一种用于预测脑胶质瘤的肿瘤标志物的制作方法

1.本发明涉及生物研究领域，特别涉及肿瘤标志物的预后。


背景技术：

2.脑胶质瘤是因为大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的原发性颅脑恶性肿瘤，发病率约占颅内肿瘤的40％～60％，具有发病率高、复发率高、死亡率高以及治愈率低的特点。根据肿瘤的预期生物学行为将其分级(i，ii，iii和iv)，其中除了ⅰ级能被手术治愈外，其余的脑胶质瘤很难通过现有的医疗手段治愈，并且大多数患者都会复发。脑胶质瘤经治疗后生存期不理想的一大原因是由于现在对于脑胶质瘤的检测指标普遍还停留在患者年龄和肿瘤组织学上。因此，临床上迫切需要一种可靠的用于诊断脑胶质瘤及检测其预后的生物标志物。
3.长链非编码rna(lncrna)是一类转录本长度大于200个核苷酸同时不编码蛋白质的rna。有研究发现lncrna与肿瘤存在密切的关系，一些lncrna在正常组织与肿瘤组织中的表达存在显著的差异性，异常的lncrna可能在肿瘤的发生中起重要作用，因此lncrna可能成为肿瘤诊断和判断预后以及治疗效果的一个新的标志物。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种用于预测脑胶质瘤的肿瘤标志物，该标志物为has2-as1，其上游的引物序列为：5'-gacaggaccttgaagactggg-3'，其下游引物序列为：5'-gggatggaggtcagcaacaa-3'。
5.本发明通过数据库中的数据进行差异分析，找出差异表达的lncrna,其中has2-as1呈现显著的高表达，通过生存分析发现has2-as1的高表达，生存风险极高，具有显著的意义。
6.收集脑胶质瘤患者的肿瘤组织和相邻正常组织样本，通过qrt-pcr检测所有组织中的has2-as1的表达水平，并分析肿瘤组织与正常组织has2-as1的表达量差异。结果表明肿瘤组织中的has2-as1表达水平明显高于正常组织，由此可以将两种不同的组织进行区分。
7.根据检测的表达水平，分为高表达组和低表达组，采用卡方检验分析has2-as1的表达水平与肿瘤患者的临床病理特征的关系，其中年龄、性别、病理分型、组织类型等特征与肿瘤组织的表达水平无明显的关系
8.通过生存分析表明，高表达的has2-as1说明脑胶质瘤患者的预后能力差，因此具有较好的预测价值。
附图说明
9.图1：has2-as1在脑胶质瘤和正常组织中的表达水平
10.图2：has2-as1在正常组织和脑胶质瘤组织中的临床表达水平
11.图3：患者临床病理特征表
12.图4:has2-as1高表达与低表达组患者总生存率比较图5：has2-as1高表达与低表达组患者无进展生存率比较
13.图6：has2-as1在脑胶质瘤患者总生存率中的预测价值图7：has2-as1在脑胶质瘤患者无进展生存期中的预测价值
具体实施方式
14.下面结合附图，通过实例说明具体的步骤。其中所使用的术语，除非有特殊说明，一般是在通常情况下所理解的含义。
15.生信分析，找出差异基因1.下载tcga数据库脑胶质瘤的mirna表达量数据和临床数据，共获得670名患者的脑胶质瘤组织及其正常组织的。利用edger进行差异分析(|logfc|》2，padj《0.05)，找出差异的lncrna。
16.收集临床样本2.收集入院治疗的80例脑胶质瘤患者在手术期间的肿瘤组织和相邻正常组织样本，距离癌病变边缘约2cm，所有标本切除后均收集于液氮中快速冷冻。标本均获得医院伦理委员会的批准和同意，经详细说明研究目的患者知情同意参与。
17.rna提取和qrt-pcr检测3.组织rna提取按照trizol试剂(invitrogen)说明书提示操作，通过使用tb greenpremix ex taq ii(takara)在lightcycler 480系统上进行pcr反应，对应的引物如下：5'-gacaggaccttgaagactggg-3'(正向)和5'-gggatggaggtcagcaacaa-3'(反向)。gapdh作为has2-as1表达的内参对应的引物如下：5'-acaactttggtatcgtggaagg-3'(正向)和5'-gccatcacgccaca gtttc-3'(反向)。用2-δδct值来计算has2-as1表达水平。
18.统计分析和方法4.统计分析使用graphpad prism软件和spss软件进行。采用kaplan-meier曲线分析脑胶质瘤患者的总生存期。采用卡方检验对has2-as1的表达水平和临床病理特征的相关性进行检验，当p《0.05即认为表达差异具有统计学意义。使用spss绘制roc曲线，采用roc曲线检验has2-as1在脑胶质瘤中的诊断能力
19.患者随访5.所有知情同意参与的患者至少要随访一次，随访主要是检测患者体内的has2-as1表达水平，观察患者的预后效果。随访期从患者接受治疗的第一天开始，共有80名患者随访6-36个月。随访时间中位数为12.3个月。总生存期(os)是指从手术后第一天到死亡或最后一次随访到失访的持续时间。无进展生存期(dfs)是指患者从手术第一天开始到复发转移前的生存时间。通过dfs曲线表示高表达提示了较差的生存率，有较好的预测价值。


技术特征：
1.一种预测脑胶质瘤的标志物，特征在于所述的预测的肿瘤标志物为：has2-as1，其上游的引物序列为：5'-gacaggaccttgaagactggg-3'，其下游引物序列为：5'-gggatggaggtcagcaacaa-3'。2.一种在肿瘤组织样本中预测脑胶质瘤的标志物的体外方法，包括：a)收集脑胶质瘤患者的肿瘤组织和相邻正常组织样本。b)使用qrt-pcr检测所有组织标本中的has2-as1的表达水平。c)根据步骤(b)中测定的表达水平，评估并分析肿瘤组织及正常组织中has2-as1的表达量差异。3.依照权利要求2中所检测的组织表达水平，分为高表达组和低表达组。采用卡方检验分析has2-as1的表达水平与脑胶质瘤患者临床病理特征的关系。4.依照权利要求3中表达水平的分组，进行生存分析，对生存率和预后价值进行比较。5.使用qrt-pcr检测肿瘤组织与相邻正常组织的表达水平，并评估和分析has2-as1的表达量差异，其中肿瘤组织的表达水平高于正常组织。6.采用卡方检验分析has2-as1的表达水平与肿瘤患者的临床病理特征的关系，其中年龄、性别、病理分型、组织类型等特征与肿瘤组织的表达水平无明显的关系。7.通过生存分析提示，高表达的has2-as1说明脑胶质瘤患者的预后能力差，因此具有较好的预测价值。

技术总结
本发明公开了一种用于预测脑胶质瘤的肿瘤标志物，该肿瘤标志物为HAS2-AS1，本发明采用差异分析发现，HAS2-AS1在胶质瘤中呈现极显著的高表达，通过生存分析发现，HAS2-AS1的高表达，生存风险极高，具有显著的生存意义，因此极有可能作为脑胶质瘤的肿瘤标志物。极有可能作为脑胶质瘤的肿瘤标志物。


技术研发人员：吴柏旭 请求不公布姓名 请求不公布姓名
受保护的技术使用者：浙江洛兮医疗科技有限公司
技术研发日：2021.07.07
技术公布日：2023/1/13