快速标记的N-聚糖的液相色谱校准方法与流程

快速标记的n-聚糖的液相色谱校准方法
1.本技术是申请日为2015年11月12日，申请号为202010662332.1的申请的分案申请；该申请号为202010662332.1的申请是以下申请的分案申请：申请日2015年11月12日，申请号201580072776.7，发明名称“快速标记的n-聚糖的液相色谱校准方法”。
2.相关申请的交叉引用
3.无。


背景技术：

4.亲水相互作用色谱(“hilic”)分离与uplc平台的荧光检测联用，可用于拆分复杂的n-连接聚糖群，这是因为其能够在单次色谱运行中分离中性聚糖和带电荷聚糖二者。由于聚糖的异质性、异构化和端基异构性，要阐明复杂的n-联聚糖结构可能是一个重大的分析挑战。葡聚糖梯(dextran ladder)可用于校准对聚糖的亲水相互作用色谱(“hilic”)分离，并将峰保留时间转化成葡萄糖单元(“gu”)值。每个单独的聚糖结构具有与其键和其组成单糖直接相关的gu值。由于对于给定的聚糖，每个聚糖结构组分均以特定的方式贡献gu值，所以gu值可用于预测结构。
5.因此，通过参考分离校准物，例如基于葡聚糖梯的校准物，聚糖的洗脱时间可用葡萄糖单元表示。葡聚糖梯可用于校准液相色谱(“lc”)的运行，防止其因不同时日或不同系统而变化。gu值可通过将五阶多项式分布曲线或三次样条拟合曲线拟合到葡聚糖梯的保留时间来计算。然后，使用该曲线，可根据在测试样品中观察到的保留时间来分配gu值。只要柱间的标准偏差小于0.3，n-聚糖的gu值便为可重现的。这就允许与在一段时间内从一系列仪器中收集到的数据库值进行直接比较。有了gu值，就能够查询以gu值储存的聚糖的数据库，从而有助于阐明聚糖群中存在的潜在聚糖结构。
6.此外，甚至在比较不同的加标签方法时，可以看出hilic分离将标记的n-聚糖拆分成非常相似的特征谱。要产生适用于用快速加标签试剂快速标记的聚糖的葡聚糖梯并不是一项简单的任务。与通过n-糖基化蛋白的酶促去糖基化释放的n-糖基胺不同，葡聚糖是一种含还原醛末端的糖。因此，与n-糖基胺不同，葡聚糖不能用靶向胺亲核试剂的快速加标签试剂来修饰。因为葡聚糖不包含合适的亲核物质，因此不能被快速标记。因此，需要使用与快速标记的n-聚糖具有相同的光学和/或其他物理化学性质的标准物来校准液相色谱过程的方法。


技术实现要素：

7.本文提供了制备快速标记的葡聚糖梯和其他可用于液相色谱的校准物的方法。该方法包括以下步骤：提供具有醛基的还原性聚糖，并将该还原性聚糖与具有伯胺的化合物反应以产生中间化合物。用快速加标签试剂快速标记该中间化合物以产生快速标记的葡聚糖梯，该葡聚糖梯与用快速加标签试剂对n-聚糖快速加标签所产生的快速标记的n-聚糖具有基本上相同的光学性质。本文还提供了具有以下结构式的校准物：
[0008][0009]
其中r为葡萄糖单元或单糖单元。本文提供的方法适用于对含醛基的化合物快速加标签或加双标签。
附图说明
[0010]
图1示出了用于制备快速标记的n-聚糖的工作流程的实施方案。
[0011]
图2示出了用快速加标签试剂标记的快速标记的n-聚糖的荧光发射光谱，其具有的优化激发波长为265nm，优化发射波长为425nm。
[0012]
图3示出了用快速加标签试剂的类似物仅通过还原胺化标记的葡聚糖梯的荧光发射光谱，其荧光特性发生了偏移，具有的优化激发波长为370nm，优化发射波长为480nm。
[0013]
图4a和图4b示出了用本文提供的方法产生的快速标记的葡聚糖梯的荧光特性。
[0014]
图5a、图5b和图5c示出了通过本文提供的方法产生的快速标记的乙醇胺葡聚糖梯的代表性hilic荧光色谱图。
[0015]
图6a、图6b和图6c示出了实施例3的每批次快速标记的葡聚糖梯的对应基峰离子(“bpi”)色谱图。
