一种幽门螺旋杆菌固体培养基的制作方法

1.本发明涉及微生物选择分离培养技术领域，具体涉及一种幽门螺旋杆 菌固体培养基。


背景技术：

2.幽门螺旋杆菌是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的革 兰氏阴性杆菌。在1994年幽门螺杆菌被世界卫生组织所属国际癌症研究 中心列为i类生物致癌因子。2017年10月27日公布的致癌清单中再次被 列为i类致癌物。
3.因此对于幽门螺旋杆菌的检测十分有必要，但幽门螺旋杆菌生长缓 慢，通常需要3～5天甚至更长时间，才能形成针尖状小菌落。为了抑制快 速生长的兼性厌氧菌和霉菌等，常需在培养基内加入由万古霉素、tmp、 两性霉素、多黏菌素等组合的抑菌剂，以防止杂菌对幽门螺旋杆菌菌落的 掩盖以及对菌株生长的影响。
4.现有的幽门螺旋杆菌固体培养基为了抑制杂菌加入大量的抗生素从 而也抑制了幽门螺旋杆菌本身的生长，如何在维持幽门螺旋杆菌的高生长 率的，又能抑制其他干扰菌株的生长是目前幽门螺旋杆菌培养基领域需要 解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明公开了一种选择培养幽门螺旋杆菌的固体培养基，涉及微生物 选择分离培养技术。添加幽门螺旋杆菌抑菌剂在不影响幽门螺旋杆菌的基 础上，抑制大多数真菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长；丙酮酸钠 等抗氧化剂可以提高幽门螺杆菌的生长和耐气性，中和氧气的毒性作用和 抗生素的抑制作用，从而增强幽门螺杆菌的分离，同时提供一部分碳源； 牛血清白蛋白提供丰富的营养物质供幽门螺旋杆菌的生长。可以在临床中 用于幽门螺旋杆菌的检测，也可对生活用水、废水和食物等生活环境进行 检测。
6.为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
7.一种幽门螺旋杆菌固体培养基，所述幽门螺旋杆菌固体培养基包括如 下含量的成分：
[0008][0009]
进一步的，所述幽门螺旋杆菌固体培养基包括如下含量的成分：
[0010][0011]
进一步的，所述抑菌剂包括但不限于万古霉素、头孢磺啶、两性霉素 b、甲氧苄啶和硫酸多粘菌素b中的至少一种，本领域技术人员认为可行 的抑菌剂种类均在本发明的保护范围之内。
[0012]
进一步的，所述抑菌剂的组分为万古霉素、头孢磺啶、两性霉素b、 甲氧苄啶和硫酸多粘菌素b，按质量比万古霉素：头孢磺啶：两性霉素b： 甲氧苄啶和硫酸多粘菌素b＝4:2:2:2:1。
[0013]
进一步的，所述幽门螺旋杆菌固体培养基的ph为7.0～7.5。
[0014]
本发明还提供一种权利要求1所述的幽门螺旋杆菌固体培养基的制备 方法，包括以下步骤：
[0015]
称取胰酶消化酪蛋白胨、葡萄糖、酵母浸粉、牛心浸粉、环糊精、氯 化钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠、甘氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐、二硫代苏糖 醇、琼脂加入蒸馏水中，121～125℃下灭菌处理，得到混合物：
[0016]
将混合物的温度控制在45～55℃，往混合物中添加抑菌剂、牛血清白 蛋白和溶菌
酶进行混合，得到幽门螺旋杆菌固体培养基。
[0017]
进一步的，所述抑菌剂、溶菌酶和牛血清白蛋白在幽门螺旋杆菌固体 培养基120～123℃灭菌后，降温至45～55℃时加入混合。
[0018]
本发明还提供幽门螺旋杆菌固体培养基在培养幽门螺旋杆菌中的应 用。
[0019]
进一步的，所述应用可以用于临床、环境中幽门螺旋杆菌的检验，以 及评估抗菌药物敏感性和替代药物的可能性。
[0020]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0021]
1)本发明的培养基在各组分的相互作用下，抑制可快速生长的兼性 厌氧菌和霉菌，降低非目标菌株的干扰。
[0022]
2)本发明通过添加多种抗氧化剂，有效避接菌时培养基与氧气的接 触，提高容错率，并且可持续降低培养基内氧气含量，维持幽门螺旋杆菌 生长的微需氧环境。
[0023]
3)本发明通过添加溶菌酶提高幽门螺旋杆菌传代成活率，完成初代 选择分离培养和次代纯化培养，延长幽门螺旋杆菌菌体形态维持时间，提 高阳性检出率。
