羧基化细菌纳米纤维素的制备与应用的制作方法

1.本发明属于高分子材料技术领域，涉及细菌纤维素的化学修饰，具体涉及不同尺寸羧基化细菌纳米纤维素的制备方法，及其作为药物载体的应用。


背景技术：

2.细菌纤维素（bacterial cellulose，bc）是细菌发酵合成的，由β-1,4-糖苷键连接而成的一类具有超精细网状纳米结构的高分子聚合物。与其他纤维素相比，bc不含半纤维素、木质素和其他细胞壁成分，具有更高的化学纯度和纤维素结晶度。此外，bc还具有极强的吸水性能和透水透气性能、优良的生物相容性和可天然降解特性、较强的抗撕拉能力、较高的机械强度和杨氏模量。
3.细菌纳米纤维素（bacterial nanocellulose，bncs）是将细菌纤维素通过物理、化学或生物的方法处理得到的一类纳米级纤维素。bncs的宽度一般在2-60nm，长度一般在30-700nm范围内。bncs不仅具有bc的基本结构和性能，同时还具有极高的比表面积（10-70），较高的轴向刚度（105-168gpa）、杨氏模量（20-50gpa）和拉伸强度（约9gpa），较低的热膨胀系数（约0.1ppm/k），较高的热稳定性（约260℃）和较低的密度（1.5-1.6g/cm3），并具有剪切稀化流变学和溶致液晶特性。bncs在环保、造纸、纺织、生物复合材料、医药、电子液晶显示等诸多领域具有极大的应用价值和前景。
4.羧基化细菌纳米纤维素（bncs-cooh）是一种具有广泛应用前景的纳米材料。但目前有关羧基化细菌纳米纤维素的研究相对较少，并且没有应用于工业化的相关报道。如果将细菌纤维素制备为羧基化细菌纳米纤维丝，可以将羧基化细菌纳米纤维素作为一种药物载体对药物或蛋白进行递送。纳米材料的尺寸在很大程度上影响着细菌纳米纤维素对生物屏障的穿透性能，为提高细菌纳米纤维素的载药效率，需要对细菌纳米纤维素的尺寸进行优化。


技术实现要素：

5.针对现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种不同尺寸的羧基化细菌纳米纤维素，并提供了羧基化细菌纳米纤维素的制备方法及其应用。进一步地，本发明还提供了不同尺寸的羧基化细菌纳米纤维素孵育斑马鱼胚胎细胞的留存效果检测试验。本发明所述羧基化细菌纳米纤维素对生物屏障（细胞）具有良好的穿透性能，可以作为药物载体的供选天然高分子材料。
6.本发明所述羧基化细菌纳米纤维素的制备方法，其包括，向浸泡有细菌纤维素的水体中加入2,2,6,6-四甲基哌啶氮-氧-化物（tempo）、无机次氯酸盐溶液、无机溴化物，控制反应ph在10-11范围内，终止反应后得到羧基化细菌纤维素；将羧基化细菌纤维素置入硫酸溶液中，控制反应时长制备得到不同尺寸的羧基化细菌纳米纤维素。
7.作为所述羧基化细菌纳米纤维素制备方法的优选实施方式之一，所述细菌纤维素与2,2,6,6-四甲基哌啶氮-氧-化物的质量比为1:（0.04-0.1）。具体地，向浸泡有1克细菌纤
维素的蒸馏水中，加入40-100毫克的2,2,6,6-四甲基哌啶氮-氧-化物。
8.本发明对所述无机次氯酸盐的选用没有特别的限定，在具体的实施例中，无机次氯酸盐可以选用次氯酸钠、次氯酸钾、次氯酸锂中的一种，或者是与所述无机次氯酸盐具有等同功能或技术效果的其他次氯酸盐。优选地，所述无机次氯酸盐为次氯酸钠。具体地，本发明将次氯酸钠配制成溶液使用，所述次氯酸钠溶液的质量浓度为5%，添加量为10～20毫升。
