具有肝癌细胞毒性和
α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽及制备方法
技术领域
1.本发明属于生物制品的提取制备技术领域，涉及具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽（trp-ala-val-leu-leu环肽）提取和纯化。
背景技术：
2.环色-丙-缬-亮-亮肽是从一种蛙粪霉(basidiobolussp. )培养物中分离制备得到的具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的生物活性物质。
3.蛙粪霉(basidiobolussp. )为虫霉目蛙粪霉科蛙粪霉属的真菌；在我国常见的有蛙生蛙粪霉、固孢蛙粪霉和裂孢蛙粪霉等。上述菌种可从土壤和两栖类动物粪便中分离得到。
4.细胞毒性：目前，癌症在中国患发率持续增长，已成为不可忽视的公共卫生挑战。据公开数据统计，2020年全国新发肿瘤病例和死亡人数均名列全球第一，肿瘤预防与治疗道阻且。在癌症的治疗过程中，相当重要的一个环节就是药物治疗，使用有效的抗癌药物，可以帮助患病的人获得更长的生存时间。通过细胞毒性实验可以评估药物的有效性、毒性、耐药性、药物对癌细胞凋亡、增殖等作用的影响，对新的抗癌药物的研发具有重要价值。
5.α-葡萄糖苷酶抑制活性：2型糖尿病(t2dm)已成为严重的公共卫生问题，到2030年将影响全球5亿人的生活。t2dm 的特征是碳水化合物、脂质和蛋白质代谢紊乱，这是由胰腺β细胞分泌的胰岛素逐渐减少引起。α-葡萄糖苷酶被确定为治疗 t2dm 和碳水化合物疾病的核心靶。位于肠细胞刷状缘表面膜的α-葡萄糖苷在碳水化合物消化中将双糖或寡糖水解成单糖。因此，抑制α-葡萄糖苷酶活性可以延缓碳水化合物的消化，从而缓解t2dm。α-葡糖苷酶抑制剂在抑制剂与二糖或寡糖之间竞争结合到α-葡萄糖苷酶，从而导致α-葡萄糖苷酶的抑制活性以及碳水化合物水解和葡萄糖吸收的减少。
技术实现要素：
6.本发明的目的是提供具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽及制备方法。
7.为寻找新型天然高效的具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的物质，发明人通过对中国的100余株昆虫病原真菌代谢物进行活性研究，发现了从一种蛙粪霉中提取的环色-丙-缬-亮-亮肽具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的作用。
8.具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的结构式如下：
所述环色-丙-缬-亮-亮肽是由色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和亮氨酸，以酰胺键连接而成的十五元环状五肽；所述环色-丙-缬-亮-亮肽具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性；对肝癌细胞hepg2的半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml，α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg /ml。
9.具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的制备操作步骤如下：（1）菌种培养将蛙粪霉（basidiobolussp.）经过斜面菌种培养、二级液体种子培养、三级液体种子培养和四级培养，得到液体的最终发酵物或固体的最终发酵物；所述蛙粪霉（basidiobolussp.）为蛙生蛙粪霉、固孢蛙粪霉或裂孢蛙粪霉中的一种；（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制用甲醇或乙醇提取最终发酵物中的有效成分，采用反相色谱方法纯化，得到白色粉末状的环色-丙-缬-亮-亮肽。
10.进一步限定的制备技术方案如下：所述步骤（1）的具体操作如下：（1.1）斜面种子培养将蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（pda）斜面培养基，于25～36℃恒温、培养4～8d，得到一级菌种；（1.2）二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；在大于等于100 ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，在恒温振荡培养箱中，温度25～36℃、转速150～250 rpm条件下，培养3～7d，即得到二级菌种；液体摇瓶培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/l、麦芽提取物10.0～30.0 g/l、蛋白胨2.0～6.0 g/l、酵母浸出粉1.0～4.0 g/l、氯化钾（kcl）0.3～2.0 g/l、七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3～2.0 g/l、磷酸二氢钾（kh2po4）0.3～2.0 g/l；（1.3）三级液体种子培养将二级菌种接种到大于等于5l的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2mp、25～36℃条件下，恒温通气培养2～
5天，得到三级菌种；发酵罐中的培养基同步骤（1.2）中的液体培养基；（1.4）四级培养四级培养为液体培养，将三级菌种接种到大于等于50l的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2mp、25～36℃条件下，恒温通气培养5～15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基步骤（1.2）中的液体培养基。
11.所述步骤（1.4）中，四级培养为固体培养，将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的3～10%， 25～36℃恒温培养5～15天，得到固体的最终发酵物；所述固体培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/l、麦芽提取物10.0～30.0 g/l、蛋白胨2.0～6.0 g/l、酵母浸出粉1.0～4.0 g/l、氯化钾（kcl）0.3～2.0 g/l、七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3～2.0 g/l、磷酸二氢钾（kh2po4）0.3～2.0 g/l、琼脂15.0～30.0 g/l和水混合均匀制成。
