一种m6A测序的建库方法与流程

技术特征：
1.一种m6a测序的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，获得目标生物片段化后的rna样本；s2，取一部分片段化后的rna，与带有m6a抗体的磁珠共孵育，洗脱后得到带有m6a修饰的rna片段，与另取部分片段化后的rna继续下述步骤分别建立ip文库和input文库；s3，将rna片段把转录成cdna，并进行第一pcr扩增，添加测序接头；s4，将第一pcr扩增的产物进行磁珠纯化，并用zapr和r-probes去除核糖体cdna，s4，将去除核糖体cdna的cdna进行第二pcr扩增，并将第二pcr扩增的产物进行磁珠纯化，得到ip文库和input文库。2.根据权利要求1所述的m6a测序的建库方法，其特征在于，步骤s1中，获得目标生物的rna样本后，若rin＝2-3，则不进行片段化，若rin＝4-6，则将rna样本置于94℃3min进行片段化，若rin≥7，则将rna样本置于94℃5min进行片段化。3.根据权利要求1所述的m6a测序的建库方法，其特征在于，所述带有m6a抗体的磁珠的获取步骤如下：(1)取磁珠放置在磁力架上，待溶液澄清后，吸弃上清。(2)加入800μl c1 buffer，吹打混匀，放置在磁力架上，待溶液澄清后，吸弃上清，重复此步骤3次；(3)取50μl无核酸水加入抗体，摇匀，静置2min；(4)在磁珠管中加入450μl的c1 buffer与抗体，吹打混匀；再加入等体积的c2 buffer，吹打混匀；(5)用封口膜包裹ep管，置于恒温震荡金属浴，37℃，1400rpm孵育16-24h；(6)将ep管放置在磁力架上至少1min，待溶液澄清后，弃上清；(7)加入800μl hb，吹打混匀，将ep管放置在磁力架上至少1min，待溶液澄清后，弃上清；(8)加入800μl lb，吹打混匀，弃上清；(9)加入800μl sb，吹打混匀，弃上清；(10)重复步骤(9)1～3次；(11)加入800μl sb，吹打混匀，置于垂直混匀仪上混匀15min。4.根据权利要求1所述的m6a测序的建库方法，其特征在于，步骤s2中，所述共孵育的步骤具体为：(1)向片段化后的rna中加入带有m6a抗体的磁珠；(2)片段化后的rna与带有m6a抗体的磁珠混合液在室温下于垂直混匀仪上7圈/min，结合1～2小时；(3)置于磁力架上5min以上，待溶液澄清，弃上清。5.根据权利要求4所述的m6a测序的建库方法，其特征在于，共孵育后，进一步包括对带有m6a抗体的磁珠进行清洗的步骤：(1)带有m6a抗体的磁珠加入300μl的m6a binding buffer，轻轻吹打混匀，室温下孵育5min，将样本置于磁力架，待溶液澄清后，弃上清；(2)加入300μl low salt buffer，静置30s，弃上清；(3)加入300μl high salt buffer，静置30s，弃上清；
(4)加入300μl tet buffer，静置30s，弃上清，其中，各缓冲液的配方如下：m6a binding buffer：25mm ph7.4 tris-hcl，200mm nacl，1％np-40，4mm edta；low salt buffer：0.2
×
sspe，0.1m edta，0.1％tween-20；high salt buffer：0.2
×
sspe，0.1m edta，0.1％tween-20，300mm nacl；tet buffer：30mm ph8.0 tris-hcl，5mm edta(ph8.0)，0.05％tween-20。6.根据权利要求1所述的m6a测序的建库方法，其特征在于，所述洗脱的步骤如下：(1)加入预热的elution buffer，缓慢吹打混匀，在42℃下孵育5min，将ep管置于磁力架上3min；(2)取新的1.5ml ep管，加入400μl结合液和600μl的无水乙醇；(3)吸取磁力架上的上清至上述新的1.5ml ep管；(4)再重复步骤(1)-(3)一次，其中，elution buffer配方为：0.2m dtt，0.150m nacl，0.3m ph7.5 tris-hcl，0.1m edta，0.10％sds。

技术总结
本发明公开了一种m6A测序的建库方法，属于测序技术领域。所述方法包括：获得目标生物片段化后的RNA样本；取一部分片段化后的RNA，与带有m6A抗体的磁珠共孵育，洗脱后得到带有m6A修饰的RNA片段，与另取部分片段化后的RNA继续下述步骤分别建立IP文库和Input文库；将RNA片段把转录成cDNA，并进行第一PCR扩增，添加测序接头；将第一PCR扩增的产物进行磁珠纯化，并用ZapR和R-Probes去除核糖体cDNA，将去除核糖体cDNA的cDNA进行第二PCR扩增，并将第二PCR扩增的产物进行磁珠纯化，得到IP文库和Input文库。利用本发明的方法可以检测样本起始量低至3μg，实验过程简捷，文库纯度高，质量好，浓度足够高，满足上机测序和后续的相关的研究。研究。研究。


技术研发人员：李闪 郎秋蕾 刘鹤 邓阳红
受保护的技术使用者：杭州联川生物技术股份有限公司
技术研发日：2022.11.09
技术公布日：2022/12/30