效价测定的制作方法

效价测定
1.对相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年4月20日提交的美国临时专利申请第63/012,884号的优先权，其内容全部并入本文。
技术领域
3.本文提供用于评估人间充质干细胞响应暴露于诸如tnf-α等促炎性细胞因子产生抗炎细胞因子的效价的方法。人间充质干细胞能够产生足够的抗炎细胞因子，然后可以用于治疗涉及长期炎症的疾病，如衰老衰弱、阿尔茨海默病和冠状病毒感染。


背景技术：

4.衰老衰弱给个体的整体健康和福祉带来了一个非常令人担忧的问题。衰老衰弱是一种老年综合征，其特征是虚弱、体力活动少、运动能力减慢、精疲力竭和体重无意中减轻。参见yao,x.等人，clinics in geriatric medicine27(1):79-87(2011)。此外，许多研究表明，衰老衰弱和炎症之间存在直接关联。参见hubbard,r.e.等人，biogerontology 11(5):635-641(2010)。
5.免疫衰老的特征是低度、慢性系统性炎症状态，称为发炎。参见franceshi,c.等人，annals of the new york academy of sciences 908:244-254(2000)。这种在衰老和衰老衰弱中发现的炎症状态或慢性炎症加剧，导致免疫失调和先天免疫和适应性免疫的复杂重塑。在免疫衰老中，t细胞和b细胞储库是偏态的，导致重新表达cd45ra(temra)的cd8