12.所述步骤（2）的具体操作如下：（2.1）最终发酵物的预处理将液体的最终发酵物经0.20～1.0μm滤膜过滤或2000-12000rpm/min条件下离心得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎，得到过20～120目筛的预处理物；或，将固体的最终发酵物在30～130℃干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎到20～120目的预处理物；（2.2）预处理物中有效成分的提取和分离纯化（2.2.1）提取将预处理物用甲醇或乙醇提取；料液比为1:2～20（w:v）、超声波功率10～100khz，提取时间为10～200分钟；在转速大于等于2000rpm/min条件下离心，或0.20～1.0μm滤膜过滤；取滤液或离心上清，在温度小于等于100℃浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇或乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；（2.2.2）分离纯化采用反相色谱方法纯化，固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即rpc18，颗粒直径为3～50μm；用甲醇和水按20～70：80～30配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为583的色谱流份；将收集物在小于等于100℃温度以下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丙-缬-亮-亮肽。
13.本发明的分析研究说明如下：1、筛选研究发现一种蛙粪霉（basidiobolussp.）菌丝甲醇提取物具有较强的肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性：（1）甲醇提取物对肝癌细胞hepg2的细胞毒性测定：配制提取物浓度为1，10，25，50，100 μg/ml dmso溶液，以鬼臼毒素为阳性对照，使用cck-8法进行抑制细胞毒性试验，于450 nm下测定吸光度，经计算得出提取物对肝癌细胞hepg2半抑制浓度（ic
50
）为：210.32μg/ml；（2）甲醇提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：配制提取物样品浓度为10，100，250，500，1000 μg/ml甲醇溶液，于405nm下测定其对α-葡萄糖苷酶活性，经计算得出提取物对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度（ic
50
）为：1352.89μg/ml。
14.由于甲醇提取物有效成分含量较低，因此需要进行有效成分的进一步提取和纯化。
15.2、用反相色谱的方法对甲醇提取物进行了进一步分离纯化，得到一个纯品，其生物活性如下：（1）环色-丙-缬-亮-亮肽对肝癌细胞hepg2的细胞毒性测定：配制提取物浓度为1，10，25，50，100 μg/ml dmso溶液，以鬼臼毒素为阳性对照，使用cck-8法进行抑制细胞毒性试验，于450 nm下测定吸光度，经计算得出提取物对肝癌细胞hepg2半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml。
16.（2）环色-丙-缬-亮-亮肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：配制提取物样品浓度为10，100，250，500，1000 μg/ml甲醇溶液，于405nm下测定其对α-葡萄糖苷酶活性，经计算得出提取物对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg/ml。
17.3、活性化合物的化学结构鉴定高分辨液质联用分析显示纯化的活性化合物正离子583.3608(m h
)、605.3423(m na
)，计算出的分子式为 c
31h46
n6o5。
18.核磁共振分析数据见下表：
unitcarbonδc,typeδh,(jinhz)unitcarbonδc,typeδh,(jinhz)trp1172.0,c
ꢀꢀ
1729.6,ch1.9,m 256.3,ch4.36,dt(7.2,7.1) 1819.5,ch30.85,d(6.6) 3a27.5,ch22.98,dd(14.9,7.2) 1919.6,ch30.85,d(6.6) 3b 3.04,dd(14.8,7.2) 16-nh 8.42,d(8.3) 4110.0,c leu220171.4,c
ꢀꢀ
5123.8,ch7.15,d(2.2) 2152.2,ch4.19,m nh 10.85,d(2.2) 22a40.8,ch21.34,m 6136.6,c
ꢀꢀ
22b 1.53,m 7111.8,ch7.32,d(7.9) 2325.3,ch1.4,m 8121.4,ch7.06,td(7.1,1.1) 2422.5,ch30.88,d(6.4) 9118.8,ch6.98,td(7.1,1.1) 2523.4,ch30.84,d(6.4) 10118.6,ch7.51,d(7.9) 21-nh 7.98,d(7.0) 11127.6,c leu126171.1,c
ꢀꢀ
2-nh 8.17,d(7.1) 2754.3,ch4.03,dt(9.1,7.1)ala12171.9,c
ꢀꢀ
28a41.1,ch21.33,m 1348.9,ch4.23,m 28b 1.37,m 1418.0,ch31.12,d(6.7) 2924.7,ch1.23,m 13-nh 7.42,d(7.2) 3022.3,ch30.71,d(6.4)val15171.2,c
ꢀꢀ
3123.0,ch30.77,d(6.4) 1661.3,ch3.81,dd(8.2,8.2) 27-nh 8.10,d(9.1)
综合液质联用分析和核磁共振分析得出分离纯化出的活性化合物结构为环色-丙-缬-亮-亮肽，见上述化学结构式。
19.本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：1、本发明方法制备的环色-丙-缬-亮-亮肽具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，开拓了蛙粪霉的一个新的应用领域。本发明首次发现蛙粪霉具有代谢上述活性物质的功能。在此发明基础上可望进一步克隆出相关基因，构建高产量菌株。
20.2、环色-丙-缬-亮-亮肽是一新型骨架，可作为药物先导化合物进行衍生化改造，创造出活性更多更强的化合物。
21.3、本发明的环色-丙-缬-亮-亮肽可能作为治疗肝癌和减肥药的潜在药物。
22.4、本发明由于采取微生物发酵生产，不受环境和资源影响，易实现工业化、自动化，不受环境和自然资源的影响。
23.5、按本发明工艺方法生产的产品成本低，工艺简便、工艺稳定、易调控、成功率高。
具体实施方式
24.下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
25.实施例1：具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的制备操作步骤如下：1.1蛙粪霉菌种选择所用的蛙粪霉为蛙生蛙粪霉；1.2菌株培养培养方法为液体培养，具体工序如下：1.2.1斜面种子培养将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（pda）斜面培养基，于25℃恒温、培养4d，得到一级菌种；1.2.2二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；液体摇瓶培养基：葡萄糖25.0g/l，麦芽提取物10.0g/l，蛋白胨2.0 g/l，酵母浸出粉1.0g/l，氯化钾（kcl）0.3g/l，七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3g/l，磷酸二氢钾（kh2po4）0.3g/l；在100 ml三角瓶中加入30%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1支斜面菌