[0016]
图7a和图7b示出了采用glycan beh amide 2.1
×
50mm色谱柱，将快速标记的丙基氨基葡聚糖与快速标记的乙醇胺葡聚糖对比获得的荧光色谱图。
具体实施方式
[0017]
在制备生物药物时，生物样品的糖基化特征谱通常通过分析释放的聚糖来进行评估。然而，这些样品的制备技术常常都是耗时的，或可导致样品对质谱(“ms”)分析不敏感。n-聚糖的酶促释放和快速标记可解决许多不足之处、提供更高的n-聚糖样品制备通量，并且能够提高聚糖检测的敏感度。例如，如本文所述，通过n-聚糖的酶促释放和快速标记，糖蛋白如今可在低至10分钟的时间内去糖基化产生n-聚糖，产生的n-聚糖随后与快速加标签试剂快速反应。然后，为了方便样品分析，通过spe法从标记的反应副产物中提取所得的标记聚糖。
[0018]
生物药物的n-聚糖特征谱是一个关键的质量属性，因为它可为功效、安全性和制备条件的量度。因此，用于临床和商业生物治疗制剂的聚糖分析方法需要具备高敏感度。另外，当进行分析时，快速的周转时间和高通过能力可促进产品开发。
[0019]
大多数评估来自糖蛋白的n-聚糖的分析策略都涉及经由pngase f的去糖基化以及标记所得的n-聚糖使其具有赋予其可检测属性的化学部分。在本文所述的一个方法中，标记的聚糖通过亲水相互作用色谱(“hilic”)进行分离，通过荧光(“flr”)和质谱(“ms”)进行检测。
[0020]
此外，我们此前开发了一种样品制备解决方案，该方案使flr和ms能够对聚糖检测敏感，同时提高了n-聚糖样品制备的通量。我们已开发了快速加标签试剂，该试剂可合成产
生，当n-聚糖从糖蛋白释放时能够快速与其反应。(brousmiche等人，2014年8月13日提交的美国公布的专利申请2014/0350263，[0008]-[0022]、[0047]-[0050]、[0053]-[0182]、[0191]、[0228]和[0230]-[0316]，以引用方式并入本文)。通过利用该快速加标签试剂，在5分钟的反应时间内，n-聚糖就能够被标记。本文利用的快速加标签试剂包含n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)氨基甲酸酯快速标记基团、高效喹啉荧光团和用于增强电离的强碱性叔胺，并且例示于下表1中。
[0021]
表1
[0022]
示例性快速加标签试剂
[0023][0024]
在本发明的方法中，还原性糖通过还原胺化被标记(加标签)，并且将所得的含仲胺的糖用快速加标签试剂快速加标签。本文提供的方法可用于对任何含醛的化合物加标签或加双标签。
[0025]
为进一步促进n-聚糖的制备，快速加标签试剂的使用可直接与pngase f的去糖基化工序结合，该工序还涉及表面活性剂和hilicμ洗脱固相萃取(“spe”)清理工序以提供对所释放和标记的聚糖的定量回收，可省去对样品进行液相色谱(“lc”)分析前的溶剂干燥步骤，从而具有附加的益处。
[0026]
实施例1
[0027]
使用快速加标签试剂快速制备释放的n-聚糖用于hilic分析
[0028]
在这个实施例中，我们描述了制备加标签(本文也称为“标记”)的n-聚糖的方法，从糖蛋白到分析就绪样品，在30分钟内完全去糖基化。我们的方法是一种改进的方案，可通过称为glycoworks
tm rapifluor-ms
