生物正交催化贴片及其使用方法

生物正交催化贴片及其使用方法
1.相关申请的引证
2.本技术要求享有2020年5月6日提交的美国临时专利申请第63/021022号的优先权，该专利通过引用结合于本文中。优先权根据35u.s.c.
§
119和任何其他适用法规进行要求。
技术领域
3.本技术领域通常涉及生物相容性微针和包含这种微针的贴片。更具体而言，该技术领域涉及一种贴片，该贴片引入了体内(和体外)催化双正交(biorthogonal)化学的微针。更具体而言，该技术领域涉及包含微针的贴片，该微针由含有tio2纳米片负载的钯纳米颗粒(pd-tns)作为纳米填料的聚乙烯醇(pva)基质制成。


背景技术：

4.生物正交(bioorthogonal)催化在复杂的生物环境中实现了大量的非自然化学转化，例如用于生物分子标记和蛋白/前药活化的交叉偶联和保护基团裂解反应，拓宽了对生物过程的理解和研究。这类化学的实施主要依赖于非生物过渡金属(tm)，包括pd、au、ru、ir和cu，它们通常分为两种剂型：金属配合物和金属纳米颗粒。由于其毒性不可预测、靶向性缺乏和稳定性有限，金属配合物的应用在很大程度上局限于细菌和细胞研究。为了改善tm的潜在毒性，研究人员将注意力转移到负载型tm纳米颗粒，主要是树脂珠上，以调节细胞内外的异质生物正交催化。通过进一步将树脂负载的tm移植到斑马鱼胚胎中，已经证实了外源基底的正交转换，但这种配制型tm的进一步应用需要精致而复杂的手术。尽管通过使用可注射tm在提高体内生物正交催化的可能性方面取得了进展，但仍存在关于tm在治疗后如何去除、潜在金属毒性、免疫原性和非特异性沉积引起的意外催化的担忧，更不用说对tm和基底分子的不同剂量优化的要求。根据这一推理，一种能够以微创和空间控制的方式工作的生物正交催化器件将为在更高层次的生物实体中操纵非生物化学提供巨大的多功能性。


技术实现要素：

5.本文公开的是基于微针的器件(例如，贴片)，其是一种用于体外和体内催化生物正交化学的简单而强健的器件。在本文中，催化活性基于微针的贴片器件由具有tio2纳米片负载的钯纳米颗粒(pd-tns)作为纳米填料的聚乙烯醇(pva)基质制成。pd-tns的引入大大增强了微针在干燥玻璃状态下的机械性能，使其具有足够的强度，以便能够以微创的方式刺穿皮肤。一旦置于水环境中(例如，在皮肤组织内)，微针就会转化成溶胀水凝胶状态，形成微孔结构。这种结构具有三个层次的结构分级，即三维针状阵列、每个针状基质中的开放微孔和网络中的高度暴露pd-tns表面，这有助于笼状分子扩散，以与pd纳米颗粒接触，从而促进其活化。值得注意的是，通过使用小鼠黑色素瘤模型，证实了全身性给药前体药物n-(烯丙基羰基)阿霉素的局部肿瘤内激活，这不仅可以增加剂量计量，而且可以限制对远处器官和组织的副作用。值得注意的是，纳米复合材料中丰富的氢键赋予微针针尖在水合物
状态下足够的机械韧性，并使其易于整片移除，而不会在体内留下潜在的危险过渡金属或引发炎症。
6.在一个实施方式中，哺乳动物组织中用于体内双正交催化应用的贴片包括基部或基底，该基部或基底具有从所述基部表面延伸的多根微针，其中所述多根微针由具有分散于其中的tio2纳米片负载的钯纳米颗粒(pd-tns)的聚乙烯醇(pva)基质形成。为了使用贴片，将该贴片放置于哺乳动物活组织上，使所述多根微针穿入该组织。例如，这可以是皮肤组织，尽管该贴片可以应用于其他组织类型。然后，给药于哺乳动物的前药由该贴片器件中的pd-tns催化成治疗剂或药物。在一个实施方式中，该前药包括n-(烯丙氧基羰基)阿霉素(alloc-dox)，所产生的治疗剂或药物是阿霉素(dox)。
7.还可以提供治一种治疗系统或试剂盒，其包括微针贴片和递送至哺乳动物受试者的前药。
8.虽然实验中使用的前药是n-(烯丙氧羰基)阿霉素(alloc-dox)，但应该理解的是，其他烯丙氧基羰基改性的前药也可以以类似方式使用。
附图说明
9.图1a图示说明了根据一个实施方式的用于体内双正交催化应用的贴片的平面图。该贴片包括基部或基底以及从其表面延伸的多根微针。所示微针的数量是举例说明性的，因为该贴片中实际微针的数目可以根据需要进行调整或调节。