种，接种后置于恒温振荡培养箱，温度25℃、转速150 rpm，培养3d，即得到二级菌种；1.2.3三级液体种子培养将二级菌种接种到5l的发酵罐，装液量为罐体积的50%，接种量3%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1mp，25℃恒温通气培养2天，得到三级菌种；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。
26.1.2.4四级培养四级培养采用液体培养：将三级菌种接种到50l的发酵罐，装液量为罐体积的50%，接种量3%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1mp，25℃恒温通气培养5天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；1.3最终发酵物中有效成分的提取和精制1.3.1最终发酵物的预处理将液体的最终发酵物经0.20μm滤膜过滤得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎到20目备用。
27.1.3.2 提取将前述干燥菌丝，用甲醇提取；料液比为1:2（w:v）、超声波功率10khz，提取时间为10分钟；提取结束后在转速2000rpm/min条件下离心，离心上清在温度100℃浓缩到原体积的1/2，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制。
28.1.3.3 分离纯化采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即rpc18，颗粒直径为3μm，色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用乙醇或甲醇和水按20～70：80～30配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为583的目标峰；收集物在100℃温度以下浓缩到粘稠状，在170℃条件下干燥；得到白色粉末的环色-丙-缬-亮-亮肽。
29.结构鉴定结果显示环色-丙-缬-亮-亮肽的结构式如下：活性测定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽对对肝癌细胞hepg2的半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml，α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg /ml。
30.实施例2具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的制备操作步骤如下：2.1蛙粪霉菌种选择所用的蛙粪霉为裂孢蛙粪霉；
2.2菌株培养培养方法为液体培养，具体工序如下：2.2.1斜面种子培养将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（pda）斜面培养基，于36℃恒温、培养8d，得到一级菌种；2.2.2二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；液体摇瓶培养基：葡萄糖50.0 g/l，麦芽提取物30.0 g/l，蛋白胨6.0 g/l，酵母浸出粉4.0 g/l，氯化钾（kcl）0.3g/l，七水硫酸镁（mgso4.7h2o） 0.3g/l，磷酸二氢钾（kh2po4）2.0 g/l。
31.在1000 ml三角瓶中加入50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种3支斜面菌种，接种后置于恒温振荡培养箱，温度36℃、转速250 rpm，培养7d，即得到二级菌种。
32.2.2.3三级液体种子培养将二级菌种接种50l的发酵罐，装液量为罐体积的80%，接种量10%，通气量按体积比1:2（v/v），压力0.2mp，36℃恒温通气培养5天，得到三级菌种。
33.发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。
34.2.2.4四级培养四级培养为液体培养：将三级菌种接种到大于等于500l的发酵罐，装液量为罐体积的80%，接种量10%，通气量按体积比1:2（v/v），压力0.2mp，36℃恒温通气培养15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。
35.2.3最终发酵物中有效成分的提取和精制2.3.1最终发酵物的预处理将液体的最终发酵物经1.0μm滤膜过滤得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎到120目备用。
36.2.3.2提取将前述干燥菌丝用乙醇提取，料液比为1:20（w:v）、超声波功率100khz，提取时间为200分钟；提取结束后在转速12000rpm/min条件下离心，离心上清在温度40℃浓缩到原体积的1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制。
37.2.3.3分离纯化采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即rpc18，颗粒直径为50μm，色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用甲醇和水按20～70：80～30配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为583的目标峰；收集物在30℃温度以下浓缩到粘稠状，在-30℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丙-缬-亮-亮肽。
38.结构鉴定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽的结构式如下：
活性测定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽对肝癌细胞hepg2的半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml，α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg /ml。
39.实施例3：具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的制备操作步骤如下：3.1蛙粪霉菌种选择所选用的菌种为固孢蛙粪霉；3.2菌株培养培养方法为液固混合培养，具体工序如下：3.2.1斜面种子培养将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（pda）斜面培养基，于30℃恒温、培养6d，得到一级菌种；3.2.2二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；液体摇瓶培养基：葡萄糖35.0 g/l，麦芽提取物20.0 g/l，蛋白胨4.0 g/l，酵母浸出粉2.0 g/l，氯化钾（kcl）0.3g/l，七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3g/l，磷酸二氢钾（kh2po4）1.0 g/l。