tm n-聚糖试剂盒的试剂盒来促进实施。相比于此前的荧光和ms检测，对标记的n-聚糖的敏感度可增加至少2倍至100倍，并且可基于用于中和四唾液酸化n-聚糖的稳固的固相萃取(“spe”)提供准确的特征谱分析。lauber，m.et al.，rapid preparation of released n-glyans for hilic analysis using a labeling reagent that facilitates sensitive fluorescence and esi-ms detection，anal.chem.2015，97，5401-5409(lauber，m.等人，“使用促进敏感荧光和esi-ms检测的标记试剂快速制备释放的n-聚糖以供hilic分析”，《分析化学》，2015年，第97卷，第5401-5409页)，以引用方式并入本文。
[0029]
基于对提供快速标记动力学、高荧光量子产率和显著提高的ms可检测性的合理设计考虑，来合成促进我们的n-聚糖分析的快速加标签试剂。n-聚糖样品制备可取决于醛封端糖的还原胺化。在这个过程中，聚糖在无水条件下被还原胺化以最小化去唾液酸作用。样品制备从水性条件转变为无水条件。另一方面，通过利用快速加标签试剂，还原胺化可通过水性快速加标签反应被消除。
[0030]
如果聚糖通过快速加标签反应没有被标记，则可使用还原胺化使聚糖在其还原端被标记。在这个反应中，含伯胺的加标签试剂与聚糖的醛基发生缩合反应，得到亚胺或席夫碱，其被还原剂还原产生仲胺。该反应通常在含乙酸的二甲基亚砜中进行，但是已经描述了使用四氢呋喃和甲醇的替代方法。胺(本文也称为伯胺或具有伯胺的化合物)的示例包括乙醇胺、丙胺、氨基苯甲酰胺、具有游离氨基末端的肽(如本文实施例5所示)、n，n-二甲基乙二胺、氨基蒽和氨基生物素。这种标记方法的优点在于每个聚糖都化学计量连接一个标记，允许基于荧光或uv吸光强度直接进行定量。
[0031][0032]
作为另外一种选择，使用本文描述的glycoworks
tm rapifluor-ms
tm n-聚糖试剂盒，能够在实验室中容易地采用聚糖的快速加标签，该试剂盒的设计目的就是消除n-聚糖样品制备各个方面的瓶颈。如下图1中所示，优化的n-聚糖样品制备工作流程需要三个步骤：(1)去糖基化，从糖蛋白释放聚糖；(2)标记，赋予聚糖可检测的化学实体；以及(3)清理步骤，消除样品中潜在的干扰。然后将这些聚糖与一种或多种快速加标签试剂快速反应，用由高效荧光团和强碱性叔胺组成的标签对其进行标记，从而对荧光和ms检测产生增强的敏感度。下文紧接着示出了快速标记的聚糖的结构描述。值得注意的是，快速标记的聚糖具有一个非常独特的键部分，其不同于来自还原胺化反应的仲胺键。快速标记的n-聚糖将包含中性(非酸性)的脲键。这种结构可影响快速标记的聚糖的物理化学特性和/或性质，包括它们的色谱保留及其荧光性质和其他物理化学性质诸如等电点(“pi”)、酸性、碱性、疏水性、亲水性、螯合金属的能力、uv吸光度、荧光度、在可见光谱中的吸光度、比色变化、分子大小、
与结合伴侣相互作用的亲和力(即生物素酰化残基与亲和素或链霉亲和素之间，表位与对位之间)、还原/氧化电位、交联倾向、可裂解性(化学和热)，以及不同长度的聚合取代基(即4个重复的聚乙二醇(peg)，40个重复的peg)。
[0033][0034]
如本文所用，商标glycoworks
tm
和rapifluor-ms
tm
为其申请者沃特世科技公司(waters technologies corporation)所有。商标glycoworks
tm
与用于实验室用途的样品制备试剂盒结合使用，所述样品制备试剂盒包括生物标准品、样品制备装置和一次性刀片架以及用于制备色谱和质谱样品的化学试剂。相似地，商标rapifluor-ms
tm
与用于制备色谱和质谱样品的化学试剂结合使用，也与用于实验室用途的样品制备试剂盒结合使用，所述样品制备试剂盒包括生物标准品、样品制备装置和一次性刀片架。
[0035]
因此glycoworks
tm rapifluor-ms
