚合酶；10ng dna模板。
[0156]
4)illumina miseq测序
[0157]
使用2％琼脂糖凝胶回收pcr产物，利用axyprep dna gel extraction kit
(axygen biosciences,union city,ca,usa)进行纯化，tris-hcl洗脱，2％琼脂糖电泳检测。利用quantifluor
tm-st(promega,usa)进行检测定量。根据illumina miseq平台(illumina,san diego,usa)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建pe 2*300的文库。构建文库步骤:(1)连接“y”字形接头；(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3)利用pcr扩增进行文库模板的富集；(4)氢氧化钠变性,产生单链dna片段。利用illumina公司的miseq pe300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。
[0158]
5)数据处理
[0159]
原始测序序列使用trimmomatic软件质控，使用flash软件进行拼接：(1)设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，去除质控后长度低于50bp的序列；(2)barcode需精确匹配，引物允许2个碱基的错配，去除模糊碱基；(3)根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接，overlap需大于10bp。去除无法拼接的序列。
[0160]
使用的uparse软件(version 7.1http://drive5.com/uparse/)，根据97％的相似度对序列进行otu聚类；使用uchime软件剔除嵌合体。利用rdp classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释，比对silva数据库(ssu123)，设置比对阈值为70％。
[0161]
6)统计学分析
[0162]
两组间检验采用配对的t检验，p《0.05表示差异具有统计学意义。在97％的相似水平下，对样本进行聚类和注释，42个样本共得到3329个otus(operational taxonomic units)，归属于30个菌门，962个菌属，1975个菌种。对面膜使用前后两组样本进行了alpha多样性分析。本研究中所有样本的coverage指数均大于0.99,说明本次测序涵盖了样本所有物种。利用spss软件，分别对5组面膜使用前后的shannon(图3(a))和chao1(图3(b))指数进行组间差异性分析。图3(a)显示了面膜使用前后组间多样性shannon指数的变化(otu水平)。shannon指数是用来评估样本中物种组成的丰富度和均匀度。指数越大表示该生态的物种越丰富，生物多样性越高。反之，shannon指数越低，皮肤微生态菌群的多样性越低。图3(b)显示了面膜使用前后组间多样性chao1指数比较(otu水平)。chao1指数估算样品中所含otu数目的指数，数值越大代表样本中所含物种越多。结果表明，b组面膜和e组面膜使用后面部皮肤细菌多样性和丰富度都有显著性变化。
[0163]
多样性分析是生物学微生物多样性的一个重要组成部分，也是比较基础的一个部分。alpha多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性，是反映丰富度和均匀度的综合指标。alpha多样性主要与两个因素有关，一是种类数目，即丰富度；二是多样性，群落中个体分配上的均匀性。群落多样性指标主要由shannon指数体现，群落丰富度指数主要包括chao1指数。从图3(a)可以看出，面膜使用前后组间多样性shannon指数b面膜和e面膜发生了显著的变化，其中b面膜的shannon指数显著升高，说明该面膜在3周的连续使用后，面部的微生态多样性发生了显著的提升。面部肌肤微生态保持良好的多样性分布，即微生态微生物群落的平衡是肌肤健康的基础。肌肤问题始于皮肤微生态微生物群落平衡和多样性被打破，即一种或几种微生物变为统治地位，如面部痤疮的发生，是由于面部痤疮丙酸杆菌不平衡的过度繁殖高度相关；特应性皮肤炎症的产生，表面上是肌肤粗糙、干燥、屏障破坏，实际上与金黄色葡萄球菌的过量繁殖相关。尿布疹的封闭环境下白色念珠菌的过度生长，使得肌肤表面其他健康的菌群的数量和多样性得到了抑制。另外如夜臭与类白喉杆菌有关，
头屑与糠秕孢子菌息息相关等等。人体皮肤表面定居者大量的微生物(106个/cm2)，并且这些微生物和皮肤表面不同的生态位，形成了复杂的生态系统
‑‑‑