[0024]
4)本发明使用富含脂质的牛血清白蛋白代替羊血或马血，有效避免 培养基颜色随时间延长而加深，培养基澄清透明，便于观察幽门螺旋杆菌 的菌落生长。
具体实施方式
[0025]
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结 合具体实施例进行详细描述。
[0026]
在本发明的一些实施例中，一种幽门螺旋杆菌固体培养基，包括如下 含量的成分：
[0027][0028]
所述的抑菌剂按质量比万古霉素：头孢磺啶：两性霉素b：甲氧苄啶 和硫酸多粘菌素b＝4:2:2:2:1。
[0029]
上述幽门螺旋杆菌固体培养基的制备方法如下：
[0030]
称取胰酶消化酪蛋白胨、葡萄糖、酵母浸粉、牛心浸粉、环糊精、氯 化钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠、甘氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐、二硫代苏糖 醇、琼脂加入蒸馏水中，121～125℃下灭菌处理，得到混合物：
[0031]
将混合物的温度控制在45～55℃，往混合物中添加万古霉素10mg/l、 头孢磺啶5mg/l、两性霉素5mg/l、甲氧苄啶5mg/l和硫酸多粘菌素b 2.5 μg/ml、牛血清白蛋白和溶菌酶进行混合，得到幽门螺旋杆菌固体培养基。
[0032]
万古霉素是一种糖肽类抗生素，用于治疗细菌感染，通过阻碍细菌细 胞壁的合成，从而抑制细菌的生长和繁殖，对金黄色葡萄球菌、化脓链球 菌、肺炎链球菌等革兰氏阳性菌作用强；甲氧苄啶(tmp)为合成的广谱 抗菌剂，属磺胺增效药，其抗菌作用原理为干扰细菌的叶酸代谢。对多数 革兰阳性菌及革兰阴性菌有抗菌活性；头孢磺啶为第三代头孢菌
素，是第 一个抗铜绿假单胞菌的头孢类抗生素；两性霉素b为多烯类抗真菌药物， 对新型隐球菌、念珠菌属等有抑制作用；硫酸多粘菌素b对革兰氏阴性杆 菌有抑制或杀菌作用。
[0033]
胰酶消化酪蛋白胨、葡萄糖、酵母浸粉、牛心浸粉和环糊精提供碳源、 氮源、维生素和矿物质；抗氧化剂吸收培养基中衍化产生的毒性氧离子； 氯化钠和磷酸氢二钠提供均衡的渗透压；牛血清白蛋白提供丰富的营养物 质；丙酮酸钠可以提高幽门螺杆菌的生长和耐气性，中和氧气的毒性作用 和抗生素的抑制作用，从而提高幽门螺杆菌的产量，同时可以提供一部分 能量，参与微生物营养代谢。
[0034]
在对幽门螺旋杆菌分离株的传代研究发现，分离菌株再最初几次传代 中，其生长繁殖需要外源溶菌酶作用，再经过数次穿戴后该依赖性消失。 这是因为幽门螺旋杆菌在人体内的生存环境是富含溶菌酶的胃黏膜环境， 自身繁殖所需的解肽聚糖的酶其编码基因表达收到抑制或不表达，因此在 外部培养缺少溶菌酶的情况下此基因不能立即表达而导致样品中的幽门 螺旋杆菌在初代是不能生长繁殖，本发明通过添加溶菌酶提高幽门螺旋杆 菌传代成活率，完成初代选择分离培养和次代纯化培养，延长幽门螺旋杆 菌菌体形态维持时间，提高阳性检出率。
[0035]
实施例1
[0036]
一种幽门螺旋杆菌固体培养基，所述培养基的成分和含量如下：
[0037][0038]
按上述浓度称取胰酶消化酪蛋白胨、葡萄糖、酵母浸粉、牛心浸粉、 环糊精、氯化
钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠、甘氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐、 二硫代苏糖醇、琼脂加入1000ml蒸馏水中，121～125℃下灭菌处理，得 到混合物：
[0039]
将混合物的温度控制在45℃，往混合物中添加万古霉素10mg/l、头 孢磺啶5mg/l、两性霉素5mg/l、甲氧苄啶5mg/l和硫酸多粘菌素b 2.5 μg/ml、牛血清白蛋白和溶菌酶进行混合，得到幽门螺旋杆菌固体培养基。
[0040]
实施例2
[0041]
一种幽门螺旋杆菌固体培养基，所述培养基的成分和含量如下：
[0042][0043]
本实施例的制备方法同实施例1。
[0044]
实施例3
[0045]
一种幽门螺旋杆菌固体培养基，所述培养基的成分和含量如下：
[0046]
[0047][0048]
本实施例的制备方法同实施例1。
[0049]
实施例1、实施例2、实施例3的差异在于浓度的不同。
[0050]