tm n-聚糖试剂盒可用于n-聚糖的快速酶促释放和快速标记。这种方案已经用单克隆抗体进行了验证，并且也已经进行了大范围的其他n-连接糖蛋白的测试。这种样品制备试剂盒使用优化的去糖基化条件和试剂来进行快速释放。该试剂盒可包括在2014年8月13日提交的美国公布的专利申请2014/0350263，[0008]-[0022]、[0047]-[0050]、[0053]-[0182]、[0191]、[0228]和[0230]-[0316]中描述的快速标记试剂，该专利申请以引用的方式并入本文，并且该试剂盒被设计成提供敏感荧光检测的同时对质量检测也具有适当的信号强度的双重益处。
[0036]
如本文所述，蛋白质的n-糖基化的表征和监测对于疾病状态的检测和生物药物的制备意义重大。糖基化特征谱通常主要通过分析释放的聚糖来评估，其中常用于制备样品的技术众所周知的非常耗时，或导致样品对ms分析不敏感。随着本文所述的glycoworks rapifluor-ms n-聚糖试剂盒的开发，实现了聚糖检测的前所未有的敏感度，同时还提高了n-聚糖样品制备的通量，这些不足之处就都得到了解决。
[0037]
与通过这种新的样品制备方法提供的效率和敏感度增益以及相关方法同等重要的是，其稳健性以及其产生与历史n-聚糖特征谱分析一致的结果的能力。此外，生成的聚糖数据可用于查询聚糖数据库，但首先需要转化成被称为葡萄糖单元(“gu”)值的标准化值。从而，实施校准基准的另一个益处就是能够将现有聚糖数据转化成搜索可能的聚糖数据库的格式。转换的数据可用于正在研究未知聚糖组成的样品的发现过程。一旦聚糖被转换成gu值，用户就能够查询在线数据库以深入了解样品中可能存在的潜在聚糖结构，潜在地减少了进行典型表征所需的时间。在液相色谱中，校准进行的非常频繁，有时频繁到在聚糖混合物每次分离之后都要进行一次。
[0038]
为了检测荧光(“flr”)标记的聚糖，可将亲水相互作用液相色谱(“hilic”)与荧光检测联用。对于分离处理和与某些常规的高效液相色谱(“hplc”)方法相比，在hilic模式下操作的乙烯桥连聚糖色谱柱(后文称为“beh聚糖色谱柱”或“beh色谱柱”)通过其分离中性和酸性聚糖两者的能力可提高峰值分辨率。beh聚糖色谱柱实现并产生可重现的聚糖分离数据，并在更少的时间内优化方法。
[0039]
beh色谱柱利用混合二氧化硅beh、桥连技术颗粒，所述颗粒用稳定的含酰胺的物质官能化。beh技术产生了直径范围为1.7至5um的多种粒度的固定相，为hplc和超高效液相色谱(“uplc”)技术平台搭建了桥梁。beh颗粒提供碱性分析物的峰形和效率、合理的一系列色谱选择性，以及在流动相极限下(特别是在升高的ph下)化学稳定性的改善。这些色谱柱的拆分能力部分是由于具有用于相关应用的最佳酰胺配体浓度的多孔颗粒。该色谱柱可经优化用于具有荧光(“flr”)检测的uplc或hplc系统，用于从各种生物治疗剂分离释放的和标记的n-连接聚糖，并实现中性和带电荷的标记聚糖物质二者的基于hilic的分离。
[0040]
为了充分利用beh聚糖色谱柱，或简单地使用聚糖的任何基于hilic的特征谱分析，可使用葡聚糖校准梯(在下文中有时称为“葡聚糖梯”或“葡聚糖梯标准物”)。从hilic/flr系统获得的聚糖特征谱可针对葡聚糖梯进行校准，并分配葡萄糖单元(gu)值。例如，一个已知的此类梯，即2ab标记的葡聚糖校准梯，不同于其他市售产品。该葡萄糖均聚物的平均分子量较高(约4,500道尔顿)，因此“可用”的gu值范围是其他葡聚糖梯标准物的两倍，观察到的gu为2到30。因此，大分子量聚糖的保留时间分配得到提高。葡聚糖梯的纯度和结构完整性可通过hilic和质谱(“ms”)进行评估。
[0041]