皮肤微生态。皮肤表面的菌群分为常驻菌群和暂住菌群，其中大多数对我们机体都是有益的，如清理皮肤表面的垃圾(凋亡的细胞)，分解多余的脂质，通过竞争性抑制抵抗外来病原菌入侵等。当彼此平衡和多样性关系被打破的时候，作为人体肌肤第一道屏障的微生态系统，有可能受到条件致病菌的侵害，引起多种感染性疾病和皮肤问题，皮肤功能就会紊乱。从chao1指数可以得到b面膜在使用后肌肤微生态菌群的丰富度显著提升，从约500otus提升至600左右，这大大地丰富了菌群的多样性和丰富程度，提升了肌肤的健康。本发明所使用的组分中，对照c面膜和d面膜配方组成后，发现泛醇与丝胶蛋白组合具有非常明显的促进肌肤微生态菌落多样性的协同增效作用，表明单一成分的使用虽然未对肌肤微生态菌落多样性和丰富度造成不利影响，基本保持了微生态系统的现有平衡，但是未能够正向地丰富和多样化肌肤微生态菌落。从b面膜的组成和使用效果来看，无疑是为肌肤的健康和肌肤问题的解决开辟了一条新的解决方案。对于丝胶蛋白中特定的氨基酸组合和种类，协同搭配泛醇是一种右旋泛醇，可以在微生物和酶的氧化作用下转化为维生素b5，参与细胞和微生物的代谢反应过程，如氨基酸的代谢、细胞膜中脂质结构的生成等，微生物能量的获得过程等。是一种非常重要的微生物肌体健康促进剂和协调剂，其与丝胶蛋白的精确配比组合，是一种非常优秀的肌肤微生态健康促进剂。
[0164]
反观e面膜使用前后组间多样性chao1指数比较和shannon指数的结果，呈现了显著的多样性和丰富度的降低。配比设计中主要涉及了防腐剂的添加，而防腐剂对于肌肤表面微生态的健康和平衡具有显著的破坏作用。从防腐剂的作用机制来看，一是破坏微生物细胞壁或抑制微生物细胞壁的形成；二是破坏微生物的细胞膜或影响细胞膜的功能，使微生物细胞内物质泄漏而致死；三是抑制微生物细胞内的酶或蛋白质合成或使蛋白质变性，致使微生物死亡。所以从人体安全端来说，防腐剂在一定浓度范围内对人体皮肤本身不造成刺激、安全和毒理方面的问题，但是从对微生态菌群多样性和丰富度方面来说，还是有“润物细无声”的影响和长期的潜在破坏作用。从属水平面部细菌组成以丙酸菌属和葡萄球菌属为主，五组丰度大于1％且有分类命名的优势菌属有18个，结果见图4，比例达皮肤细菌总量的85％。如图4所示，b面膜使用后假单胞菌属(pseudomonas)(0.47
±
0.52vs 2.18
±
1.90，p＝0.019)和黄单胞菌属(xanthomonas)(0.06
±
0.13vs 2.11
±
2.07，p＝0.006)显著性上升。e面膜使用后葡萄球菌属(27.31
±
18.74vs 17.01
±
11.18，p＝0.028)显著性下降，而b面膜无显著变化(21.08
±
16.4vs 19.44
±
15.41，p＝0.829)，说明e面膜中的防腐剂抑制表皮葡萄球菌的生长。
[0165]
研究表明，表皮葡萄球菌是一类重要的肌肤益生菌，可以在肌肤表面分泌抗菌肽，抵御外界致病菌等在肌肤表面的定植。并调整肌肤ph值，健康肌肤肌肤。而一些致病菌，如绿脓杆菌等，容易在一些衰弱、脆弱、肌肤微生态菌落多样性降低的人群中定植，从而引起一系列的肌肤炎症、化脓性疾病等。
[0166]
皮肤外用剂优选为化妆品，例如化妆水、精华液、乳霜等。上述实施例获得的产物除了可以单独作为皮肤外用剂使用，亦可以添加剂的方式使用在皮肤外用剂中，其重量百分比为0.001％～50％(w/w)。优选的重量百分比为1％～20％(w/w)。更优选的重量百分比为2％～10％(w/w)。最优选的重量百分比为3％～8％(w/w)。
[0167]
以下是含上述实施例在皮肤外用剂中的具体应用的实施例，及其这些剂型的配方和制备方法。以下各表中
“‑”
表示无添加。
[0168]
应用例1：面霜的制备
[0169]
所用原料及含量见表4
[0170]
表4
[0171][0172][0173]
应用例2：乳液的制备
[0174]
所用原料及含量见表5。
[0175]
表5
[0176][0177]
应用例3：啫喱的制备
[0178]
所用原料及含量见表6。
[0179]
表6
[0180][0181]
应用例4：化妆水的制备
[0182]
所用原料及含量见表7
[0183]
表7
[0184][0185]
[0186]
应用例5：精华液的制备
[0187]
所用原料及含量见表8。
[0188]
表8
[0189][0190]
应用例6：面膜的制备
[0191]
所用原料及含量见表9
[0192]
表9
[0193]
[0194][0195]
应用例7：眼霜的制备
[0196]
所用原料及含量见表10。
[0197]
表10
[0198]
[0199][0200]
应用例8：沐浴露的制备
[0201]
所用原料及含量见表11。
[0202]
表11
[0203][0204]
应用例9：洗面奶的制备
[0205]
所用原料及含量见表12。
[0206]
表12
[0207][0208]
本发明中的实施例1～30也可以作为低温冷冻干燥产品单独使用。
[0209]
利用本发明的实施例产物制得的上述化妆品取得与市售的产品相当或更好的使用效果。
[0210]
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。