一种芽孢杆菌Bacillussp.Za的菌剂保护剂及其应用的制作方法

一种芽孢杆菌bacillus sp.za的菌剂保护剂及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物降解领域，涉及一种芽孢杆菌bacillus sp.za的菌剂保护剂及其应用。


背景技术：

2.除草剂作为中国农业生产中的重要生产资料，为农作物增产增收发挥了巨大作用。但由于除草剂在耕地土壤的长期大量施用，并且缺乏严格的科学监督和使用管理，除草剂造成的残留污染问题和其环境归趋已经引发世界范围的广泛关注。除草剂在土壤中的残留会导致土壤菌群结构多样性降低，影响后茬作物的出苗率和产量，甚至经植物根系吸收进入食物链后给人类健康带来不可逆危害。除草剂在土壤中的消减以化学降解和微生物降解方式为主，其中，微生物代谢在降解过程中起到关键作用，通过合理运用农药残留高效降解菌株，有望改善土壤中除草剂的残留污染问题。
3.目前，将微生物修复土壤农药残留投入实际应用的主要途径是将农药残留高效降解菌株加工成为液体剂型或固体剂型。液体剂型的生产耗时短、工序少，菌种纯度高，但在运输和保存的过程中菌种易失活。固体剂型相对于液体剂型而言，虽需要设备人力等投入，但可以延长保存周期、运输及施用方便。因此，在实际应用中，如何在降低成本的同时，维持除草剂降解菌剂的活菌数并提高降解效率，成为亟需解决的难题。通过在活菌制剂中添加保护剂并进行多种剂型的开发，为除草剂环境污染的生物治理提供了一条行之有效的途径。


技术实现要素：

4.发明目的：针对微生物制剂现有技术存在的问题，本发明提供一种芽孢杆菌的菌剂保护剂，该保护剂包括液体菌剂保护剂和固体菌剂保护剂，可以有效解决芽孢杆菌微生物液体菌剂和固体菌剂活菌数低、储存期短等问题，并且使得微生物菌剂可以在常温下进行保藏，且降解性能不易退化，进一步保障了微生物菌剂在乳氟禾草灵除草剂降解中的实际应用。
5.本发明还提供芽孢杆菌液体菌剂保护剂和固体菌剂保护剂的应用。
6.技术方案：为了实现上述目的，本发明所述的一种芽孢杆菌bacillus sp.za的菌剂保护剂，所述菌剂保护剂包括液体菌剂保护剂和/或固体菌剂保护剂，所述液体保护剂为有机物、稳定剂和无机盐，所述有机物为柠檬酸钠，稳定剂为羧甲基纤维素，无机盐为氯化钾；所述固体菌剂保护剂为有机肥。
7.其中，所述柠檬酸钠、羧甲基纤维素或者氯化钾在菌剂中有效使用浓度范围为按质量分数0.1％-0.3％。其中，所述柠檬酸钠、羧甲基纤维素、氯化钾的质量比为1-2﹕1-3﹕1-3。
8.作为优选，所述柠檬酸钠、羧甲基纤维素、氯化钾的质量比为2﹕2﹕3。
9.其中，所述有机肥为鸡粪有机肥、蚯蚓粪有机肥或者猪粪有机肥。
10.作为优选，所述有机肥为猪粪有机肥。
11.作为优选，所述芽孢杆菌为bacillus sp.za，保藏号为：cctcc no：m2014050。
12.其中，所述保护剂中的柠檬酸钠、羧甲基纤维素、氯化钾分别添加到芽孢杆菌发酵液中或者将柠檬酸钠、羧甲基纤维素、氯化钾按比例混合再添加到发酵液中。
13.本发明所述的芽孢杆菌的菌剂保护剂在保护芽孢杆菌za中的应用。
14.其中，所述芽孢杆菌的菌剂保护剂中柠檬酸钠、羧甲基纤维素、氯化钾在芽孢杆菌发酵液中的质量百分比为0.10-0.20％、0.10-0.30％和0.10-0.30％；
15.作为优选，所述芽孢杆菌的菌剂保护剂中柠檬酸钠、羧甲基纤维素、氯化钾添加到芽孢杆菌发酵液中的质量分别为0.20％、0.20％和0.30％；
16.其中，所述有机肥的添加量为每50-100g载体添加10ml芽孢杆菌种子液。
17.作为优选，所述猪粪有机肥的添加量为每100g载体添加10ml芽孢杆菌种子液。