9.本发明对所述无机溴化物的选用没有特别的限定，在具体的实施例中，无机溴化物可以选用溴化钠、溴化钾、溴化锂中的一种，或者是与所述无机溴化物具有等同功能或技术效果的其他无机溴化物。优选地，所述无机溴化物为溴化钾。具体地，本发明中溴化钾投加量为40～100毫克。
10.本发明对控制反应ph的物质的选用没有特别的限定，在具体的实施例中，控制反应ph的物质可以选用氢氧化钠、氢氧化钾中的一种，或者是与所述碱性物质具有等同功能或技术效果的其他碱性物质。优选地，所述碱性物质为氢氧化钠。具体地，本发明中使用氢氧化钠控制反应ph在10～11之间。
11.本发明制备羧基化细菌纤维素过程的反应时长为反应24～48小时，终止反应所用试剂为无水乙醇。具体地，本发明中无水乙醇投加量为5ml。
12.本发明所述硫酸溶液的质量浓度范围为50%-70%，所述羧基化细菌纤维素在硫酸溶液中的反应条件为：温度50℃，搅拌速度500-3000rpm，反应时长60-120min。优选地，所述硫酸溶液的质量浓度为70%。具体地，本发明中，每克所述羧基化细菌纤维素浸入12.5ml质量浓度为70%的硫酸溶液，反应温度为50℃，反应时长为120min。
13.所述羧基化细菌纤维素和硫酸溶液的反应液投加到4℃蒸馏水中终止反应，7000-15000rmp条件下离心10-20min，离心后上清液装入透析袋中，使用蒸馏水处理至中性；将透析袋中的中性透析液冷冻干燥或喷雾干燥，得到不同尺寸的羧基化细菌纳米纤维素。
14.本发明还提供了不同尺寸的羧基化细菌纳米纤维素孵育斑马鱼胚胎细胞的留存效果检测试验。检测结果表明，本发明所提供的纳米尺寸小且均匀的细菌纳米纤维素对细胞有更强的穿透性能。
15.基于上述制备过程及检测结果，本发明还请求保护采用上述制备方法制备得到的羧基化细菌纳米纤维素及其在药物载体方面的用途。
16.与现有技术相比，本发明所述羧基化细菌纳米纤维素的制备与应用的技术效果表现为：通过羧基化细菌纤维素在不同浓度的硫酸溶液中反应不同时长制备得到不同尺寸的羧基化细菌纳米纤维素，制备方法简单，反应条件易于控制。制备得到的羧基化细菌纳米纤维素具有较小且均匀的尺寸，可以作为一种药物载体对药物或蛋白进行递送，具有优良的对生物屏障的穿透性能和较高的载药效率，是一种具有广泛应用前景的纳米材料。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将本发明实施例中所涉及附图做简单的说明，显而易见地，所列出的附图仅仅是本发明实施例的一部分内容的呈现。
18.图1是羧基化细菌纳米纤维素在水中的分散图片。其中，左图为100mg/l的羧基化
细菌纳米纤维素的悬液，右图为蒸馏水。
19.图2是羧基化细菌纳米纤维素和细菌纳米纤维素的红外光谱图。
20.图3是不同尺寸羧基化细菌纳米纤维素的原子力显微镜图比较。其中，图3中的a为在硫酸浓度65%，反应时长60min时，制备得到的羧基化细菌纳米纤维素；图3中的b为在硫酸浓度70%，反应时长为120min时，制备得到的羧基化细菌纳米纤维素。
21.图4是不同尺寸范围的羧基化细菌纳米纤维素的分布，横坐标为羧基化细菌纳米纤维素的尺寸范围，纵坐标为该尺寸范围的羧基化细菌纳米纤维素所占的比例。其中，图4中的a为在硫酸浓度65%、反应时长60min时羧基化细菌纳米纤维素尺寸分布的统计；图4中的b为在硫酸浓度70%、反应时长120min时羧基化细菌纳米纤维素尺寸分布的统计。
22.图5是流式细胞仪检测斑马鱼细胞内羧基化细菌纳米纤维素的数量。其中，图5中的a为300nm尺寸的荧光标记的羧基化细菌纳米纤维素，以不同浓度处理30min后进入细胞的数量；图5中的b为不同平均尺寸的羧基化细菌纳米纤维素以30mg/l的浓度处理30min后进入细胞内的数量；图5中的c指300nm尺寸的羧基化细菌纳米纤维以15mg/l的浓度对细胞进行不同时间长度的孵育后进入细胞的数量。
