一种缓释益生菌及其制备方法与流程

1.本发明涉及益生菌制品，具体地，涉及一种缓释益生菌及其制备方法。


背景技术：

2.益生菌是一类定植于宿主肠道内，能够改善宿主肠内微生物平衡而产生确切有益功效的微生物的总称，具有维持肠道菌群平衡，抑制致病菌的生产，进而发挥增强营养、调节免疫、预防疾病等作用。相关报告预计，2022年我国益生菌市场规模将达到1065亿元。但在实际应用过程中，益生菌常常因为胃酸和胆汁的作用，在进入人体肠道后活性降低甚至消失而无法发挥其作用。因此，必须通过一些方法提高益生菌在肠道中的存活率，才能提升益生菌产品的经济价值。
3.现有益生菌包埋技术仍存在诸多技术缺陷，如有机溶剂残留易造成产品安全隐患、纳米胶囊因尺寸过小而无法对益生菌有效包埋、尺寸过大又无法直接穿过幽门括约肌，导致载体在胃部被消化而难以到达结肠部位。目前比较常见的包埋方法包括单层法、双层法和三层法。单层包埋的缺陷也较为明显，在包埋过程和冷冻干燥过程中，菌粉或菌液容易附着到包埋层外壁，造成菌株原料的浪费和带来微生物污染的风险。双层包埋虽然在一定程度上可以抑制菌粉或菌液的泄露，但是仍无法完全做到在肠道中的缓控释，包埋的菌粉往往还未到达肠道就已被分解而失去活性。三层包埋法在菌体靶向缓控释方面明显优于单层法和双层法，但由于工艺的复杂性和包埋层厚度的稳定性难以控制，较难实现工业化的应用。cn105310080a益生菌微胶囊及其制备方法和应用，公布了一种骨架型芯材结构；cn111529511a一种益生菌微胶囊及其制备方法与应用，公布了三层包埋益生菌的方法；cn1613455a靶向益生菌微胶囊及其制备方法，也公布了三层保护的益生菌微胶囊。现有专利在制备益生菌微胶囊过程中均会采用冷冻干燥或喷雾干燥制成益生菌粉作为原料，尽管加入保护剂但对益生菌均有不同程度的损伤。且在肠道内均是一次性全部溶胀出来，益生菌未完全发挥作用就会被代谢。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供了一种缓释益生菌及其制备方法，该方法制备的缓释益生菌可进一步提升益生菌活菌含量及耐酸特性，同时还能使大部分益生菌在肠道内缓慢释放，从而显著改善肠道微环境。
5.为了实现上述目的，本发明一方面提供一种缓释益生菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.s1、益生菌发酵得到益生菌发酵液；
7.采用含有10-15％的脱脂乳粉和3-5％蔗糖，其余为无菌水的培养液进行培养；
8.s2、将海藻酸钠、果胶、乳果糖、乳清蛋白粉加入到步骤s1得到的益生菌发酵液中，搅拌得到混合液；
9.s3、将步骤s2得到的混合液逐滴加入固定液中，固定后过滤，得到益生菌球；
10.s4、向步骤s3得到的益生菌球喷洒聚维酮乙醇溶液，然后撒入抗性淀粉和赤藓糖醇的混合物，于40℃烘箱中干燥2h，得到丸芯；；
11.s5、将步骤s4得到的丸芯置于水不溶性聚合物溶液喷雾中，以在丸芯表面形成控释内层；
12.s6、在控释内层外喷雾包覆肠溶性聚合物溶液，形成控释外层，干燥即得。于40℃烘箱中干燥2h。
13.本发明以高浓度益生菌液直接包埋做成内芯，避免了益生菌粉制作过程中对菌株损伤及缩减工序。
14.果胶是一种可溶纤维，在结肠细菌发酵前通过胃肠系统存活下来。离子性凝胶化和生物活性物质的包封归因于果胶的带电高半乳糖醛酸结构域，具有稳定性强、包埋效果好、内包物质释放率低等特点，因此，利用果胶块包裹的益生菌在储存期间表现出更大的存活率，在模拟胃肠道转运下表现出更大的稳定性。乳清蛋白粉乳化所形成的蛋白质片段相互链接，增加了包埋材料的韧性，赋予益生菌小球抗菌、抗病毒、抗氧化等功效，可有效提升混合菌球贮藏稳定性。此外，添加果胶和乳清蛋白粉有利于促进菌群在肠道释放后的增殖。抗性淀粉又称抗酶解淀粉，难消化淀粉，在小肠中不能被酶解，但在人的肠胃道结肠中可以与挥发性脂肪酸起发酵反应，由其制备的菌球可直接转运至大肠并在其中发生作用。添加乳果糖可促进肠道蠕动增加代谢。