40.在500 ml三角瓶中加入40%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种2支斜面菌种，接种后置于恒温振荡培养箱，温度30℃、转速200 rpm，培养5d，即得到二级菌种。
41.3.2.3三级液体种子培养将二级菌种接种到50l的发酵罐，装液量为罐体积的60%，接种量6%，通气量按体积比1:1.5（v/v），压力0.15mp，30℃恒温通气培养3天，得到三级菌种。
42.发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。
43.3.2.4四级培养四级培养为固体培养：将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的3%，25℃恒温通气培养10天，得到固体的最终发酵物；所述固体培养基为：葡萄糖25.0 g/l，麦芽提取物10.0 g/l，蛋白胨2.0 g/l，酵母浸出粉1.0 g/l，氯化钾（kcl）0.3g/l，七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3g/l，磷酸二氢钾（kh2po4）0.3 g/l；琼脂15.0 g/l。
44.3.3最终发酵物中有效成分的提取和精制3.3.1最终发酵物的预处理将固体的最终发酵物在30℃干燥到含水率等于20%，然后粉碎到20目备用。
45.3.3.2提取将干燥粉碎的最终发酵物用乙醇提取；料液比为1:2（w:v）、超声波功率10khz，提取时间为10分钟；提取结束后用0.20μm滤膜过滤；滤液在温度30℃浓缩到原体积的1/2，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；3.3.3 分离纯化采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即rpc18，颗粒直径为25μm，色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用甲醇和水按20～70：80～30配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为583的目标峰；收集物在40℃温度以下浓缩到粘稠状，在10℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丙-缬-亮-亮肽。
46.结构鉴定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽的结构式如下：活性测定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽对肝癌细胞hepg2的半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml，α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg /ml。
47.实施例4：具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的制备操作步骤如下：4.1蛙粪霉菌种选择所用的蛙粪霉为蛙生蛙粪霉；4.2菌株培养培养方法为液体固体混合培养，具体工序如下：4.2.1斜面种子培养将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（pda）斜面培养基，于29℃恒温、培养5d，得到一级菌种；4.2.2二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；液体摇瓶培养基：葡萄糖40.0 g/l，麦芽提取物25.0 g/l，蛋白胨3.0 g/l，酵母浸出粉3.0 g/l，氯化钾（kcl）0.3g/l，七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3g/l，磷酸二氢钾（kh2po4）1.2 g/l。
48.在500 ml三角瓶中加入40%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1支斜面菌种，接种后置于恒温振荡培养箱，温度30℃、转速180 rpm，培养4d，即得到二级菌种。
49.4.2.3三级液体种子培养将二级菌种接种到30l的发酵罐，装液量为罐体积的65%，接种量6%，通气量按体积
比1:1.2（v/v），压力0.12mp，32℃恒温通气培养3天，得到三级菌种。
50.发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。
51.4.2.4四级培养四级培养采用固体培养：将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的10%，36℃恒温通气培养8天，得到固体的最终发酵物；固体培养基为：葡萄糖50.0 g/l，麦芽提取物30.0 g/l，蛋白胨6.0 g/l，酵母浸出粉4.0 g/l，氯化钾（kcl）0.3g/l，七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3g/l，磷酸二氢钾（kh2po4）2.0 g/l，琼脂30.0 g/l。
52.4.3最终发酵物中有效成分的提取和精制4.3.1最终发酵物的预处理将固体的最终发酵物在130℃干燥到含水率10%，然后粉碎到120目备用。
53.4.3.2提取将干燥粉碎的最终发酵物用甲醇提取，料液比为1:20（w:v）、超声波功率100khz，提取时间为200分钟；提取结束后在用1.0μm滤膜过滤；滤液在40℃浓缩到原体积的1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；4.3.3 分离纯化采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即rpc18，颗粒直径为10μm，色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用甲醇和水按20～70：80～30配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为583的目标峰；收集物在100℃温度以下浓缩到粘稠状，在170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丙-缬-亮-亮肽。
54.结构鉴定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽的结构式如下：活性测定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽对肝癌细胞hepg2的半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml，α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg /ml。