聚糖的洗脱时间可以参照葡聚糖梯，用葡萄糖单元(“gu”)表示。每个单独的聚糖结构具有与其键和组成单糖直接相关的gu值。由于对于给定的聚糖，特定键中的每个单糖均以特定的方式贡献gu值，所以gu值可用于预测结构。因此，本文提供的葡聚糖梯可用于校准lc的运行，防止其因不同时日或不同系统而变化。gu值可通过将五阶多项式分布曲线或三次样条拟合曲线拟合到葡聚糖梯来计算，然后用该曲线根据保留时间来分配gu值。只要柱间的标准偏差小于0.3，n-聚糖的gu值便可具有很高的可重现性。这就允许与在一段时间内从一系列仪器中收集到的数据库值进行直接比较。
[0042]
有了gu值，就能够查询以gu值储存的聚糖的数据库，从而有助于阐明聚糖群中存在的潜在聚糖结构。葡聚糖梯也提供经质量控制的标准物，其可用于校准在不同实验室用不同仪器获得的色谱图。用hilic-flr仪采集的聚糖保留时间将因仪器和实验室而异。通过将保留时间转化为gu值，所得的数据可用于现场和非现场比较不同地方之间的信息。虽然gu值的使用在此只是作为一个示例，但其他色谱方法可以从使用通过本发明方法制备的葡聚糖校准物中获益，所述方法包括但不限于反相色谱法以及反相与hilic的复合型迭代。
[0043]
n-聚糖的快速标记简化了分析用聚糖样品的制备。但是，要产生适用于用快速加标签试剂快速标记的聚糖的葡聚糖梯并不是一项简单的任务。本文提供了用于标记还原性聚糖的两步法，其允许调节色谱响应和化学性质诸如荧光和ms活性，以及调节具有不同检测性质的多个标签。每个步骤在与还原性聚糖连接的性质上有所不同。术语“还原性聚糖”是指还原糖、还原性糖、还原性多糖(杂多糖不同的糖单元，或不同的单糖，或均多糖)，并且包括任何醛封端的糖如壳三糖、壳二糖、半乳糖-β-(1-3)-galnac-聚糖、甘露糖-二-(n-乙酰基-d-葡糖胺)和麦芽糖。还原性聚糖或还原糖是能够充当还原剂的任何糖，因为其具有游离的醛基。因此本文提供的方法可用于任何含醛(有时也称为醛基)的化合物(包括o-聚糖)加标签或加双标签。
[0044]
如下文紧接着所示，第一步利用还原胺化方法，所述还原胺化方法包括将还原性聚糖(醛封端的糖)与具有伯胺的化合物反应，产生诸如乙醇氨基葡聚糖梯、丙基氨基葡聚糖梯的中间化合物，或具有已经被转化为仲胺的醛的其他化合物，或被转化成用仲胺封端
的还原性聚糖(还原性糖)的步骤。为了产生中间化合物或其醛被转化成仲胺的化合物，可显示所需特性的伯胺(本文也称为“具有伯胺的化合物”或胺)包括乙醇胺、丙胺、氨基苯甲酰胺、具有游离氨基末端的肽(如本文实施例5所示)、n，n
‑‑
二甲基乙二胺/氨基蒽和氨基生物素。第二步是与可赋予不同性质的快速加标签试剂反应。换句话讲，中间化合物的特性与快速加标签化合物(即快速加标签聚糖)的特性不同。
[0045][0046]
其中r-nh2为乙醇胺或具有伯胺的类似类型的化合物。
[0047]
这种方法最初是出于如下需要：用快速加标签试剂(图2)加标签的n-连接聚糖之间的光学性质与用如下文紧接着所示的前体仅通过还原胺化加标签的葡聚糖标准物(本文也称为还原糖)(图3)的性质相匹配。
[0048][0049]
据发现，这两类物质的荧光性质(即激发峰和发射峰)是不利地不同的。因此，这种葡聚糖梯不适合作为用于分析液相色谱中快速标记的聚糖的校准物。
[0050]
本文提供的方法利用快速加标签/胺反应性标记对还原性聚糖(或任何醛封端的聚糖)加标签的反应途径，提供通过n-聚糖的荧光和/或ms活性性质对n-聚糖的检测。传统的对还原性聚糖加标签涉及使用特定加标签试剂的还原胺化(漫长的过程，即反应1至4小时并且可能长达8小时以获得高产率)。然而，本发明的方法则利用还原胺化，一旦产生胺中间体，就马上进行第二步骤(快速，约5分钟)以引入具有荧光/ms活性性质的标签(或标记)并提供具有如下结构式i的糖分子。如本实施方案中所提供的，末端单糖残基显示为通过其4-oh位置连接到剩下的糖结构的n-乙酰化葡糖胺(glcnac)。然而末端单糖残基不一定非得是glcnac；葡聚糖梯可用通过其6-oh位置与结构连接的葡萄糖单糖封端。另外，末端单糖残基可通过4-oh位置连接。葡聚糖梯可用通过其6-oh位置连接到剩下的糖结构的如下式ii例示的任何葡萄糖单糖进行封端。