18.其中，所述芽孢杆菌发酵液为对数生长期芽孢杆菌按1-3％接种量接种到发酵培养基进行发酵培养，作为发酵液。
19.其中，所述芽孢杆菌种子液为za菌液接入发酵培养基中，30℃、160rpm培养至对数生长期；菌液5000rpm离心10min收集菌体，用无菌水洗涤重悬菌体，作为种子液。
20.作为优选，挑取za单菌落接种至lb液体培养基中培养至对数生长期，按1-3％接种量接入1000ml发酵培养基进行发酵培养作为发酵液，培养条件为30℃，160rpm。其中，所述芽孢杆菌的菌剂保护剂在有效提高芽孢杆菌za活菌数，延长储存期中的应用。
21.其中，所述芽孢杆菌的菌剂保护剂为保护芽孢杆菌za菌剂降解土壤残留降解乳氟禾草灵中的应用。
22.本发明中芽孢杆菌za的菌剂保护剂，优选通过以下技术方案制备得到：
23.1)za液体菌剂保护剂最佳物质的筛选；
24.2)za液体菌剂保护剂最佳物质浓度的筛选；
25.3)za液体菌剂保护剂添加后的保存实验；
26.4)za液体菌剂保护剂添加后的降解实验；
27.5)za固体菌剂保护剂的筛选；
28.6)za固体菌剂的制备
29.7)za固体菌剂保护剂添加后的保存实验；
30.8)za固体菌剂保护剂添加后的降解实验。
31.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明首次以乳氟禾草灵除草剂高效降解菌株bacillus sp.za为基础，设计菌剂保护剂的液体剂型和固体剂型，两种剂型可以单独使用也可以混合使用。本发明通过试验进行筛选优化，兼具成本考虑和应用效果，得到液体菌剂保护剂的最适物质配比和固体菌剂保护剂最适载体材料。本发明的保护剂可以有效解决菌剂保存过程中的菌株失活、降解效率降低等关键问题，满足微生物菌剂应用于农药残留降解的需求，具备实用价值。
32.本发明的芽孢杆菌液体菌剂保护剂，其有机物成分为0.20％的柠檬酸钠，稳定剂成分为0.20％的羧甲基纤维素，无机盐成分为0.30％的氯化钾，该液体保护剂可以提高菌株的存活率，保存60d后活菌数仍达8.19
×
108cfu/ml，7d内对乳氟禾草灵的降解率为83.50％。本发明的芽孢杆菌固体菌剂能够利用猪粪有机肥作为保护剂，保存60d后活菌数
仍达8.26
×
108cfu/ml，7d内对土壤中乳氟禾草灵的降解率为85.52％。进一步保障了固体菌剂在农药降解中的实际应用。
33.本发明中，两类保护剂所用材料均来源广泛，成本低廉，工艺简单，使用方便，其中，固体菌剂保护剂还能够促进廉价农副产品的资源化利用。两种保护剂既可以联合使用，也可以分开使用，均具有良好的应用效果，当二者联合使用时，可以进一步提高菌株的存活率。
附图说明
34.图1为za液体菌剂保护剂添加后的保存实验；
35.图2为za液体菌剂保护剂添加后的降解实验；
36.图3为za固体菌剂保护剂的筛选；
37.图4为za固体菌剂保护剂添加后的保存实验；
38.图5为za固体菌剂保护剂添加后的降解实验。
具体实施方式
39.以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
40.实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
41.本发明中乳氟禾草灵购自上海安谱实验科技股份有限公司(纯度98％)，供试菌株za为芽孢杆菌(bacillus sp.)，2014年2月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为：cctcc no：m2014050，由南京农业大学提供。