15.本发明通过喷洒方式在丸芯外形成控释内层和控释外层，有效提升缓释效果；在丸芯里添加的聚维酮、抗性淀粉等可进一步提高缓释效果。
16.优选地，步骤s1中，所述益生菌为长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、人源乳杆菌grx07的一种或多种，所述益生菌发酵液中活菌数为10
10-10
12
cfu/ml。
17.本发明可实现益生菌多菌株、高活性。
18.具体地，步骤s2中，所述海藻酸钠、果胶、乳果糖和乳清蛋白占所述混合液的重量百分比分别为5-10％、1-5％、1-5％和1-5％。
19.优选地，步骤s3中，所述固定液为氯化钙溶液，浓度为1-3％。
20.海藻酸钠胶体在氯化钙的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，以便于益生菌球的生成。
21.优选地，步骤s3中，所述益生菌球直径为5-7mm。
22.具体地，步骤s4中，所述聚维酮乙醇溶液中聚维酮浓度为0.5-5％，喷洒量约为益生菌球重量的2-5％，保证益生菌球表面布满一层即可，作为粘结剂、成膜剂及崩解剂。
23.所述抗性淀粉和所述赤藓糖醇的质量比为(2.5-8)：1，每100g益生菌球对应的所述混合物的喷洒速率为15-20g/min。
24.具体地，步骤s5中，所述水不溶性聚合物溶液包括：3-10％乙基纤维素、0.5-1％聚乙二醇4000、1-2％水、1-2％硬脂酸镁、1-2％滑石粉、85-90％乙醇。
25.步骤s5中，所述水不溶性聚合物溶液的包覆量为丸芯重量的8-10％。
26.步骤s6中，所述溶性聚合物溶液包括：2.5-5％醋酸邻苯二甲酸纤维素、0.5-1％聚乙二醇4000、1-2％水、1-2％硬脂酸镁、1-2％滑石粉、88-91％乙醇，所述肠溶性聚合物溶液的包覆量为丸芯重量的5-6％。
27.本发明缓释益生菌的制备方法还包括：步骤s7、将包覆了控释外层益生菌丸充填于胶囊中，构成益生菌缓释胶囊。方便生产和服用。
28.本发明第二方面提供一种缓释益生菌，该缓释益生菌由上述的制备方法制得。
29.通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：
30.1、本发明的缓释益生菌服用后在人工胃液和肠液中释放缓慢、耐酸性强(高达80％以上)，优于普通益生菌，且持续释放时间长达12h以上，有利于发挥多菌株高活力的特性，持续改善肠道微环境；
31.2、本发明生产过程中干燥时间短，含水量低于5％，既节约了能源，也提高了益生菌贮藏期；且该工艺相对其它多层包复工艺更简便、易操作，易实现工业化生产。
具体实施方式
32.以下结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
33.实施例1
34.缓释益生菌的制备方法包括如下步骤：
35.s1、将重量百分比为20％的脱脂乳粉、7％的蔗糖和73％的无菌水混合溶解，得到培养液；将长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、人源乳杆菌grx07(接种总量为0.02％)接种于培养液中，发酵得到益生菌发酵液，该发酵液活菌数为10
12
cfu/ml；