对照组
[0051]
对照组采用市场上常见的国家卫生部门认可的某公司的幽门螺旋杆 菌培养基(液体250g规格)。
[0052]
对照组幽门螺旋杆菌培养基(液体250g规格)的组分及其含量如下：
[0053]
蛋白胨10.0g、牛脑浸出粉10.0g、牛心浸出粉9.0g、氯化钠5.0g、 葡萄糖2.0g、磷酸氢二钠2.5g；
[0054]
幽门螺旋杆菌培养基(液体250g规格)的ph值为7.4
±
0.2
[0055]
使用方法：
[0056]
25℃用法称取本品3.85g，加热搅拌溶解于93ml蒸馏水中，121℃高 压灭菌15min，冷至50～55℃时，加入7ml无菌脱纤维羊血和1支hp抑 菌剂，混匀，分装，备用。
[0057]
使用对照组制备的幽门螺旋杆菌培养基(液体)对幽门螺旋杆菌进行 培养，实验环境条件保持同实施例1一致。
[0058]
注：hp抑菌剂含萘啶酮酸1mg、tmp 0.5mg、万古霉素0.3mg。
[0059]
特异性试验
[0060]
采用实施例1、实施例2、实施例3和对照组的培养基分别对革兰氏 阴性菌(幽门螺旋杆菌)、革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)以及真菌(酿 酒酵母)进行接种，观察菌株在培养基上的生长情况，检测结果如表1所 示：
[0061]
表1特异性试验结果
[0062][0063]
由表1可以看出，上述实施例2所得培养基可以对非目标菌株(酿酒 酵母、金黄色葡萄球菌)进行有效的抑制，与对照组培养基结果一致。表 明了本发明的幽门螺旋杆菌固体培养基具有较强的特异性，可以特异性的 降低非目标菌株的干扰。
[0064]
生长试验
[0065]
采用实施例1、实施例2、实施例3和对照组的培养基接种幽门螺旋 杆菌进行传代培养，在添加不同溶菌酶含量的实施例1、2、3和未添加溶 菌酶的对照组分别观察其生长状况，检测结果如表2所示。
[0066]
表2成活率率试验结果
[0067][0068]
由表2可以看出，上述实施例2在三次传代中成活率均最高，说明本 发明的选择培养基可以有效提高幽门螺旋杆菌的传代成活率。
[0069]
稳定性试验
[0070]
采用实施例1、实施例2、实施例3和对照组的培养基进行对照检测， 开封处理后放置于4℃冰箱，每隔一个月分别对幽门螺旋杆菌的生长进行 检测，观察其生长情况的变化，检测结果如表3所示。
[0071]
表3稳定性试验结果
[0072][0073]
由表2可以看出，实施例2培养基在开封6个月后，其幽门螺旋杆菌 的生长率基本
保持不变，营养成分稳定，实施例1和对照组的培养基在开 封4～5个月后出现了生长率降低的趋势，可能是营养组分添加量较低出现 成分失效等不稳定的情况，说明了本发明的幽门螺旋杆菌固体培养基具有 较好的稳定性。
[0074]
正交实验
[0075]
采用实施例2中部分组分进行混合因素正交实验，分别以血样种类 (a)、溶菌酶(b)、抑菌剂(c)和抗氧化剂(d)为考察因素，具体 因素水平见下表4:
[0076]
表4因素水平表
[0077][0078]
根据表5分别配置固体培养基：
[0079]
表5正交实验设计表
[0080][0081]
实验结果综合评分用于衡量不同处方培养条件下幽门螺旋杆菌的生 长状况。综合评分为100％表示幽门螺旋杆菌生长良好，0％表示幽门螺旋 杆菌不生长。“ ”表示细菌生长，
“‑”
表示未生长。一个“ ”约为25％， 综合评分为“幽门螺旋杆菌生长情况项
”‑“
杂菌生长情况项”，并视具 体情况而定。
[0082]
表6正交实验结果
[0083][0084]
由表6可知，编号为1的培养基综合评分最高，幽门螺旋杆菌生长状 况最好，有效抑制杂菌，由结果可以看出，加入抗氧化剂维持微需氧环境， 可以抑制部分需氧微生物，降低杂菌侵染的概率。
[0085]
综上所述，本发明的一种幽门螺旋杆菌固体培养基具有较强的特异 性，维持生长所需环境，降低非目的菌株的干扰，增加对幽门螺旋杆菌的 筛选，提高幽门螺旋杆菌的传代生长率，同时具有较好的稳定性，开封后 可以长时间使用，并且可以在此基础上进行药敏检测，为临床药物的选择 提供可靠依据。
[0086]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改 进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。