10.图1b图示说明了图示说明基部或基底以及从其表面延伸的多根微针的贴片的横截面图。
11.图1c图示说明了应用于哺乳动物(例如，人)的皮肤组织的体内双正交催化应用的贴片。
12.图1d示意性地图示说明了具有一个或多个聚集(populate)金属纳米颗粒的表面的薄tio2纳米片(tns)形式的纳米填料的实施方式。
13.图2a图示说明了由用于体内局部活化全身性给药的前药的微针贴片介导的原位生物正交催化的示意图。所述微针由具有分散于其中的tio2纳米片负载的钯纳米颗粒(pd-tns)的聚乙烯醇(pva)基质形成。所述前药由pd-tns活化成治疗剂或药物。
14.图2b图示说明了tio2纳米片(tns)的透射电子显微镜(tem)图像。比例尺：200nm。
15.图2c图示说明了pd-沉积的tns的tem图像。比例尺：100nm。
16.图2d图示说明了pd-tns的扫描tem/能量元素图。比例尺：20nm。
17.图2e图示说明了pd-tns、pd箔和pdo粉末在pd k-边缘的傅立叶变换exafs谱。
18.图2f示意性地图示说明了将非荧光alloc-rhb 110脱笼(decaging)为荧光rhb 110(ex＝485nm、em＝520nm)。
19.图2g图示说明了含pd-tns alloc-rhb 110悬浮液和含有单独alloc-rhb 110或pd-tns的对照组的释放rhb 110的荧光强度；插图：相应反应混合物(培养24小时后)在紫外光下的照片。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。
20.图3a图示说明了结合pd-tns的微针阵列贴片(pt-mn)。
21.图3b图示说明了结合pd-tns的微针阵列贴片(pt-mn)的扫描电子显微镜(sem)图像。比例尺：500μm。
22.图3c图示说明了显示一根微针的纵向截面(顶部，比例尺：200μm)和基质内pd-tns的分布(底部，比例尺：20μm)的sem图像。
23.图3d图示说明了显示由pt-mn介导的脱笼rhb 110的荧光强度变化的曲线图。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。(i)将pt-mn阵列浸入溶液中24小时；(ii)将pt-mn阵列浸入溶液中6小时；(iii)使用纯pva微针。
24.图3e图示说明了冻干微针溶胀后从表面观察的sem图像。pd-tns在孔壁内的截留用红色圈出。比例尺：2μm。
25.图3f图示说明了冻干微针溶胀后从内部截面观察的sem图像。pd-tns在孔壁内的截留用红色圈出。比例尺：2μm。
26.图4a图示说明了用alloc-rhb 110和pt-mn(负载pd-tns)处理不同时间后的b16f10细胞的流式细胞术分析。这证实了细胞培养中pt-mn介导的生物正交催化。
27.图4b图示说明了单独用alloc-rhb 110处理不同时间后的b16f10细胞的流式细胞术分析。
28.图4c图示说明了单独用pt-mn处理不同时间后的b16f10细胞的流式细胞术分析。
29.图4d图示说明了图4a-图4c的直方图的对应荧光强度的曲线图。。
30.图4e图示说明了显示在不同时间点用alloc-rhb 110和pt-mn组合处理后的b16f10细胞内的荧光变化的共聚焦激光显微镜图像(比例尺，50μm)。
31.图4f图示说明了显示在图4e的融合图像中沿着所指示的白色虚线的以不同时间间隔的作为距离的函数的荧光强度的曲线图。与流式细胞术分析相对应，在用alloc-rhb110和pt-mn组合处理的组中直接观察到荧光的时间依赖性增加，而在对照组中未检测到明显变化(图4g-图4h)。
32.图4g图示说明了显示在不同时间点单独用alloc-rhb 110处理后的b16f10细胞内的荧光变化的共聚焦激光显微镜图像(比例尺，50μm)。
33.图4h图示说明了显示在图4g的融合图像中沿着所指示的白色虚线的以不同时间间隔的作为距离的函数的荧光强度的曲线图。