α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽及制备方法
技术领域
1.本发明属于生物制品的提取制备技术领域，涉及具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽（trp-ala-val-leu-leu环肽）提取和纯化。
背景技术：
2.环色-丙-缬-亮-亮肽是从一种蛙粪霉(basidiobolussp. )培养物中分离制备得到的具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的生物活性物质。
3.蛙粪霉(basidiobolussp. )为虫霉目蛙粪霉科蛙粪霉属的真菌；在我国常见的有蛙生蛙粪霉、固孢蛙粪霉和裂孢蛙粪霉等。上述菌种可从土壤和两栖类动物粪便中分离得到。
4.细胞毒性：目前，癌症在中国患发率持续增长，已成为不可忽视的公共卫生挑战。据公开数据统计，2020年全国新发肿瘤病例和死亡人数均名列全球第一，肿瘤预防与治疗道阻且。在癌症的治疗过程中，相当重要的一个环节就是药物治疗，使用有效的抗癌药物，可以帮助患病的人获得更长的生存时间。通过细胞毒性实验可以评估药物的有效性、毒性、耐药性、药物对癌细胞凋亡、增殖等作用的影响，对新的抗癌药物的研发具有重要价值。
5.α-葡萄糖苷酶抑制活性：2型糖尿病(t2dm)已成为严重的公共卫生问题，到2030年将影响全球5亿人的生活。t2dm 的特征是碳水化合物、脂质和蛋白质代谢紊乱，这是由胰腺β细胞分泌的胰岛素逐渐减少引起。α-葡萄糖苷酶被确定为治疗 t2dm 和碳水化合物疾病的核心靶。位于肠细胞刷状缘表面膜的α-葡萄糖苷在碳水化合物消化中将双糖或寡糖水解成单糖。因此，抑制α-葡萄糖苷酶活性可以延缓碳水化合物的消化，从而缓解t2dm。α-葡糖苷酶抑制剂在抑制剂与二糖或寡糖之间竞争结合到α-葡萄糖苷酶，从而导致α-葡萄糖苷酶的抑制活性以及碳水化合物水解和葡萄糖吸收的减少。
技术实现要素：
6.本发明的目的是提供具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽及制备方法。
7.为寻找新型天然高效的具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的物质，发明人通过对中国的100余株昆虫病原真菌代谢物进行活性研究，发现了从一种蛙粪霉中提取的环色-丙-缬-亮-亮肽具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的作用。
8.具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的结构式如下：
所述环色-丙-缬-亮-亮肽是由色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和亮氨酸，以酰胺键连接而成的十五元环状五肽；所述环色-丙-缬-亮-亮肽具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性；对肝癌细胞hepg2的半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml，α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg /ml。
9.具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的制备操作步骤如下：（1）菌种培养将蛙粪霉（basidiobolussp.）经过斜面菌种培养、二级液体种子培养、三级液体种子培养和四级培养，得到液体的最终发酵物或固体的最终发酵物；所述蛙粪霉（basidiobolussp.）为蛙生蛙粪霉、固孢蛙粪霉或裂孢蛙粪霉中的一种；（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制用甲醇或乙醇提取最终发酵物中的有效成分，采用反相色谱方法纯化，得到白色粉末状的环色-丙-缬-亮-亮肽。
10.进一步限定的制备技术方案如下：所述步骤（1）的具体操作如下：（1.1）斜面种子培养将蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（pda）斜面培养基，于25～36℃恒温、培养4～8d，得到一级菌种；（1.2）二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；在大于等于100 ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，在恒温振荡培养箱中，温度25～36℃、转速150～250 rpm条件下，培养3～7d，即得到二级菌种；液体摇瓶培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/l、麦芽提取物10.0～30.0 g/l、蛋白胨2.0～6.0 g/l、酵母浸出粉1.0～4.0 g/l、氯化钾（kcl）0.3～2.0 g/l、七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3～2.0 g/l、磷酸二氢钾（kh2po4）0.3～2.0 g/l；（1.3）三级液体种子培养将二级菌种接种到大于等于5l的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2mp、25～36℃条件下，恒温通气培养2～
5天，得到三级菌种；发酵罐中的培养基同步骤（1.2）中的液体培养基；（1.4）四级培养四级培养为液体培养，将三级菌种接种到大于等于50l的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2mp、25～36℃条件下，恒温通气培养5～15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基步骤（1.2）中的液体培养基。
11.所述步骤（1.4）中，四级培养为固体培养，将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的3～10%， 25～36℃恒温培养5～15天，得到固体的最终发酵物；所述固体培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/l、麦芽提取物10.0～30.0 g/l、蛋白胨2.0～6.0 g/l、酵母浸出粉1.0～4.0 g/l、氯化钾（kcl）0.3～2.0 g/l、七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3～2.0 g/l、磷酸二氢钾（kh2po4）0.3～2.0 g/l、琼脂15.0～30.0 g/l和水混合均匀制成。