42.其中，泥炭、花生壳粉、秸秆肥、鸡粪有机肥、蚯蚓粪有机肥、猪粪有机肥等购自南京易循环农业科技有限公司，将各个材料自然风干3d并过40目筛，经121℃高温灭菌后备用。
43.实施例1
44.za液体菌剂保护剂最佳物质的筛选
45.za菌种活化后挑取单菌落于液体lb中，30℃、160rpm培养至对数生长期(菌落数约为108cfu/ml)，按体积比1％接种量接种发酵培养基(葡萄糖9g/l，蛋白胨2g/l，kh2po
4 1.0g/l,mgso4·
7h2o 0.4g/l,nh4cl 0.8g/l，nacl 0.8g/l，ph 7.0-7.2)，30℃、160rpm进行过夜培养，作为发酵液。将发酵液分装至100ml锥形瓶中，其它条件保持一致。
46.将保护剂分为a：有机物(柠檬酸钠和乙酸钠)、b：稳定剂(糊精和羧甲基纤维素)、c：无机盐(cacl2和kcl)三类，作为三个因素，每类保护剂选择上述两种物质作为两个水平，每种物质浓度均为0.30％(按添加到发酵液的质量分数计算)，进行三因素两水平l4(23)的正交试验，
47.由表1知，通过分析极差r值发现各因素对菌株za存活提高率的影响作用顺序为：b》c》a，即稳定剂的影响较为显著，无机盐和有机物影响程度次之。综合分析3种因素的k值，其最优水平是a1b2c2，即与其他物质组合相比，柠檬酸钠、羧甲基纤维素、kcl组合对菌株生长影响最大。由活菌提高率结果可知，该组合对菌株保护效果最佳，为25.09％。因此，选择该组合作为最适保护剂组合开展后续浓度配比的研究。
48.表1 za液体菌剂保护剂物质组合正交表
[0049][0050][0051]
实施例2
[0052]
za液体菌剂保护剂最佳物质浓度的筛选
[0053]
根据实施例2中筛选出的最佳保护剂组合，选择三种保护剂(a：柠檬酸钠、b：羧甲基纤维素、c：kcl)作为三种因素，每种保护剂设置三个终浓度(0.10％、0.20％和0.30％)作为三种水平，进行三因素三水平l9(33)正交试验筛选最适浓度组合。
[0054]
由表2，各因素间的主次顺序为：a》c》b，最优水平为a2b2c3，即0.20％的柠檬酸钠、0.20％的羧甲基纤维素和0.30％的kcl。且该浓度组合下的菌株存活提高率为35.71％，保护效果最佳。由此确定该浓度组合为za液体菌剂保护剂的最适使用浓度组合。
[0055]
表2 za液体菌剂保护剂浓度组合正交表
[0056][0057]
实施例3
[0058]
za液体菌剂保护剂添加后的保存实验
[0059]
将所述实施例2中优化出的保护剂组合5添加至za发酵液中(发酵液培养同实施例1)，常温保存30、60d后进行梯度稀释涂布，培养3d后计算活菌数。
[0060]
结果如图1所示，在没有保护剂的情况下，活菌数在30d内即出现明显下降。而随着保存期的延长，添加了0.20％柠檬酸钠、0.20％羧甲基纤维素和0.30％kcl保护剂的液体菌剂仍保持较高的生物量，60d活菌数仍达到8.19
×
108cfu/ml。即该保护剂组合可以在储存期内将活菌数维持在较高水平，从而延长液体降解菌剂的货架期。
[0061]
实施例4
[0062]
za液体菌剂保护剂添加后的降解实验
[0063]
选择实施例3中优化出的四个最适保护剂组合1(0.10％柠檬酸钠、0.10％羧甲基纤维素、0.10％kcl)、组合3(0.10％柠檬酸钠、0.30％羧甲基纤维素、0.30％kcl)、组合4(0.20％柠檬酸钠、0.10％羧甲基纤维素、0.20％kcl)、组合5(0.20％柠檬酸钠、0.20％羧甲基纤维素、0.30％kcl)添加至za发酵液中(发酵液培养同实施例1)进行验证。取上述组合保存30d后的菌液，以体积比1％的接种比接种到含20ml终浓度50mg/l乳氟禾草灵的无机盐培养基中，3d后使用hplc测定其中乳氟禾草灵的浓度，并计算降解率。如图2，加入四种保护剂保存30d后的za液体菌剂对乳氟禾草灵的降解效果均显著高于对照组，其中正交组合5