34.图4i图示说明了显示在不同时间点单独用pt-mn处理后的b16f10细胞内的荧光变化的共聚焦激光显微镜图像(比例尺，50μm)。
35.图4j图示说明了显示在图4i的融合图像中沿着所指示的白色虚线的以不同时间间隔的作为距离的函数的荧光强度的曲线图。
36.图5a-图5e图示说明了体外pt-mn介导的前药活化的结果。图5a、图5a图示说明了ctdna/dox(图5a)和ctdna/alloc-dox(图5b)相互作用的荧光光谱滴定。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。图5c显示了以不同药物浓度的dox、alloc-dox和alloc-dox/pt-mn组合处理的b16f10细胞的存活率。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。图5d图示说明了分别用正常培养物、dox、alloc-dox/pt-mn组合、alloc-dox和pt-mn处理后12小时之时的b16f10细胞凋亡使用annexin v-apc(在凋亡开始时与外化磷脂酰丝氨酸结合)和sytox green(染色具有受损膜的坏死和凋亡细胞的核酸)的流式细胞术分析。图5e图示说明了用fitc dutp(绿色，tunel分析测试)和hoechst 33342(蓝色，细胞核染色)染色的b16f10细胞的激光扫描共聚焦显微镜图像，对应于插图(图5d)中所示的组。细胞核中绿色的出现表明细胞凋亡。比例尺：50μm。
37.图6a-图6e图示说明了用于抗癌研究的pt-mn介导的体内前药活化的结果。图6a图示说明了用alloc-dox/pt-mn组合、dox、alloc-dox、pt-mn和pbs治疗的小鼠中b16f10肿瘤生长的生物发光成像。图6b显示了各组小鼠的各肿瘤生长动力学。图6c图示说明了各组的平均肿瘤大小的变化。数据点表示平均值
±
标准差(n＝5)。**p《0.01，***p《0.001。图6d是显示各组平均体重变化的曲线图。数据点表示平均值
±
标准差(n＝5)。图6e图示说明了不同治疗后的肿瘤组织中细胞死亡机制的分析。肿瘤切片用tunel brdured染色以检测凋亡(绿色)，用hoechst 33342染色以检测细胞核(蓝色)。比例尺，100μm。
38.图7a-图7g图示说明了不同治疗后的组织中药物和前药浓度相对于时间和pd含量的曲线。i.p.注射具有预插入pt-mn的alloc-dox(alloc-dox/pt-mn)、i.p.单独注射alloc-dox和单独注射dox后，dox和alloc-dox在(图7a)血浆、(图7b)心脏、(图7c)肝脏、(图7d)脾脏、(图7e)肺、(图7f)肾和(图7g)肿瘤中的浓度。数据点表示平均值
±
标准差(n＝5)。**p《0.01。
39.图7h图示说明了体内应用pt-mn进行生物正交前药活化后，血浆(μg/ml)和主要器官(μg/g)中的pd含量的直方图。将结合pd纳米颗粒的微针贴片(pdnp-mn)用作研究pd泄漏的阳性对照。数据点表示平均值
±
标准差(n＝5)。
40.图8图示说明了与tio2(b)的标准图案(jcpds卡编号74-1940)一致的tio2纳米片的x射线衍射(xrd)图案。2θ＝7.5
°
时的强反射归因于层间距为～1.2nm的分层结构。
41.图9图示说明了所获得的tio2(b)纳米片的uv-vis吸收光谱。然后利用tio2(b)纳米片在uv范围内的强吸收进行钯纳米颗粒的光沉积。
42.图10图示说明了tio2(b)纳米片(tns)和钯沉积的tio2(b)纳米片(pd-tns)的傅立叶变换红外光谱。乙二醇的特征吸收带(包括2938和2870cm-1
处的-ch2振动、1630cm-1
处的o-h弯曲振动和1080cm-1
的c-o拉伸振动)存在于两种样品中。
43.图11图示说明了pd纳米颗粒光沉积前后tns的热重分析(tga)。tns和pd-tns的乙二醇含量分别测量为20.13％和19.58％，这暗示pd纳米颗粒的生长过程中几乎没有乙二醇损失。