12.所述步骤（2）的具体操作如下：（2.1）最终发酵物的预处理将液体的最终发酵物经0.20～1.0μm滤膜过滤或2000-12000rpm/min条件下离心得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎，得到过20～120目筛的预处理物；或，将固体的最终发酵物在30～130℃干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎到20～120目的预处理物；（2.2）预处理物中有效成分的提取和分离纯化（2.2.1）提取将预处理物用甲醇或乙醇提取；料液比为1:2～20（w:v）、超声波功率10～100khz，提取时间为10～200分钟；在转速大于等于2000rpm/min条件下离心，或0.20～1.0μm滤膜过滤；取滤液或离心上清，在温度小于等于100℃浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇或乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；（2.2.2）分离纯化采用反相色谱方法纯化，固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即rpc18，颗粒直径为3～50μm；用甲醇和水按20～70：80～30配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为583的色谱流份；将收集物在小于等于100℃温度以下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丙-缬-亮-亮肽。
13.本发明的分析研究说明如下：1、筛选研究发现一种蛙粪霉（basidiobolussp.）菌丝甲醇提取物具有较强的肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性：（1）甲醇提取物对肝癌细胞hepg2的细胞毒性测定：配制提取物浓度为1，10，25，50，100 μg/ml dmso溶液，以鬼臼毒素为阳性对照，使用cck-8法进行抑制细胞毒性试验，于450 nm下测定吸光度，经计算得出提取物对肝癌细胞hepg2半抑制浓度（ic
50
）为：210.32μg/ml；（2）甲醇提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：配制提取物样品浓度为10，100，250，500，1000 μg/ml甲醇溶液，于405nm下测定其对α-葡萄糖苷酶活性，经计算得出提取物对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度（ic
50
）为：1352.89μg/ml。
14.由于甲醇提取物有效成分含量较低，因此需要进行有效成分的进一步提取和纯化。
15.2、用反相色谱的方法对甲醇提取物进行了进一步分离纯化，得到一个纯品，其生物活性如下：（1）环色-丙-缬-亮-亮肽对肝癌细胞hepg2的细胞毒性测定：配制提取物浓度为1，10，25，50，100 μg/ml dmso溶液，以鬼臼毒素为阳性对照，使用cck-8法进行抑制细胞毒性试验，于450 nm下测定吸光度，经计算得出提取物对肝癌细胞hepg2半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml。
16.（2）环色-丙-缬-亮-亮肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：配制提取物样品浓度为10，100，250，500，1000 μg/ml甲醇溶液，于405nm下测定其对α-葡萄糖苷酶活性，经计算得出提取物对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg/ml。
17.3、活性化合物的化学结构鉴定高分辨液质联用分析显示纯化的活性化合物正离子583.3608(m h
)、605.3423(m na
)，计算出的分子式为 c
31h46
n6o5。
18.核磁共振分析数据见下表：
unitcarbonδc,typeδh,(jinhz)unitcarbonδc,typeδh,(jinhz)trp1172.0,c
ꢀꢀ
1729.6,ch1.9,m 256.3,ch4.36,dt(7.2,7.1) 1819.5,ch30.85,d(6.6) 3a27.5,ch22.98,dd(14.9,7.2) 1919.6,ch30.85,d(6.6) 3b 3.04,dd(14.8,7.2) 16-nh 8.42,d(8.3) 4110.0,c leu220171.4,c
ꢀꢀ
5123.8,ch7.15,d(2.2) 2152.2,ch4.19,m nh 10.85,d(2.2) 22a40.8,ch21.34,m 6136.6,c
ꢀꢀ
22b 1.53,m 7111.8,ch7.32,d(7.9) 2325.3,ch1.4,m 8121.4,ch7.06,td(7.1,1.1) 2422.5,ch30.88,d(6.4) 9118.8,ch6.98,td(7.1,1.1) 2523.4,ch30.84,d(6.4) 10118.6,ch7.51,d(7.9) 21-nh 7.98,d(7.0) 11127.6,c leu126171.1,c
ꢀꢀ
2-nh 8.17,d(7.1) 2754.3,ch4.03,dt(9.1,7.1)ala12171.9,c
ꢀꢀ
28a41.1,ch21.33,m 1348.9,ch4.23,m 28b 1.37,m 1418.0,ch31.12,d(6.7) 2924.7,ch1.23,m 13-nh 7.42,d(7.2) 3022.3,ch30.71,d(6.4)val15171.2,c
ꢀꢀ
3123.0,ch30.77,d(6.4) 1661.3,ch3.81,dd(8.2,8.2) 27-nh 8.10,d(9.1)
综合液质联用分析和核磁共振分析得出分离纯化出的活性化合物结构为环色-丙-缬-亮-亮肽，见上述化学结构式。
19.本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：1、本发明方法制备的环色-丙-缬-亮-亮肽具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，开拓了蛙粪霉的一个新的应用领域。本发明首次发现蛙粪霉具有代谢上述活性物质的功能。在此发明基础上可望进一步克隆出相关基因，构建高产量菌株。
20.2、环色-丙-缬-亮-亮肽是一新型骨架，可作为药物先导化合物进行衍生化改造，创造出活性更多更强的化合物。
21.3、本发明的环色-丙-缬-亮-亮肽可能作为治疗肝癌和减肥药的潜在药物。
22.4、本发明由于采取微生物发酵生产，不受环境和资源影响，易实现工业化、自动化，不受环境和自然资源的影响。
23.5、按本发明工艺方法生产的产品成本低，工艺简便、工艺稳定、易调控、成功率高。
具体实施方式
24.下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
25.实施例1：具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的制备操作步骤如下：1.1蛙粪霉菌种选择所用的蛙粪霉为蛙生蛙粪霉；1.2菌株培养培养方法为液体培养，具体工序如下：1.2.1斜面种子培养将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（pda）斜面培养基，于25℃恒温、培养4d，得到一级菌种；1.2.2二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；液体摇瓶培养基：葡萄糖25.0g/l，麦芽提取物10.0g/l，蛋白胨2.0 g/l，酵母浸出粉1.0g/l，氯化钾（kcl）0.3g/l，七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3g/l，磷酸二氢钾（kh2po4）0.3g/l；在100 ml三角瓶中加入30%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1支斜面菌