具体实施方式
23.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。
24.实施例1本实施例涉及一种以细菌纤维素为原料的羧基化细菌纳米纤维素的制备，具体步骤如下：1）使用本实验室保种的木醋杆菌（a.xylinum subsp. sucrofermentans bpr2001）加入到培养基中（葡萄糖1.5%，蔗糖4.5%，玉米浆2.6%，kh2po
4 0.35%，（nh4）2so
4 0.125%，ph 5.0），在30℃恒温条件下静态发酵获得发酵液表面自动聚集形成的细菌纤维素膜，然后用去离子水浸泡、洗涤细菌纤维素膜，去除其上的杂质备用；2）取步骤1）所得细菌纤维素1克浸入10毫升1mol/l的氢氧化钠溶液中，二者重量（g）/体积（ml）比为1:1-12，优选的是，细菌纤维素与氢氧化钠的重量（g）/体积（ml）比为1：10；3）将步骤2）的混合物在加热（50-70℃）条件下处理至少20分钟，洗涤细菌纤维素膜表面的杂质；4）将步骤3）处理的细菌纤维素经去离子水洗涤或抽滤清洗或离心清洗或透析去除多余碱性溶液残余，优选的是，用去离子水洗涤次数为2-5次，每次用水量为每克细菌纤维素1500毫升；5）将1克细菌纤维素浸入70毫升蒸馏水中，向蒸馏水中添加40-100毫克的2,2,6,6-四甲基哌啶氮-氧-化物，10-20毫升5%浓度的次氯酸钠溶液，40-100毫克溴化钾，使用氢氧化钠控制反应ph在10-11之间，反应24-48小时；加入5ml无水乙醇终止反应，并用蒸馏水反复清洗，制备得到羧基化细菌纤维素；6）准备1克的羧基化细菌纤维素，浸入12.5毫升质量浓度为65%的硫酸溶液中，油
浴锅温度控制在50℃，磁力搅拌速度500-3000rpm，控制反应时长60分钟；7）将反应液投加到提前预冷的4℃蒸馏水中终止反应，将混合液在7000-15000rmp条件下离心10-20分钟除去大颗粒，离心后上清装入超滤膜透析袋中（透析袋分子截流量为3500da或6000-8000da或12000-14000da或25000da或30000da或100-300kda），使用蒸馏水处理至中性；8）将所述透析袋中的透析液干燥后即得到所述羧基化细菌纳米纤维素粉末。
25.如图1所示，羧基化细菌纳米纤维素在水中呈现出良好的分散性。
26.如图2所示，傅里叶红外变换光谱仪的检测结果显示，bncs的光谱在3200-3700cm-1
处会有一个羟基伸缩的振动特征峰。对于bnc，其c
1-o-c4、c
2-o、c
3-o和c
6-o的振动峰于谱图上分别对应的峰会出现在1157、1107、1056和1026cm-1
处，但是，氧化后的bncs位于1026cm-1
的峰会因为羧基的出现而消失。同时在1610cm-1
处将出现一个c=o的伸缩振动的特征峰。表明羧基化细菌纳米纤维素制备成功。