t效应记忆细胞和cd19

晚期/衰竭记忆b细胞增加，且cd8

稚t细胞和切换记忆b细胞(cd27

)减少。参见blomberg,b.b.等人，immunologic research 57(1-3):354-360(2013；colonna-romano,g.等人，mechanisms of ageing and development130(10):681-690(2009)；和koch s.等人，immunity&ageing:5:6(2008)。t细胞和b细胞储库的这种转变导致了不感受的免疫状态或低效的免疫状态。免疫系统的这种恶化导致更容易感染传染病，并降低对疫苗接种的反应。最佳的b细胞功能对于针对疫苗产生有效的抗体反应和防止感染源至关重要。众所周知，与衰老相关的系统性炎症(tnf-α、il-6、il-8、infγ和crp)增加诱导b细胞功能受损，导致抗体反应差和疫苗效价降低。
6.发炎已受到相当大的关注，因为它表明免疫变化与许多老年常见疾病和疾病状况(例如衰老衰弱)之间存在联系。循环炎症介质，例如细胞因子和急性期蛋白，是观察到随着衰老而增加的低度炎症的标记。这些促炎性细胞因子(例如tnf-α、il-6)损害b细胞生成针对外源性抗原和疫苗的保护性抗体的能力。这种受损的b细胞反应是通过减少类别转换重组(class switch recombination,csr)来测量的，csr是免疫球蛋白将同种型从igm转换为次级同种型(igg、iga或ige)的能力。免疫球蛋白同种型转换对于正确的免疫反应至关重要，因为每个同种型的效应器功能不同。csr和体细胞超变(somatic hypermutation,shm)的关键参与者是由aicda基因编码的酶，即激活诱导胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,aid)。aid在csr和shm中的基本功能是，通过在免疫球蛋白的切换区
和可变区将胞嘧啶转化为尿嘧啶来启动dna断裂。
7.还证明，在人类中，生成的tnf-α的量：(1)取决于系统炎症的数量，(2)削弱了相同b细胞受丝裂原或抗原刺激的能力。参见frasca,d.等人，journal of immunology 188(1):279-286(2012)。因此，由于多种原因，患有衰老衰弱的个体的免疫反应受损。
8.tnf-α表达还参与免疫过程的启动、维持和扩增，这些免疫过程产生神经炎症，并与阿尔茨海默病和相关痴呆的发病机制以及导致神经损伤的其他形式的炎症有关。
9.阿尔茨海默病(ad)是一种慢性进行性神经退行性脑疾病-衰老综合征。它是近500万美国人中老年人发病和死亡的主要原因。ad占所有痴呆病例的70％。痴呆是一个巨大的公共卫生问题，每7秒钟就有一例新病例在世界各地确诊。这种疾病没有治愈方法，随着病情的发展而恶化，最终导致7年内死亡。不到3％的人在诊断后活14年以上。经诊断患有ad的人通常超过65岁，除了完成决策和解决问题的任务外，完成标准的语言和视觉记忆测试也有挑战。2006年，全球有2660万患者，其中500万在美国。据预测，到2050年，全球每85人中就有1人患有阿尔茨海默病。早期症状通常被错误地认为是与年龄有关的问题，或是压力的表现。
10.除了β-淀粉样物质沉积和神经纤维缠结外，阿尔茨海默病(ad)还涉及复杂的病理学和多种机制。越来越多地认识到，促炎性状态会导致继发性痴呆。在这方面，促炎性细胞因子在淀粉样物质沉积和神经纤维缠结附近大量存在，因此系统性炎症和β-淀粉样物质聚积之间存在关联。此外，个体在尸检时可能具有大量符合其诊断ad的淀粉样物质沉积和神经纤维缠结，但从未表现出痴呆史：在这些情况下，炎症标记的表达明显低于ad患者。
11.ad的特征还在于导致不良结果的神经血管受损。其中值得注意的是血脑屏障(blood-brain barrier,bbb)的低灌注和损害。作为结果的bbb损害可能损害经内皮细胞的交换。由于aβp对内皮细胞增殖和迁移的直接抑制，经内皮细胞交换部分受损。最终，aβp经bbb中的清除效率很低，并导致aβp积聚在脑实质中。因此，受损的神经血管是ad的另一个重要的治疗靶标。