44.图12图示说明了对应于图2c中所示的元素图分析的pd-tns的能量色散x射线光谱。
45.图13图示说明了采用参照材料pd箔和pdo粉末的pd-tns的pd k边缘的x射线吸收近边缘结构。
46.图14图示说明了双-n,n
′‑
烯丙氧基羰基笼状罗丹明110的合成。
47.图15图示说明了双-n，n'-烯丙氧基羰基笼状罗丹明110的1h nmr(300m，在dmso-d6中)。
48.图16图示说明了显示530nm(ex＝488nm、em＝530nm)处的荧光强度作为rhb 110浓度的函数的标准曲线。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。
49.图17a和图17b图示说明了(图17a)通过亚化学计量量的pd(0.25mg/ml pd-tns，[pd]～48.8μm)对alloc-rhb 110(100μm)的催化转化。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。图17b图示说明了多相催化研究。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。首先将pd-tns分散于1ml pbs缓冲液中24小时，然后通过离心除去固体部分。之后，将alloc-rhb 110添加到上层上清液中，将所得溶液在37℃下搅拌24小时，并通过荧光光谱仪进行分析。
[0050]
图18图示说明了通过飞行时间二次离子质谱(tof-sims)的微针内pva、tio2和pd的分布(左上图)。信号由c3h3o

、tio

和pd

的离子进行收集。收集每个图像，面积为500
×
500μm。
[0051]
图19图示说明了由pva和pd-tns结合的pva制成的微针的机械行为。pt-mn的断裂力值为2.97n/针，其比纯pva微针(1.29n/针)约2倍更高。
[0052]
图20a-图20c图示说明了pva和pd-tns结合的pva的傅立叶变换红外光谱(图20a)。根据光谱(图20b)，纯pva中3329cm-1
处的oh拉伸峰在pd-tns/pva纳米复合材料中迁移到3333cm-1
。由于当氢键强度增加时，o-h拉伸向较低波数迁移，纳米复合材料中向较高波数的迁移可能是由于pva和锚定于tns表面的乙二醇之间通过单齿模式形成较弱的氢键所致。此外，归因于pva骨架上的c-o拉伸的峰从纯pva中的1092cm-1
迁移到纳米复合材料中的约1089cm-1
(图20c)。这种变化可能是由于tns表面附着的乙二醇与pva发生位移所致，从而导致纳米复合材料中形成新的界面化学键ti-o-c。pd-tns与pva之间的界面相互作用使纳米复合材料具有更高的力学性能和良好的稳定性。
[0053]
图21a示意性地图示说明了用于容纳微针阵列贴片的室。
[0054]
图21b图示说明了3d打印室的照片。
[0055]
图22a图示说明了微针在浸入水中后不同时间点的显微镜图像。比例尺：200μm。
[0056]
图22b-图22c图示说明了pt-mn在pbs缓冲液中的溶胀行为的结果。显示了针在不同时间点的长度(图22b，δl)和宽度(图22c，δw)的变化。这些变化在图22a的右上图中所示的部位周围进行测量。0.5小时后，针溶胀达到一个平台，长度和宽度分别增加约250μm和100μm。此外，能够看出的是微针在水环境中保持良好。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。
[0057]
图23图示说明了显示在催化alloc-rhb 110活化24小时后的来自pt-mn的pd泄漏的量和百分比的结果。一个pt-mn贴片的微针中总pd为约12μg。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。将使用游离pd纳米颗粒(pdnp-mn)作为纳米填料的微针阵列贴片用作研究pd泄漏的阳性对照。与pdnp-mn相比，pt-mn几乎没有检测到任何pd泄漏。
