NK细胞诱导培养基及其培养方法与流程

技术特征：
1.一种nk细胞诱导培养基，其特征在于，该诱导培养基中包含581培养基及浓度0.1~10ug/ml 的氟达拉滨。2.根据权利要求1所述的nk细胞诱导培养基，其特征在于，该诱导培养基中包含浓度1~5ug/ml 的氟达拉滨。3.根据权利要求1或2所述的nk细胞诱导培养基，其特征在于，该诱导培养基中包含浓度2ug/ml 的氟达拉滨。4.一种nk细胞快速扩增的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：第0天：首先，往培养瓶a和培养瓶b中分别接种1
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107~6
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107个/ml的单个核细胞；其次，培养瓶a加入10~40ml诱导培养基，所述诱导培养基中包含浓度0.1~10ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；随后，培养瓶b加入激活培养基和10~20v/v%的自体灭活血浆体积为10~40ml，所述激活培养基中包含浓度10~50ng/ml 的il-15、浓度10~50ng/ml的il-18、浓度500~2000u/ml的il-2及581培养基；最后，将培养瓶a和b分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%co2的培养箱中，进行细胞培养；第3天、第5天和第7天：分别往培养瓶a中补液诱导培养基并控制培养瓶中总体积为80~600ml；第9天：收集培养瓶a中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心分离后除去诱导培养基，将培养瓶a中收集的细胞加入到培养瓶b中，并往培养瓶b中加入激活培养基和10~20v/v%的自体灭活血浆体积为100~500ml；其中，所述激活培养基中包含浓度10~50ng/ml 的il-15、浓度10~50ng/ml的il-18、浓度500~2000u/ml的il-2及581培养基；第11天：往培养瓶中加入600~1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度500~2000u/ml的il-2，浓度5~20ng/ml的il-21及581培养基；第13天：往培养瓶中加入800~1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度500~2000u/ml的il-2，浓度5~20ng/ml的il-21及581培养基；第16天：停止细胞培养，收集培养瓶b中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的nk细胞。5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：第0天：首先，往培养瓶a和培养瓶b中分别接种5
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107个/ml的单个核细胞；其次，培养瓶a加入15~35ml诱导培养基，所述诱导培养基中包含浓度1~5ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；随后，培养瓶b加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为15~35ml，所述激活培养基中包含浓度15~30ng/ml 的il-15、浓度15~30ng/ml的il-18、浓度800~1500u/ml的il-2及581培养基；最后，将培养瓶a和b分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%co2的培养箱中，进行细胞培养；第3天、第5天和第7天：分别往培养瓶a分别往培养瓶a中补液诱导培养基并控制培养瓶中总体积为100~550ml；第9天：收集培养瓶a中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心分离后除去诱导培养基，将培养瓶a中收集的细胞加入到培养瓶b中，并往培养瓶b中加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为200~400ml；其中，所述激活培养基中包含浓度15~30ng/ml 的il-15、浓度15~30ng/ml的il-18、浓度800~1500u/ml的il-2及581培养基；第11天：往培养瓶中加入700~1000ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度800~
1500u/ml的il-2，浓度8~15ng/ml的il-21及581培养基；第13天：往培养瓶中加入900~1100ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度800~1500u的il-2，浓度8~15ng/ml的il-21及581培养基；第16天：停止细胞培养，收集培养瓶b中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的nk细胞。6.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，第0天细胞培养中，培养瓶a中加入25ml诱导培养基；培养瓶b中加入激活培养基和自体灭活血浆体积为25ml。7.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，第3天细胞培养中，培养瓶a中补液诱导培养基后控制培养瓶a中总体积为150ml；第5天细胞培养中，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为200ml；第7天细胞培养中，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为500ml。8.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，第9天细胞培养中，收集培养瓶a中的细胞加入到培养瓶b中，培养瓶b中加入激活培养基和自体灭活血浆体积为300ml。9.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，第11天细胞培养中，加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为2000ml。10.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，第13天细胞培养中，加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为3000ml。

技术总结
本发明公开了一种NK细胞诱导培养基及其培养方法，该诱导培养基中包含581培养基及浓度0.1~10ug/ml的氟达拉滨；NK培养中，采用培养瓶A和B分别接种单个核细胞培养，第0天至第7天，培养瓶A中培养基添加含组分氟达拉滨及581培养基的诱导培养基，培养瓶B中添加含10~20v/v%的自体灭活血浆、IL-15、IL-18、IL-2及581培养基的激活培养基；第9天，将培养瓶A离心收集的细胞转移至培养瓶B中，继续培养至第16天，且每隔2天补加激活培养基，停止培养，收集离心处理沉淀物，获得高纯度的NK细胞。本发明诱导培养基的成分氟达拉滨可以诱导NK细胞快速扩增，16天培养周期，NK细胞数量可扩增2000~4000倍。NK细胞数量可扩增2000~4000倍。NK细胞数量可扩增2000~4000倍。


技术研发人员：薛卫巍 谢海涛 钟家炜 谢炜豪
受保护的技术使用者：广东先康达细胞库有限公司
技术研发日：2022.12.02
技术公布日：2022/12/30