12.已证明冠状病毒感染是对人类的重大威胁。具体来说，如果感染covid-19的患者需要高级呼吸支持，他们的结局尤其差。这些患者的死亡率约为54％。临床恶化通常发生在症状出现后7-10天，与病毒滴度下降相关，表明病理学是由炎症而非直接病毒损伤驱动的。在重度covid-19患者中，炎症标记通常显著升高，从而导致高炎症综合征，这可能有助于感染的发病率和死亡率。高炎症综合征通常涉及不受控制、自我持续且破坏组织的炎症活动。
13.上述疾病或与其类似的疾病通常使用小分子、蛋白质、疫苗或抗体等治疗剂来治疗。使用细胞疗法治疗上述疾病在本领域内并没有得到很好的记录或探索。细胞疗法代表了一种跨越广泛治疗适应症的新的、令人兴奋的治疗模式。
14.间充质干细胞是能够迁移到损伤位点，同时由于无法检测到主要组织相容性复合体ii类(mhc-ii)分子的表达而被免疫赦免并低水平表达mhc-i分子的多能干细胞。参见le blanc,k.等人，lancet 371(9624):1579-1586(2008)和klyushnenkova e.等人，j.biomed.sci.12(1):47-57(2005)。因此，同种异体间充质干细胞在治疗和再生医学方面具有巨大的前景，并且在多种疾病过程的临床试验中已被反复证明具有较高的安全性和疗效。参见hare,j.m.等人，journal of the american college of cardiology 54(24):2277-2286(2009)；hare,j.m.等人，tex.heart inst.j.36(2):145-147(2009)；以及lalu,
m.m.等人，plos one 7(10):e47559(2012)。还证明，它们在移植到患者体内后不会发生恶性转化。参见togel f.等人，american journal of physiology renal physiology 289(1):f31-f42(2005)。已经证明，用间充质干细胞进行治疗可以改善严重的移植物抗宿主病，预防缺血性急性肾衰竭，有助于糖尿病患者的胰岛和肾小球修复，逆转严重的肝衰竭，再生受损的肺组织，减轻脓毒症，心肌梗死后逆转重塑并改善心脏功能。参见le blanc k.等人，lancet371(9624):1579-1586(2008)；hare,j.m.等人，journal of the american college of cardiology 54(24):2277-2286(2009)；togel f.等人，american journal of physiology renal physiology 289(1):f31-f42(2005)；lee r.h.等人，pnas103(46):17438-17442(2006)；parekkadan,b.等人，plos one 2(9):e941(2007)；ishizawa k.等人，febs letters 556(1-3):249-252(2004)；nemeth k.等人，nature medicine 15(1):42-49(2009)；iso y.等人，biochem.biophys.res.comm.354(3):700-706(2007)；schuleri k.h.等人，eur.hearth j.30(22):2722-2732(2009)；以及heldman a.w.等人，jama 311(1):62-73(2014)。此外，间充质干细胞也是用于组织工程的多种细胞类型的潜在来源。参见gong z.等人，methods in mol.bio.698:279-294(2011)；price,a.p.等人，tissue engineering part a 16(8):2581-2591(2010)；和togel f.等人，organogenesis 7(2):96-100(2011)。