种，接种后置于恒温振荡培养箱，温度25℃、转速150 rpm，培养3d，即得到二级菌种；1.2.3三级液体种子培养将二级菌种接种到5l的发酵罐，装液量为罐体积的50%，接种量3%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1mp，25℃恒温通气培养2天，得到三级菌种；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。
26.1.2.4四级培养四级培养采用液体培养：将三级菌种接种到50l的发酵罐，装液量为罐体积的50%，接种量3%，通气量按体积比1:1（v/v），压力0.1mp，25℃恒温通气培养5天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基；1.3最终发酵物中有效成分的提取和精制1.3.1最终发酵物的预处理将液体的最终发酵物经0.20μm滤膜过滤得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎到20目备用。
27.1.3.2 提取将前述干燥菌丝，用甲醇提取；料液比为1:2（w:v）、超声波功率10khz，提取时间为10分钟；提取结束后在转速2000rpm/min条件下离心，离心上清在温度100℃浓缩到原体积的1/2，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制。
28.1.3.3 分离纯化采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即rpc18，颗粒直径为3μm，色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用乙醇或甲醇和水按20～70：80～30配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为583的目标峰；收集物在100℃温度以下浓缩到粘稠状，在170℃条件下干燥；得到白色粉末的环色-丙-缬-亮-亮肽。
29.结构鉴定结果显示环色-丙-缬-亮-亮肽的结构式如下：活性测定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽对对肝癌细胞hepg2的半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml，α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg /ml。
30.实施例2具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的制备操作步骤如下：2.1蛙粪霉菌种选择所用的蛙粪霉为裂孢蛙粪霉；
2.2菌株培养培养方法为液体培养，具体工序如下：2.2.1斜面种子培养将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（pda）斜面培养基，于36℃恒温、培养8d，得到一级菌种；2.2.2二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；液体摇瓶培养基：葡萄糖50.0 g/l，麦芽提取物30.0 g/l，蛋白胨6.0 g/l，酵母浸出粉4.0 g/l，氯化钾（kcl）0.3g/l，七水硫酸镁（mgso4.7h2o） 0.3g/l，磷酸二氢钾（kh2po4）2.0 g/l。
31.在1000 ml三角瓶中加入50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种3支斜面菌种，接种后置于恒温振荡培养箱，温度36℃、转速250 rpm，培养7d，即得到二级菌种。
32.2.2.3三级液体种子培养将二级菌种接种50l的发酵罐，装液量为罐体积的80%，接种量10%，通气量按体积比1:2（v/v），压力0.2mp，36℃恒温通气培养5天，得到三级菌种。
33.发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。
34.2.2.4四级培养四级培养为液体培养：将三级菌种接种到大于等于500l的发酵罐，装液量为罐体积的80%，接种量10%，通气量按体积比1:2（v/v），压力0.2mp，36℃恒温通气培养15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。
35.2.3最终发酵物中有效成分的提取和精制2.3.1最终发酵物的预处理将液体的最终发酵物经1.0μm滤膜过滤得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎到120目备用。
36.2.3.2提取将前述干燥菌丝用乙醇提取，料液比为1:20（w:v）、超声波功率100khz，提取时间为200分钟；提取结束后在转速12000rpm/min条件下离心，离心上清在温度40℃浓缩到原体积的1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制。
37.2.3.3分离纯化采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即rpc18，颗粒直径为50μm，色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用甲醇和水按20～70：80～30配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为583的目标峰；收集物在30℃温度以下浓缩到粘稠状，在-30℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丙-缬-亮-亮肽。
38.结构鉴定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽的结构式如下：
活性测定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽对肝癌细胞hepg2的半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml，α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg /ml。
39.实施例3：具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的制备操作步骤如下：3.1蛙粪霉菌种选择所选用的菌种为固孢蛙粪霉；3.2菌株培养培养方法为液固混合培养，具体工序如下：3.2.1斜面种子培养将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（pda）斜面培养基，于30℃恒温、培养6d，得到一级菌种；3.2.2二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；液体摇瓶培养基：葡萄糖35.0 g/l，麦芽提取物20.0 g/l，蛋白胨4.0 g/l，酵母浸出粉2.0 g/l，氯化钾（kcl）0.3g/l，七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3g/l，磷酸二氢钾（kh2po4）1.0 g/l。