[0051][0052]
其中r可为单糖单元或葡萄糖残基，r1为-ch2ch2oh，r2为在结构中加入flr-ms官能团的快速加标签试剂的部分并通过以下结构例示：
[0053][0054]
本文提供的方法允许用与其他已经用快速加标签试剂标记的分子具有相同光学性质和ms性质的快速加标签试剂来对还原性聚糖加标签。换句话讲，用快速加标签试剂的伯胺进行还原胺化可产生与用快速加标签试剂(n-连接分子)标记的对比分子具有不同吸光性质和发射性质的分子。连接基可不同(胺与尿素)，导致发色团性质改变。通过用具有伯胺的化合物进行还原胺化，然后用快速加标签试剂对所述胺加标签来保持光学性质。
[0055]
图4a示出了用本文所述方法产生的快速标记的葡聚糖梯的光学性质，其中所述快速加标签试剂为：
[0056][0057]
图4b显示，葡聚糖梯与用相同快速加标签试剂产生的快速标记的聚糖具有基本上相同的荧光性质，所述快速标记的聚糖例示如下：
[0058][0059]
本发明的方法允许通过改变整体极性来调整葡萄糖均聚物(本文称为“葡聚糖梯”)的相对保留。例如，通过用a)乙醇胺或b)丙胺进行还原胺化，然后与快速加标签试剂反应来对葡聚糖梯加标签，会产生不同的保留特性。因此，可调整葡聚糖梯的除其他特性以外的色谱保留特性作为校准基准。
[0060]
因此，本发明的方法可产生与用快速加标签标记试剂标记的n-聚糖具有高度类似的化学性质的葡聚糖梯。
[0061]
如实施例3中列出的所推荐工序中提供的那样，此类葡萄糖均聚物的一个实施方案包括用乙醇胺还原胺化，然后用快速加标签试剂标记以产生如下文紧接着所示的快速标记的乙醇胺葡聚糖梯(快速标记的葡聚糖梯的实施方案)：
[0062][0063]
在另一个实施方案中，实施例3所列工序中的乙醇胺可以用丙胺代替。与图7b所示的相比，当用图7a所示的beh amide固定相分离时，所得的快速标记的丙基氨基葡聚糖(如下所示)显示具有改变的色谱保留。
[0064][0065]
快速标记的丙基氨基葡聚糖，一种快速标记的葡聚糖梯
[0066]
实施例2
[0067]
制备快速标记的葡聚糖梯
[0068]
葡聚糖的还原胺化，偶联工序
[0069]
准确称量100mg的葡聚糖5000(dextran 5000)并置于8ml的小瓶中。然后用吸管向该8ml小瓶中滴入2800μl的dmso，并搅拌直到葡聚糖溶解。然后记录实际重量。
[0070]
向该8ml小瓶中依次加入1200μl的冰乙酸、90.0mg(91.0ml)的重蒸馏乙醇胺(mw＝61.08，d＝1.012)以及128mg的氰基硼氢化钠。轻轻混合浆液，并在磁力搅拌下在70℃的加热块中温育3小时。温育3小时后，将所得反应液从加热块中取出，并冷却至40℃以下。将反应内容物从8ml小瓶转移至配衡的50ml离心机中，并添加40ml的acn溶液。测量并记录皮重，并将小瓶置于冰箱中30分钟。然后，在4000prm下离心混合物5分钟，并滗析上层清液。将所得颗粒重悬在40ml acn溶液中并剧烈涡旋。重复离心、滗析、重悬步骤，总共清洗三次。不需要静置30分钟。将颗粒在氮气流下干燥20分钟，然后在室温下于真空中过夜。称量颗粒重量以测定最终回收量。记录最终重量、皮重和回收重量。
[0071]
产生乙醇胺标记的葡聚糖梯的快速标记工序
[0072]
该工序旨在以超过快速加标签试剂100-200倍的摩尔量进行快速加标签反应。将4.0
±
0.3mg乙醇胺葡聚糖溶解于500μl的50mm hepes溶液中，ph 7.9(用氢氧化钠滴定游离酸而得)。加入300μl无水dmf。用此葡聚糖溶液溶解100