15.间充质干细胞具有免疫调节能力。它们控制炎症和淋巴细胞和髓源性免疫细胞的细胞因子产生，没有免疫抑制毒性的证据，并且免疫原性低。参见bernardo m.e.等人，cell stem cell 13(4):392-402(2013)。
16.体内研究表明，当移植到胎羊体内时，人间充质干细胞会发生位点特异性分化，分化为各种细胞类型，包括肌细胞和心肌细胞。参见airey j.a.等人，circulation 109(11):1401-1407(2004)。这些间充质干细胞在移植到非免疫抑制免疫活性宿主体内后，可在多个组织中持续长达13个月。其他使用啮齿动物、狗、山羊和狒狒进行的体内研究同样表明，人间充质干细胞异种移植物不会在接受者内引起淋巴细胞增殖或系统性同种抗体产生。参见klyushnenkova e.等人，j.biomed.sci.12(1):47-57(2005)；aggarwal s.等人，blood 105(4):1815-22(2005)；augello a.等人，arthritis and rheumatism56(4):1175-86(2007)；bartholomew a.等人，exp hematol.30(1):42-48.(2002)；dokic j.等人，european journal of immunology 43(7):1862-72(2013)；gerdoni e.等人，annals of neurology 61(3):219-227(2007)；lee s.h.等人，respiratory research 11:16(2010)；urban v.s.等人，stem cells 26(1):244-253(2008)；yang h.等人，plos one 8(7):e69129(2013)；zappia e.等人，blood 106(5):1755-1761(2005)；bonfield t.l.等人，american journal of physiology lung cellular and molecular physiology 299(6):l760-70(2010)；glenn j.d.等人，world journal of stem cells.6(5):526-39(2014)；guo k.等人，frontiers in cell and developmental biology 2:8(2014)；puissant b.等人，british journal of haematology 129(1):118-129(2005)；以及sun l.等人，stem cells 27(6):1421-32(2009)。总地来说，这些对同种异体安全性和有效性的重复发现巩固了使用间充质干细胞作为同种异体移植物成功再生组织的概念。
17.ad动物模型研究也表明支持msc的临床潜力。参见neves af等人，exp.neurol.2021:113706。有益作用包括减少炎症、增加aβ降解因子和aβ清除、降低高磷酸化tau和提高选择性激活(m2)小胶质标记。这些益处看起来至少部分是由于aβ诱导msc释放
化学引诱剂，这些化学引诱剂招募替代性小胶质细胞进入大脑以减少aβ沉积。参见lee jk等人，stem cells 2012；30(7):1544-55。msc在aβ聚积之前对年轻ad模型小鼠有效，导致大脑aβ沉积显著减少，突触前蛋白表达显著增加。参见bae js等人，curr alzheimer res.2013；10(5):524-31。令人印象深刻的是，这些作用持续了至少2个月，表明msc可以用作前驱性ad的介入治疗。简而言之，ad临床前研究表明，msc可以跨越bbb，抑制神经炎症，促进神经发生，抑制β-淀粉样物质沉积，促进清除，减少凋亡，促进海马神经发生，改善树突形态，并提高行为和空间记忆性能。