36.s2、将8g海藻酸钠、3g果胶、3g乳果糖、3g乳清蛋白粉加入到步骤s1得到的83g的益生菌发酵液中，搅拌得到混合液；
37.s3、将步骤s2得到的混合液逐滴加入质量浓度为3％的氯化钙固定液中，室温下固定30min，过滤，得到益生菌球；
38.s4、将上述益生菌球置于离心式包衣造粒机中，开机后喷洒浓度为5％的聚维酮乙醇溶液，同时撒入抗性淀粉和赤藓糖醇的混合物(质量比为5:1)，每100g益生菌球对应的所述混合物的喷洒速率为15g/min，于40℃烘箱中干燥2h得到丸芯；
39.s5、将步骤s4得到的丸芯置于底喷式流化床包衣机中，喷雾包覆乙基纤维素乙醇溶液(含有8％乙基纤维素、1％聚乙二醇4000、1％水、1％硬脂酸镁、2％滑石粉、87％乙醇)喷雾中；
40.s6、当乙基纤维素乙醇溶液包覆量达到丸芯重量的8％(w/w)时，再在在外面喷雾包覆醋酸邻苯二甲酸纤维素乙醇溶液(含有5％醋酸邻苯二甲酸纤维素、1％聚乙二醇4000、1％水、2％硬脂酸镁、1％滑石粉、90％乙醇)，醋酸邻苯二甲酸纤维素乙醇溶液的包覆量达到丸芯重量的5％时，停止包覆，然后在40℃烘箱中干燥2h得到缓释益生菌小球。
41.实施例2
42.缓释益生菌的制备方法包括如下步骤：
43.s1、将重量百分比为20％的脱脂乳粉、7％的蔗糖和73％的无菌水混合溶解，得到培养液；将长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、人源乳杆菌grx07(接种总量为0.02％)接种于培养液中，发酵得到益生菌发酵液，该发酵液活菌数为10
12
cfu/ml；
44.s2、将10g海藻酸钠、1g果胶、1g乳果糖、1g乳清蛋白粉加入到步骤s1得到的87g的益生菌发酵液中，搅拌得到混合液；
45.s3、将步骤s2得到的混合液逐滴加入质量浓度为1％的氯化钙固定液中，室温下固定20min，过滤，得到益生菌球；
46.s4、将上述益生菌球置于离心式包衣造粒机中，开机后喷洒浓度为6％的聚维酮乙醇溶液，同时撒入抗性淀粉和赤藓糖醇的混合物(质量比为2.5:1)，每100g益生菌球对应的所述混合物的喷洒速率为16g/min，于40℃烘箱中干燥2h得到丸芯；
47.s5、将步骤s4得到的丸芯置于底喷式流化床包衣机中，喷雾包覆乙基纤维素乙醇溶液(含有3％乙基纤维素、1％聚乙二醇4000、2％水、2％硬脂酸镁、2％滑石粉、90％乙醇)喷雾中；
48.s6、当乙基纤维素乙醇溶液包覆量达到丸芯重量的10％(w/w)时，再在在外面喷雾包覆醋酸邻苯二甲酸纤维素乙醇溶液(含有2.5％醋酸邻苯二甲酸纤维素、1％聚乙二醇4000、2％水、2％硬脂酸镁、2％滑石粉、90.5％乙醇)，醋酸邻苯二甲酸纤维素乙醇溶液的包覆量达到丸芯重量的6％时，停止包覆，然后在40℃烘箱中干燥2h得到缓释益生菌小球。
49.实施例3
50.缓释益生菌的制备方法包括如下步骤：
51.s1、将重量百分比为20％的脱脂乳粉、7％的蔗糖和73％的无菌水混合溶解，得到培养液；将长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、人源乳杆菌grx07(接种总量为0.02％)接种于培养液中，发酵得到益生菌发酵液，该发酵液活菌数为10
12
cfu/ml；
52.s2、将5g海藻酸钠、15g果胶、5g乳果糖、5g乳清蛋白粉加入到步骤s1得到的70g的益生菌发酵液中，搅拌得到混合液；
53.s3、将步骤s2得到的混合液逐滴加入质量浓度为3％的氯化钙固定液中，室温下固定30min，过滤，得到益生菌球；
54.s4、将上述益生菌球置于离心式包衣造粒机中，开机后喷洒浓度为5％的聚维酮乙醇溶液，同时撒入抗性淀粉和赤藓糖醇的混合物(质量比为8:1)，每100g益生菌球对应的所述混合物的喷洒速率为15g/min，于40℃烘箱中干燥2h得到丸芯；