(0.20％柠檬酸钠、0.20％羧甲基纤维素、0.30％kcl)对乳氟禾草灵降解率最高，为83.50％。
[0064]
实施例5
[0065]
za固体菌剂保护剂的筛选
[0066]
za菌种活化后挑取单菌落接入发酵培养基中，30℃、160rpm培养至对数生长期(菌落数约为108cfu/ml)。菌液5000rpm离心10min收集菌体，用无菌水洗涤3次重悬菌体，作为za种子液。各取2g不同灭菌载体泥炭、秸秆肥、花生壳粉、米糠、鸡粪有机肥、蚯蚓粪有机肥、猪粪有机肥，分别加入20ml灭菌水，30℃、160rpm摇床震荡24h，得到载体悬浊液。将100μl za种子液(菌落数约为5
×
108cfu/ml)接种至5ml载体悬浊液中，再次震荡培养，于第2、4d取样涂布测定不同载体处理下的活菌数，试验设置三个平行，判断载体对菌株生长的影响。
[0067]
结果如图3所示，向各载体中接种za后，菌株均可生存及繁殖。储存4d后发现猪粪有机肥载体中所含活菌数最高，达到8.88
×
108cfu/g，秸秆肥和花生壳粉所含活菌数较少。猪粪有机肥等载体本身含有其它类型载体无法提供的丰富有机质，可以为菌体生长提供良好的环境和营养。
[0068]
实施例6
[0069]
za固体菌剂的制备
[0070]
将实施例5中各载体自然风干后121℃、20min高温高压灭菌两次，无菌条件下准确称取30g载体于聚乙烯袋中，按体积质量比10ml/100g添加量将培养至对数生长期的菌株za菌液(108cfu/ml)添加至不同载体中，混合均匀后在聚乙烯袋表面用灭菌牙签随机扎5个孔径一致的透气孔，再套一层同样扎5个透气孔的聚乙烯袋。成品固体菌剂置于30℃培养箱培养，3d后取出于干燥阴凉处保存待用。
[0071]
实施例7
[0072]
za固体菌剂保护剂添加后的保存实验
[0073]
称取实施例6中各成品固体菌剂2.00g至装有18ml无菌水的灭菌三角瓶内，三角瓶中加入若干灭菌玻璃珠，涡旋震荡10min后即为10-1
菌悬液，吸取100μl菌悬液至含有900μl灭菌水的离心管中。依次稀释8个浓度梯度，取10-6-10-8
稀释梯度的菌悬液100μl均匀涂布于相应的固体培养基平板上，每组处理设置3个重复，30℃培养3d后进行菌落计数。
[0074]
结果如图4所示，随着固体菌剂储存期的延长，泥炭、秸秆肥和花生壳粉载体固体菌剂的活菌数均出现大幅度下降，其余几种载体中的活菌数呈现先上升后下降的趋势。30和60d时，活菌保存效果最好的均为猪粪有机肥，为8.26
×
108cfu/g。
[0075]
实施例8
[0076]
za固体菌剂保护剂添加后的降解实验
[0077]
选择实施例7中表现良好的保护剂(米糠、鸡粪有机肥、蚯蚓粪有机肥、猪粪有机肥)与乳氟禾草灵终浓度为10mg/kg的供试土壤按照1﹕9质量比充分混匀，装入黑色塑料杯中置于光照培养箱，培养条件为：光照12h，温度26℃，黑暗12h，温度20℃(24h交替进行)。通过补加水分调节土壤含水量在25％-30％之间，在第1、3、5和7d分别取5g土样检测乳氟禾草灵残留量。同时设置不加固体菌剂的对照组，对照与处理均设3个重复。
[0078]
结果如图5所示，添加各固体菌剂后，土壤中乳氟禾草灵降解率均明显上升。相同条件下ck降解率只能达到27.66％，而四组固体菌剂的7d降解率均高于70％，其中以猪粪有
机肥为保护剂的固体菌剂降解效果最优，为85.52％。综合考虑活菌数和降解效果，筛选得到猪粪有机肥为za固体菌剂的最适保护剂。