技术实现要素：

18.间充质干细胞(msc)响应促炎性刺激产生免疫调节细胞因子的特性，是msc所采用的重要治疗作用机制。
19.用于评估细胞治疗中所用细胞效价的准确、可重复且相关测定，对于质量控制目的至关重要，例如，确保基于细胞的治疗产品的稳定性和一致性。
20.本领域用于评估细胞效价的通用测定侧重于鉴别特定生物标记或细胞表面受体的表达。这些测定有望提供细胞效价的间接测量(例如，表达tnfr1的msc有望抑制pbmc增殖)。因此，本领域中使用的“效价测定”是测量细胞受体或生物标记表达的身份分析，并且无法准确测量细胞表达或产生关键大分子(例如抗炎细胞因子)的能力或效价。
21.已经开发了msc效价测定，其中用lps刺激msc；然而，这些效价测定会产生“不相关”刺激(例如，不相关，因为lps刺激是细菌感染的模拟物，msc未用作抗菌剂)。由于msc通常不表达tlr4或cd14，而tlr4和cd14都是lps刺激和信号传导所必需的，因此这些测定进一步无关。因此，本技术的目的是提供，准确测定间充质干细胞(msc)响应诸如tnf-α等促炎细胞因子产生免疫调节细胞因子的能力的效价分析。理想的是，测量是针对生理意义的成分。
22.本文提供了评估msc效价的方法，例如，评估msc在细胞制备中的效价(例如，制备属于许多用于治疗用途的细胞的msc制剂)。本文提供的方法在评估细胞或细胞批次效价之前，利用tnf-α刺激步骤来评估msc是否产生抗炎细胞因子，以及与本领域中使用的标准细胞效价测定相比，达到何种水平，标准细胞效价测定仅涉及检测细胞表面受体或生物标记的存在，无法评估细胞是否能够表达与所述受体或生物标记的刺激相关联的分子。已经确定，加入tnf-α刺激步骤可以提高效价测定的可靠性，减少取自同一细胞批次的msc制剂以及包含相同细胞类型但是取自不同细胞批次的msc制剂之间的变异性。
附图说明
23.图1描绘了用重组人tnfα刺激msc后抗炎细胞因子的产生水平。
24.图2描绘了用重组人tnfα刺激后msc的活力。
25.图3描绘了用重组人tnfα刺激msc超过24小时后抗炎细胞因子的产生水平。
26.图4描绘了使msc对il-17a刺激敏感但暴露于重组人tnfα1小时后il-8和il-13的产生水平。
具体实施方式
27.本技术的一个方面涉及一种评估msc产生抗炎细胞因子的效价的方法。
28.在一个实施方案中，该方法包括在鉴别和量化抗炎细胞因子产生水平之前，用促炎性细胞因子或分子刺激msc一段时间。
29.msc可以来源于骨髓、脂肪组织、外周血、肺、心脏、羊水、内部器官、羊膜、脐带或胎盘或其他组织，也可以从诱导多能干细胞(ipsc)或其他来源分化而来。
30.可以用促炎性细胞因子或分子刺激msc。促炎性细胞因子可选自tnf-α、il-1、il-2、il-6、il-12、il-17a、il-18、ifn-γ或其任何组合。在一些实施方案中，用tnf-α和il-17a或其他组合刺激msc。其他促炎性分子包括c反应蛋白(c-reactive protein,crp)或毒力因子。毒力因子可以是任何有助于以下的病毒分子：在宿主小生境中的定植、宿主免疫反应的免疫逃避或逃避、宿主免疫反应的免疫抑制或抑制、进出细胞或从宿主获得养分。毒力因子的一个例子是sars-cov-2刺突蛋白。
31.令人惊讶的是，已证明，仅用il-17a处理时，msc并不产生或产生水平显著较低的抗炎细胞因子。当用il-17a和tnf-α一起处理msc时，msc产生水平显著较高的抗炎细胞因子。这一意外发现的重要性源于评估细胞效价所需的现行标准，即确认细胞表达某些受体或生物标记，而不评估受体促进特定分子产生的能力。这一发现证实，即使细胞具有已知产生特定分子的受体，但细胞不会以可用于后续治疗的有效效价产生所述分子。此外，它表明msc对适应症或患者特异性的不同促炎分子组合有不同的反应，以最适合特定患者的特定治疗。
32.在将500-50000个间充质干细胞培养在50-200微升培养基中的条件下，用于刺激msc的促炎性细胞因子或分子的量可以为10fg/ml至10μg/ml、1pg/ml至10μg/ml、1μg/ml至10μg/ml、1fg/ml至1pg/ml、1fg/ml至10μg/ml或1pg/ml至5μg/ml。浓度随细胞数量和/或体积的变化而相应调整。
33.在量化抗炎细胞因子产生水平之前，可以用促炎性细胞因子或促炎性分子刺激msc 1小时至24小时、1小时至12小时、2小时至6小时或1小时至4小时、24小时至120小时、24小时至72小时或120小时以上。
34.用促炎性细胞因子或分子刺激msc后，可以检查和量化的抗炎细胞因子是il-1ra、il-4、il-7、il-8、il-10、il-13、g-csf或其任何组合。
35.在其他实施方案中，用促炎性细胞因子或分子刺激msc可以导致，每500-50,000个培养在50-200微升培养基中的细胞产生浓度范围为1fg/ml至100ng/ml、1fg/ml至10μg/ml、1fg/ml至10pg/ml、1fg/ml至10fg/ml、10fg/ml至10pg/ml、10pg/ml至10μg/ml、10μg/ml至1mg/ml、1pg/ml至10pg/ml、1μg/ml至10μg/ml或10pg/ml至1μg/ml的抗炎分子。浓度可以随着细胞数量和/或培养基体积的变化而相应调整。
36.在一些实施方案中，该方法还包括在用促炎性细胞因子刺激前检查msc上生物标记的表达。可以探寻的生物标记包括cd105