55.s5、将步骤s4得到的丸芯置于底喷式流化床包衣机中，喷雾包覆乙基纤维素乙醇溶液(含有10％乙基纤维素、0.5％聚乙二醇4000、1.5％水、1％硬脂酸镁、2％滑石粉、85％乙醇)喷雾中；
56.s6、当乙基纤维素乙醇溶液包覆量达到丸芯重量的8％(w/w)时，再在在外面喷雾包覆醋酸邻苯二甲酸纤维素乙醇溶液(含有5％醋酸邻苯二甲酸纤维素、0.5％聚乙二醇4000、2％水、2％硬脂酸镁、2％滑石粉、88.5％乙醇)，醋酸邻苯二甲酸纤维素乙醇溶液的包覆量达到丸芯重量的5.5％时，停止包覆，然后在40℃烘箱中干燥2h得到缓释益生菌小球。
57.对比例1
58.其他条件同实施例1，将步骤s2修改为：将8g海藻酸钠、3g乳果糖、3g乳清蛋白粉加入到步骤s1得到的86g的益生菌发酵液中，搅拌得到混合液。
59.对比例2
60.其他条件同实施例1，将步骤s2修改为：8g海藻酸钠、3g果胶、3g乳清蛋白粉加入到步骤s1得到的86g的益生菌发酵液中，搅拌得到混合液。
61.对比例3
62.其他条件同实施例1，将步骤s2修改为：将8g海藻酸钠、3g果胶、3g乳果糖加入到步
骤s1得到的86g的益生菌发酵液中，搅拌得到混合液。
63.对比例4
64.其他条件同实施例1，省略步骤s4。
65.性能测试
66.对实施例1-实施例3、对比例1-对比例4制备的益生菌进行以下性能测试：
67.(1)活菌数
68.检测方法为：称取5g制备的益生菌小球于35ml生理盐水，充分震荡混匀后备用；吸取1ml菌悬液至9ml生理盐水试管中，充分混匀，制成10-2
稀释度菌悬液，依次制备10-3
—10-10
稀释度菌悬液，用平板倾注法进行菌落计数。
69.(2)耐胃酸活性
70.检测方法为：称取5g益生菌小球至35mlmrs培养基(盐酸调节ph为3)试剂瓶中，充分混匀，置于37℃水浴2h，用生理盐水稀释后，采用平板倾注法进行菌落计数。
71.(3)耐胆盐活性
72.检测方法为：称取5g益生菌小球于35ml浓度为0.2％和0.3％的胆盐试剂瓶中，充分混匀，置于37℃水浴4h，用生理盐水稀释后，平板倾注法进行菌落计数。
73.(4)含水量
74.检测方法为：采用gb5009.3-2016食品中水分的测定中第一法进行测定。
75.(5)常温储藏稳定性
76.试验方法为：将制备好的益生菌小球置于25℃恒温箱中储存6个月，测定菌种存活率。
77.(6)益生菌胶囊的释放度
78.以人工胃液、人工肠液为介质，分别监测各实施例和对比例各胶囊在1.5h、3h、8h、10h和12h的释放量。
79.结果如表1所示。
80.表1性能检测结果
[0081][0082]
从实施例1和比例1-对比例3的数据对比可以看出，省略果胶、乳果糖、乳清蛋白粉都会造成益生菌小球各方面性能的下降；
[0083]
从实施例1和对比例4的数据对比可以看出，在丸芯里添加的聚维酮、抗性淀粉等可进一步提高缓释效果。
[0084]
根据实施例和对比例制备的缓释小球在人工胃液和人工肠液中均有缓释效果，但是实施例制得的小球的缓释效果明显优于对比例，实施例的缓释小球在12小时左右释放完全，而对比例中的小球在10h左右已经释放完全。
[0085]
以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0086]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0087]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。