27.实施例2本实施例涉及一种不同尺寸的羧基化细菌纳米纤维素的制备优化工艺，具体步骤如下：1）取若干份实施例1中步骤5）制得羧基化细菌纤维素1克分别浸入12.5毫升质量浓度为65%、70%的硫酸溶液中，油浴锅温度控制在50℃，磁力搅拌速度500-3000rpm，控制反应时长分别为60、120分钟；2）将反应液投加到提前预冷的4℃蒸馏水中终止反应，将混合液在7000-15000rmp条件下离心10-20分钟除去大颗粒，离心后上清装入超滤膜透析袋中（透析袋分子截流量为3500da或6000-8000da或12000-14000da或25000da或30000da或100-300kda），使用蒸馏水处理至中性；3）将所述透析袋中的透析液冷冻干燥或喷雾干燥后即得到所述不同尺寸的羧基化细菌纳米纤维素粉末，优选的是，为达到最佳细菌纤维素纳米晶体的溶解性，最佳干燥方法为冷冻干燥；细菌纳米纤维素溶解时需经超声处理助溶。
28.图3为不同尺寸羧基化细菌纳米纤维素的原子力显微镜图比较。其中，图3中的a为在硫酸浓度65%、反应时长60min时，制备得到的羧基化细菌纳米纤维素；图3中的b为在硫酸浓度70%、反应时长为120min时，制备得到的羧基化细菌纳米纤维素。相比于b，a中的纳米纤维尺寸分布不均一，且平均尺寸要大于b中的纳米纤维尺寸。因此，当硫酸浓度为70%、反应时长为120min时，制备得到的羧基化细菌纳米纤维素质量更高。
29.图4是不同尺寸范围的羧基化细菌纳米纤维素的分布。其中，图4中的a是在硫酸浓度65%、反应时长60min时羧基化细菌纳米纤维素尺寸分布的统计；图4中的b是在硫酸浓度70%、反应时长120min时羧基化细菌纳米纤维素尺寸分布的统计。由图可知，溶液浓度70%的硫酸反应时长120min时可以使纳米纤维的平均尺寸更均一，同时也更小。
30.实施例3本实施例涉及一种羧基化细菌纳米纤维素孵育斑马鱼胚胎细胞的留存效果，具体步骤如下：1）将实施例2制备得到不同尺寸的羧基化细菌纳米纤维素进行荧光标记，取羧基化细菌纳米纤维素1克，投入到1mol/l的氢氧化钠溶液中，滴加6毫摩尔的环氧氯丙烷，60℃
下反应2h。待反应结束后，将反应液倒入到透析袋中使用蒸馏水进行透析，待透析袋中溶液ph接近12时终止透析。使用质量体积比为50%的氢氧化钠溶液调节ph到12，加入5毫升一水合氨，60℃下反应2h，使用透析袋透析至袋中液体ph到7时终止。
31.2）配置50毫升浓度为0.05mol/l、ph 7.4-9.0的硼酸缓冲液，按1：30：60的物质的量比例添加乙二醇四乙酸、氯化钠、蔗糖。向硼酸缓冲液中投加1克步骤1）制得的活化的羧基化细菌纳米纤维素以及0.32毫摩尔的异硫氰酸罗丹明b。避光搅拌12h，反应结束后对反应液进行透析，使用蒸馏水避光透析5天，每隔6h换一次透析液，以保证未反应的异硫氰酸罗丹明b被完全透析。并对透析袋中连接了异硫氰酸罗丹明的羧基化细菌纳米纤维素进行冷冻干燥，得到实验所需的荧光标记的粉末状羧基化细菌纳米纤维素。
32.3）将荧光标记的不同尺寸羧基化细菌纳米纤维素配置成浓度为30mg/l的溶液，对斑马鱼胚胎细胞进行孵育；设置对羧基化细菌纳米纤维素的平均尺寸、浓度以及对斑马鱼胚胎细胞的孵育时长分别进行单因素对比试验，孵育后用流式细胞仪检测细胞内羧基化细菌纳米纤维素的数量，结果见图5。
33.图5为实施例流式细胞仪检测斑马鱼胚胎细胞内羧基化细菌纳米纤维素的数量。其中，图5中的a为300nm尺寸的荧光标记的羧基化细菌纳米纤维素，以不同浓度处理30min后进入细胞的数量；图5中的b为不同平均尺寸的羧基化细菌纳米纤维素以30mg/l的浓度处理30min后进入细胞内的数量；图5中的c指300nm尺寸的羧基化细菌纳米纤维以15mg/l的浓度对细胞进行不同时间长度的孵育后进入细胞的数量。如图5所示，流式细胞术结果表明，纳米尺寸小的细菌纳米纤维素对细胞有更强的穿透性能。
34.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。