、cd90

、cd73

、cd45-、cd34-、cd19-、cd11b-、hla-dr-、il-17ra

或其任何组合。
37.在其他实施方案中，该方法还可以包括在用促炎性细胞因子刺激前将msc接种到基质上的步骤。基质可以是添加或不添加基质涂层的膜、塑料表面、玻璃表面或细胞培养孔板，例如96孔板。将msc接种到基质上的持续时间可以为1小时至24小时、1小时至12小时、2小时至6小时或1小时至4小时。接种期结束后，应当将msc适当地粘附在基质上。
38.在用促炎性细胞因子刺激前，可以将msc可分成较小的msc群。将msc分离成较小的
群可以更准确地评估刺激后msc产生抗炎细胞因子的能力。
39.在一些实施方案中，该方法还可以包括在用促炎性细胞因子刺激后分离msc上清液的步骤。一旦收集上清液，就可以将其储存在-80℃下。可以通过使用电化学发光免疫测定进一步分析上清液，以确定msc产生的抗炎细胞因子的水平。效价测定中通常使用的检测方法不如电化学发光免疫测定敏感，因此使用电化学发光免疫测定可以检测msc产生的飞克(femtogram)浓度的细胞因子。
40.在其他实施方案中，该方法还包括在用促炎性细胞因子刺激msc一段时间后对其进行活力分析。活力分析可以是atp检测分析，例如celltiter glo分析(promega)、四氮唑还原分析、刃天青还原分析(resazurin reduction assay)、蛋白酶活性标记分析、钠钾比分析、细胞溶解或膜渗漏分析、线粒体活性或半胱氨酸天冬氨酸酶分析、功能分析、基因组和蛋白质组分析或其任何组合。也可以通过流式细胞术评估msc活力。
41.与用媒介处理的msc群相比，用促炎性细胞因子刺激后msc的活力可以大70％。
42.在其他实施方案中，该方法还包括基于产生的抗炎分子的量，为msc的效价指定等级。指定给msc效价的等级包括阈值等级，其中msc可以具有以下的效价等级：每500-50,000个培养在50-200微升培养基中的细胞产生至少1fg/ml至100ng/ml、1fg/ml至10μg/ml、1fg/ml至10pg/ml、1fg/ml至10fg/ml、10fg/ml至10pg/ml、10pg/ml至10μg/ml、10μg/ml至1mg/ml、1pg/ml至10pg/ml、1μg/ml至10μg/ml or 10pg/ml至1μg/ml的抗炎细胞因子。
43.实施例
44.实施例1
45.将从骨髓抽吸物中获取并随后冷冻保存的人msc群解冻。解冻后，取一份msc的等分试样进行免疫表型分型，以确认细胞身份。这包括证实msc表达cd105、cd90和cd73，但缺乏cd45、cd34、cd19、cd11b和hla-dr的表达。
46.从剩余的细胞中，将10000个msc接种到96孔板的孔中，并允许其在培养基中粘附过夜。第二天，用新鲜培养基和媒介(pbs、gibco)或各种浓度的促炎性细胞因子(r&d systems)替换96孔板中的培养基。24小时后，收集上清液，并使用细胞滴度glo测定(cell-titer glo assay)评估细胞活性。通过msd电化学发光免疫测定分析上清液的免疫调节细胞因子产生。在第二天检测之前，将上清液在4℃下孵育在适当的msd板上过夜。
47.图1描绘了用tnf-α刺激24小时后上清液中msc产生的免疫调节细胞因子的浓度水平。所示数据为3个单独批次msc的代表性实验的平均值
±
标准偏差。msc在tnf-α刺激24小时内以剂量依赖性方式稳健产生多种免疫调节细胞因子，包括il-1ra、il-4、il-7、il-8、il-10和il-13。
48.图2描述了msc与tnf-α一起孵育24小时后的细胞活力。收集上清液，并向msc中加入细胞滴度glo试剂。允许试剂在室温下孵育10分钟。10分钟后，在spectramax平板读取器上读取发光读数。细胞活力通过将值归一化为仅用载体处理的细胞来确定。所有用tnf-α处理的msc，包括用最高浓度100ng/ml刺激的msc，都表现出高于80％的平均细胞活力。
49.实施例2
50.为了测量msc随着时间的推移产生的免疫调节细胞因子，将来自实施例1的10000个msc接种到96孔板每孔的培养基中，并允许其粘附过夜。第二天，用新鲜培养基替换培养基，用媒介(pbs，gibco)或10pg/ml重组人tnf-α(r&d systems)刺激细胞指定的时间量。收
集上清液，并通过msd电化学发光免疫测定分析其抗炎细胞因子的产生。
51.图3显示在不同时间点暴露于10pg/ml tnf-α后msc的抗炎细胞因子产生。数据显示为3个单独批次msc的代表性实验的平均倍数变化
±
sd。细胞在24小时内持续产生il-1ra、il-4、il-7、il-8、il-10和il-13。
52.实施例3
53.为了测量msc响应il-17a产生免疫调节细胞因子，将10000个lmscs接种到96孔板每孔的培养基中，并允许其粘附过夜。第二天，用新鲜培养基替换培养基，用媒介(pbs，gibco)或1pg/ml重组人tnf-α(r&d systems)刺激细胞1小时，然后添加所示浓度的il-17a维持24小时。收集上清液并分析其抗炎细胞因子的产生。
54.图4描绘了暴露于仅il-17a或il-17a和tnf-α后抗炎细胞因子il-8和il-13的产生。当仅用il-17a刺激时，细胞显示无il-8和il-13产生或产生极少(图4a)，但当暴露于il-17a和tnf-α时，il-8与il-13的产生以剂量依赖性响应il-17a的方式显著增加，表明tnf-α使msc对il-17a敏感。在检查il-13产生的过程中也发现这些结果(图4b)。
55.本公开的范围不受本文所述具体实施方案的限制。事实上，除了所描述的那些之外，根据上述描述，本文提供的主题的各种修改对于本领域技术人员来说会变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
56.本文引用了各种出版物、专利和专利申请，其公开内容通过引用整体并入。