具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽及制备方法

技术特征：
1.具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽，其特征在于：所述环色-丙-缬-亮-亮肽的结构式如下：所述环色-丙-缬-亮-亮肽是由色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和亮氨酸，以酰胺键连接而成的十五元环状五肽；所述环色-丙-缬-亮-亮肽具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性；对肝癌细胞hepg2的半抑制浓度（ic
50
）为：91.15 μg/ml，α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（ic
50
）为：50.09 μg /ml。2.权利要求1所述具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽的制备方法，其特征在于操作步骤如下：（1）菌种培养将蛙粪霉（basidiobolussp.）经过斜面菌种培养、二级液体种子培养、三级液体种子培养和四级培养，得到液体的最终发酵物或固体的最终发酵物；所述蛙粪霉（basidiobolussp.）为蛙生蛙粪霉、固孢蛙粪霉或裂孢蛙粪霉中的一种；（2）最终发酵物中有效成分的提取和精制用甲醇或乙醇提取最终发酵物中的有效成分，采用反相色谱方法纯化，得到白色粉末状的环色-丙-缬-亮-亮肽。3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤（1）的具体操作如下：（1.1）斜面种子培养将蛙粪霉菌株接种于土豆琼脂（pda）斜面培养基，于25～36℃恒温、培养4～8d，得到一级菌种；（1.2）二级液体种子培养将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；在大于等于100 ml三角瓶中加入30～50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，在恒温振荡培养箱中，温度25～36℃、转速150～250 rpm条件下，培养3～7d，即得到二级菌种；液体摇瓶培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/l、麦芽提取物10.0～30.0 g/l、蛋白胨2.0～6.0 g/l、酵母浸出粉1.0～4.0 g/l、氯化钾（kcl）0.3～2.0 g/l、七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3～2.0 g/l、磷酸二氢钾（kh2po4）0.3～2.0 g/l；（1.3）三级液体种子培养将二级菌种接种到大于等于5l的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2mp、25～36℃条件下，恒温通气培养2～5天，得到三级菌种；
发酵罐中的培养基同步骤（1.2）中的液体培养基；（1.4）四级培养四级培养为液体培养，将三级菌种接种到大于等于50l的发酵罐，装液量为罐体积的50～80%，接种量3～10%，在通气量按体积比1:1～2（v/v）、压力0.1～0.2mp、25～36℃条件下，恒温通气培养5～15天，得到液体的最终发酵物；发酵罐中的培养基步骤（1.2）中的液体培养基。4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：所述步骤（1.4）中，四级培养为固体培养，将三级液体菌种拌入固体培养基中，接种量为固体料量的3～10%， 25～36℃恒温培养5～15天，得到固体的最终发酵物；所述固体培养基由葡萄糖25.0～50.0 g/l、麦芽提取物10.0～30.0 g/l、蛋白胨2.0～6.0 g/l、酵母浸出粉1.0～4.0 g/l、氯化钾（kcl）0.3～2.0 g/l、七水硫酸镁（mgso4.7h2o）0.3～2.0 g/l、磷酸二氢钾（kh2po4）0.3～2.0 g/l、琼脂15.0～30.0 g/l和水混合均匀制成。5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤（2）的具体操作如下：（2.1）最终发酵物的预处理将液体的最终发酵物经0.20～1.0μm滤膜过滤或2000-12000rpm/min条件下离心得到菌丝体；将菌丝体冷冻干燥，粉碎，得到过20～120目筛的预处理物；或，将固体的最终发酵物在30～130℃干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎到20～120目的预处理物；（2.2）预处理物中有效成分的提取和分离纯化（2.2.1）提取将预处理物，用甲醇或乙醇提取；料液比为1:2～20（w:v）、超声波功率10～100khz，提取时间为10～200分钟；在转速大于等于2000rpm/min条件下离心，或0.20～1.0μm滤膜过滤；取滤液或离心后上清，在温度小于等于100℃浓缩到原体积的1/2～1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收甲醇或乙醇，浓缩脱醇液用于进一步的色谱法精制；（2.2.2）分离纯化采用反相色谱方法纯化，固定相为键合相填料，所述键合相填料为反相碳十八填料即rpc18，颗粒直径为3～50μm；用甲醇和水按20～70：80～30配比进行梯度洗脱，收集质谱检测器上分子量为583的色谱流份；将收集物在小于等于100℃温度以下浓缩到粘稠状，在低于170℃条件下干燥；得到白色粉末状的环色-丙-缬-亮-亮肽。

技术总结
本发明涉及具有肝癌细胞毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的环色-丙-缬-亮-亮肽（Trp-Ala-Val-Leu-Leu环肽）及制备方法，属于生物制品的提取制备技术领域。所述环色-丙-缬-亮-亮肽是由色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和亮氨酸，以酰胺键连接而成的十五元环状五肽。这是一个新型化合物，尚无文献报道。本发明化合物可通过培养蛙粪霉，然后提取分离得到。环色-丙-缬-亮-亮肽纯品为白色粉末，对肝癌细胞HepG2的半抑制浓度（IC


技术研发人员：胡丰林 赵铖 陆瑞利
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2022.11.24
技术公布日：2022/12/30