40.在500 ml三角瓶中加入40%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种2支斜面菌种，接种后置于恒温振荡培养箱，温度30℃、转速200 rpm，培养5d，即得到二级菌种。
41.3.2.3三级液体种子培养将二级菌种接种到50l的发酵罐，装液量为罐体积的60%，接种量6%，通气量按体积比1:1.5（v/v），压力0.15mp，30℃恒温通气培养3天，得到三级菌种。
42.发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。
43.3.2.4四级培养四级培养为固体培养：将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的3%，25℃恒温通气培养10天，得到固体的最终发酵物；所述固体培养基为：葡萄糖25.0 g/l，麦芽提取物10.0 g/l，蛋白胨2.0 g/l，酵母浸出粉1.0 g/l，氯化钾（kcl）0.3g/l，七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3g/l，磷酸二氢钾（kh2po4）0.3 g/l；琼脂15.0 g/l。
44.3.3最终发酵物中有效成分的提取和精制3.3.1最终发酵物的预处理将固体的最终发酵物在30℃干燥到含水率等于20%，然后粉碎到20目备用。
45.3.3.2提取将干燥粉碎的最终发酵物用乙醇提取；料液比为1:2（w:v）、超声波功率10khz，提取时间为10分钟；提取结束后用0.20μm滤膜过滤；滤液在温度30℃浓缩到原体积的1/2，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；3.3.3 分离纯化采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即rpc18，颗粒直径为25μm，色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用甲醇和水按20～70：80～30配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为583的目标峰；收集物在40℃温度以下浓缩到粘稠状，在10℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丙-缬-亮-亮肽。
46.结构鉴定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽的结构式如下：活性测定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽对肝癌细胞hepg2的半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml，α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg /ml。
47.实施例4：具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的制备操作步骤如下：4.1蛙粪霉菌种选择所用的蛙粪霉为蛙生蛙粪霉；4.2菌株培养培养方法为液体固体混合培养，具体工序如下：4.2.1斜面种子培养将保藏的蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（pda）斜面培养基，于29℃恒温、培养5d，得到一级菌种；4.2.2二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；液体摇瓶培养基：葡萄糖40.0 g/l，麦芽提取物25.0 g/l，蛋白胨3.0 g/l，酵母浸出粉3.0 g/l，氯化钾（kcl）0.3g/l，七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3g/l，磷酸二氢钾（kh2po4）1.2 g/l。
48.在500 ml三角瓶中加入40%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1支斜面菌种，接种后置于恒温振荡培养箱，温度30℃、转速180 rpm，培养4d，即得到二级菌种。
49.4.2.3三级液体种子培养将二级菌种接种到30l的发酵罐，装液量为罐体积的65%，接种量6%，通气量按体积
比1:1.2（v/v），压力0.12mp，32℃恒温通气培养3天，得到三级菌种。
50.发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基。
51.4.2.4四级培养四级培养采用固体培养：将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的10%，36℃恒温通气培养8天，得到固体的最终发酵物；固体培养基为：葡萄糖50.0 g/l，麦芽提取物30.0 g/l，蛋白胨6.0 g/l，酵母浸出粉4.0 g/l，氯化钾（kcl）0.3g/l，七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3g/l，磷酸二氢钾（kh2po4）2.0 g/l，琼脂30.0 g/l。
52.4.3最终发酵物中有效成分的提取和精制4.3.1最终发酵物的预处理将固体的最终发酵物在130℃干燥到含水率10%，然后粉碎到120目备用。
53.4.3.2提取将干燥粉碎的最终发酵物用甲醇提取，料液比为1:20（w:v）、超声波功率100khz，提取时间为200分钟；提取结束后在用1.0μm滤膜过滤；滤液在40℃浓缩到原体积的1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；4.3.3 分离纯化采用反相色谱方法纯化。固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即rpc18，颗粒直径为10μm，色谱柱直径和流动相流速可视生产规模来定；用甲醇和水按20～70：80～30配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为583的目标峰；收集物在100℃温度以下浓缩到粘稠状，在170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丙-缬-亮-亮肽。
54.结构鉴定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽的结构式如下：活性测定结果显示，环色-丙-缬-亮-亮肽对肝癌细胞hepg2的半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml，α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg /ml。
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