[0058]
图24a图示说明了用于制备pd-掺杂微针的pd纳米颗粒的tem图像；比例尺：20nm。
[0059]
图24b图示说明了pd纳米颗粒掺杂微针的照片。
[0060]
图25a-图25f图示说明了在hepg2细胞培养中的pt-mn介导的生物正交催化。用alloc-rhb 110和pt-mn组合(图25a)、单独alloc-rhb 110(图25b)和单独pt-mn(图25c)处理不同时间后的细胞的流式细胞术分析。插图显示了直方图的相应荧光强度。共聚焦激光显微镜图像显示了在不同时间点(比例尺，50μm)用alloc rhb 110和pt-mn组合(图25d)、单独alloc-rehb 110(图25e)和单独pt-mn(图25f)处理后细胞内的荧光变化。直接观察到用alloc-rhb110和pt-mn组合治疗的组的荧光随时间增加，而对照组未检测到明显变化，这与流式细胞术结果一致。
[0061]
图26a-图26f图示说明了在4t1细胞培养中的pt-mn介导的生物正交催化。用alloc-rhb 110和pt-mn组合(图26a)、单独alloc-rhb 110(图26b)和单独pt-mn(图26c)处理不同时间后的细胞的流式细胞术分析。插图显示了直方图的相应荧光强度。共聚焦激光显微镜图像显示了在不同时间点(比例尺，50μm)用alloc rhb 110和pt-mn组合(图26d)、单独alloc-rehb 110(图26e)和单独pt-mn处理(图26f)后细胞内的荧光变化。直接观察到用alloc-rhb110和pt-mn组合治疗的组的荧光随时间增加，而对照组未检测到明显变化，这与
流式细胞术结果一致。
[0062]
图27图示说明了n-烯丙氧基羰基笼状阿霉素的合成。
[0063]
图28图示说明了n-烯丙氧基羰基笼状阿霉素的1h nmr(300m，在dmso-d6中)。
[0064]
图29a-图29d图示说明：ctdna/dox(图29a)和ctdna/alloc-dox(图29c)系统的荧光光谱滴定以及ctdna/dox(图29b)和ctdna/alloc-do小(图29d)系统的结合等温线。在图29b和图29d中，f表示在ctdna每种浓度下测得的荧光强度，而f0表示无ctdna下的dox(λ
em
＝438nm)或alloc-dox(最大发射)的荧光。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。dox是经典的dna插入剂，其能够在两个邻近的碱基对之间插入平面四环发色团，而同时在带正电的柔红霉素部分与dna磷酸基团之间的静电相互作用能够稳定所述插入复合物。在结合ctdna后，dox或alloc-dox的荧光能够被猝灭，能藉此使用荧光滴定法测量结合常数。结合常数得出值k
ctdna/dox
＝9.36
×
105m-1
和k
ctdna/alloc-dox
＝7.96
×
104m-1
。由于结合常数k
ctdna/alloc-dox
远低于k
ctdna/dox
，能够看出，用烯丙氧羰基掩蔽柔红霉素部分有效削弱了前药与ctdna之间的相互作用。
[0065]
图30a-图30d图示说明了alloc-dox的催化脱保护。图30a图示说明了无pd-tns的反应混合物(0％产率)、(图30b)含游离dox的反应混合物(理论产率100％)、(图30c)24小时后反应混合物(约81.6％产率)。图30d图示说明了在存在(曲线)或不存在(平线)pd-tns的情况下alloc-dox的催化转化过程。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。
[0066]
图31图示说明了在不同药物浓度下用dox、alloc-dox和alloc-dox/pt-mn组合处理的hepg2细胞的存活率。alloc-dox的ic
50
为约9.08μm，其毒性约为dox(ic
50
＝0.34μm)的27倍更低。alloc-dox和pt-mn的组合给出了0.42μm的ic
50