±
0.5mg快速加标签试剂。使反应在室温下进行10分钟。周期性地(每20至30秒一次)搅拌/摇动反应混合物。在室温下完成温育后，用7.6ml acn稀释反应物。最佳做法是刚好在加载到spe柱之前稀释反应液。
[0073]
hilic spe清理
[0074]
用6ml水进行清洗并用6ml 85％的acn溶液进行平衡。将acn稀释的反应混合物分成两(2)份4.5ml体积(近似体积)并加载到柱上。用6ml体积的1∶9∶90甲酸/水/acn清洗三次。用三(3)份4ml体积的未调节ph的200mm乙酸铵和5％的acn进行洗脱。分配600μl体积并通过离心式真空蒸发进行干燥。
[0075]
上述工序可使由乙醇胺葡聚糖中间体制备的标记的葡聚糖梯的每批次产量高达约80个标准品。
[0076]
实施例3
[0077]
快速标记的乙醇胺葡聚糖(快速标记的葡聚糖)的实验条件和代表性数据
[0078]
1至3批次的快速标记的乙醇胺葡聚糖的实验条件，使用快速标记的葡聚糖液相色谱分析如实施例2中所制备的标记的葡聚糖梯的荧光和ms性质。用70％hplc级乙腈(acn)/30％hplc级水(v/v)冲洗色谱柱。然后用流动相条件平衡柱，之后进行第一次进样。下表2和表3提供了分析中使用的hilic uplc/flr/ms条件。
[0079]
表2
[0080][0081]
表3
[0082]
质谱分析
[0083][0084]
图5a、图5b和图5c示出了制备的三批次标记的(乙醇胺)葡聚糖梯中每批次的荧光色谱图。图6a、图6b和图6c示出了每批次快速标记的葡聚糖梯的对应基峰离子(“bpi”)色谱图。标记的葡萄糖单元(gu)物质的质量示于表4中。
[0085]
表4
[0086][0087]
实施例4
[0088]
通过还原胺化用具有伯胺的化合物调节色谱保留
[0089]
通过用丙胺替换实施例2中所列的乙醇胺制备第二快速标记的葡聚糖。根据如下概述的实验条件，将所得的快速标记的丙基氨基葡聚糖的色谱保留与前述快速标记的乙醇胺葡聚糖的色谱保留进行比较：
[0090]
用70％hplc级乙腈(acn)/30％hplc级水(v/v)冲洗色谱柱。然后用流动相条件平衡柱，之后进行第一次进样。表5提供了分析中使用的hilic uplc/flr条件。
[0091]
表5
[0092][0093]
图7a和图7b示出了当使用beh amide 2.1
×
50mm色谱柱时，将快速标记的丙基氨基葡聚糖与快速标记的乙醇胺葡聚糖对比获得的荧光色谱图。
[0094]
预示实施例5
[0095]
将多种功能引入还原性糖
[0096]
更广泛地讲，所提出的方法可通过引入单独的标记部分(或者在本文中也称为“标签”或“标记”)赋予还原性聚糖和还原糖某些化学性质，一种通过还原胺化，另一种通过快速加标签处理。
[0097]
在本发明方法的一个实施方案中，可通过链霉亲和素下拉(pull-down)从样品基质纯化被两次标记的n-聚糖，随后经由快速加标签试剂检测以赋予荧光和/或增强的电离效率。下文所示的这种“两次标记”的糖可同时具有生物素标记和高度荧光、ms活性标记。在如下所示的一个实施方案中，可使用氨基生物素分子进行还原胺化，被还原胺化的糖可通过快速加标签反应被标记。
[0098][0099]
在一个实施方案中，如果将本方法应用于用氨基苯甲酰胺还原胺化聚糖并且随后用快速加标签试剂进行标记，将可能可使用不止一种荧光团/发色团来实现对单一糖类物质的多波长检测。
[0100][0101]
本发明的方法也可允许使用表位标签标记糖/聚糖，从而实现免疫亲和富集或基于免疫的检测。在一个具体实施方案中，可用血凝素(ha)表位标签(一种序列为ypydvpdya的肽)还原胺化糖，然后用快速加标签试剂标记。
[0102]