。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。
[0067]
图32显示了在不同药物浓度下用dox、alloc-dox和alloc-dox/pt-mn组合处理的4t1细胞的存活率。alloc-dox的ic
50
为约8.06μm，其毒性约为dox(ic
50
＝0.22μm)的37倍更低。alloc-dox和pt-mn的组合给出了0.29μm的ic
50
。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。
[0068]
图33a-图33b图示说明了在与(图33a)alloc-dox(1μm)和(图33b)allox-dox(1μm)/pt-mn组合一起培养24小时后的细胞外培养基的hplc分析。
[0069]
图34图示说明了b16f10细胞在不同时间暴露于pt-mn后的存活率(活力，viability)。贴片器件未引发明显毒性。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。
[0070]
图35图示说明了在细胞培养物中浸泡48小时后的每孔泄漏pd的量。pdnp-mn被用作研究pd泄漏的阳性对照。与pdnp-mn相比，未检测到来自pt-mn的显著pd泄漏。数据点表示平均值
±
标准差(n＝3)。
[0071]
图36a-图36c图示说明了pt-mn贴片的皮肤插入能力。图36a是显示将一片pt-mn贴片插入肿瘤上方的皮肤中的照片。图36b图示说明了在每次治疗结束时移除微针后观察到的微孔。图36c图示说明了微孔是临时性的，并且在移除pt-mn之后能够在2小时内逐渐重新密封。
[0072]
图37a-图37b图示说明(图37a)从小鼠中取出并冻干后的pt-mn的代表性sem图像。比例尺：200μm。(图37b)对pt-mn表面的近距离检查揭示了多孔结构，这可能是由于插入后在体液存在下pt-mn溶胀所致。比例尺：2μm。
[0073]
图38a-图38b图示说明了每3天腹腔内(i.p.)注射后dox(图38a)和alloc-dox(图
38b)的体内毒性曲线。当dox的剂量超过10mg/kg时，观察到随着时间推移的体重严重下降和死亡(第7天为15mg/kg，第14天为10mg/kg)。对于用alloc-dox治疗的小鼠，即使剂量为150mg/kg，体重变化仍保持于10％内。这些结果表明前药alloc-dox的低毒性。数据点表示平均值
±
标准差(n＝5)。
[0074]
图39显示了包括alloc-dox/pt-mn组合、dox、alloc-dox、pt-mn和pbs不同治疗结束时从小鼠收集的主要器官的苏木精和伊红染色切片。所有插图的比例尺：200μm。
[0075]
图40a-图40d图示说明了用alloc-dox/pt-mn组合、dox、alloc-dox、pt-mn和pbs处理后，载黑色素瘤小鼠中的ifn-γ(图40a)、il-12(图40b)、il-6(图40c)和tnf-α(图40d)的血清水平。数据点表示平均值
±
标准差(n＝5)。
具体实施方式
[0076]
图1a图示说明了可以用于哺乳动物组织100(图1c)中的体内双正交催化应用的贴片10(本文也称为pt-mn 10)的平面图。贴片10包括基部(base)或基底(substrate)12，该基部或基底12包括从基底12延伸或突出的多根微针14。在一些实施方式中，贴片10可以部分或完全生物降解。然而，在其他优选实施方式中，贴片10并非制成是可生物降解的，而是从组织100上的施用部位移除。贴片10的移除确保贴片10中的任何潜在危险或潜在有毒过渡金属不存在于施用部位。在生物可降解贴片10的上下文中的术语生物可降解是指基部或基底12和/或微针14由生物可降解材料形成。多根微针14通常从基部或基底12的表面沿垂直方向延伸或突出。多根微针14可以按图1a所示的规则重复阵列进行排列，或者，可替代地，它们可以按微针14的随机图案或阵列进行排列。在一个实施方式中，形成于基部或基底12上的多根微针14可以具有基本上相似的形状和尺寸。然而，在其他实施方式中，多根微针14可以具有不同的形状和/或尺寸。例如，从基部或基底12延伸的微针14的阵列或场的周边区域可以比贴片10的中心区域的那些更长或具有不同的形状，以便更好地将贴片10固定于施加部位。
[0077]
在一个具体实施方式中，如其名称所示，微针14具有针状形状。例如，微针14可以包括锐化尖端16(见图1b)，其有助于穿透皮肤组织100的表皮层(见图1c)，尽管尖端16可能并非完全锐化(sharp)。例如，尖端16可以具有较小的半径(例如，约10μm)，但仍然为组织穿透提供足够的锐度(sharpness)。贴片10还可以与皮肤以外的其他类型的组织100一起使用。这可以包括皮肤以外的其他器官组织100。在一些实施方式中，组织100可以是健康组织，而在其他实施方式中组织100可以是患病组织。微针14的长度(l)可以变化，尽管通常微针14从基部或基底12延伸小于约2mm(图1b)。微针14的典型长度为约300μm-约2000μm，尽管该尺寸可以超出此范围。在本文描述的实验中，微针14的高度为1500μm。微针14的基部18比尖端16宽。通常而言，微针14的基部18的直径或宽度(w)可以小于约700μm(例如，500μm基部和约1500μm的高度)(图1b)。微针14的具体尺寸和形状由用于形成贴片10的模具的具体结构控制，该模具将在下文更详细描述。微针14的间隔或间距也可以变化。在本文所述的实验中，形成的15x 15微针14的阵列具有的中心-中心间距为800μm。应当理解的是，各种微针14排布和间距可以结合本文描述的贴片10进行使用。
[0078]
仍然参考图1a和图1b，保持(hold)微针14的基部或基底12可以可选地粘合或以其他方式附粘于背衬材料20(例如，通过使用粘合剂、化学连接等)。背衬材料20可以由织造织
物，塑料材料如聚氯乙烯、聚乙烯或聚氨酯或乳胶制成。背衬材料20可以是柔性的，而使贴片10在施加时可以共形地(conformally)覆盖组织100(见图1c)。可选的是，背衬材料20可以包括覆盖背衬材料20的全部或部分面向组织的表面的粘合材料22。例如，粘合剂形成于背衬材料20上围绕基部或基底12或背衬材料20的周边，而使基部或基底12可以固定于组织100的表面上的适当位置。粘合材料22有助于将贴片10固定于组织100上。粘合材料22可以包括树脂(例如，乙烯基树脂)、丙烯酸酯如甲基丙烯酸酯环氧二丙烯酸酯。当然，在其他实施方式中，贴片10可以不具有背衬材料20。
[0079]
基部或基底12和微针14在基本干燥状态下可以是相对刚性的。因此，在一个替代实施方式中，多个子贴片可以集成到背衬材料20中，而制成最终贴片10。这对于可能对基部或基底12造成断裂风险的大覆盖区域或弯曲表面可能是有用的。各个子贴片虽然通常是刚性的，但由于能够弯曲整个贴片10的柔性背衬材料20所致，这些子贴片仍然能够与组织100的表面(例如，图1c)共形(conform，一致)。因为各子贴片的尺寸较小，则它们不会经历显著的弯曲应力，否则这种显著的弯曲应力会导致较大、更刚性的结构响应于弯曲和/或操纵发生断裂。弯曲(bending)或绕曲(flexing)可以发生于背衬材料20内子贴片所处位置之间(例如，子贴片的行和列之间)。虽然贴片10在施加于组织100时可能处于基本干燥状态，但包括微针14的贴片10将随着暴露于组织10的水性流体而变成水合的和溶胀的。此外，通过在施加时处于干燥状态，微针14可以更容易穿透到组织10中。
[0080]
微针14可以具有多种不同的形状和构型，包括，例如，金字塔形、锥形、圆柱形、锥形尖端、规则形状(canonical)、方形底座、五边形底座规则形状尖端、侧开口单腔、双腔和侧开口双腔。所述多根微针14在突破或穿透生物屏障并从周围组织100吸收流体时发生溶胀。微针14可以溶胀约100％-约300％(基于wt)。微针14发生溶胀并且，在一个实施方式中，会形成柔性材料。在一些实施方式中，微针14也是可生物降解的，并随时间溶解。在一个实施方式中，参考图1b，所述多根微针14由聚乙烯醇(pva)基质形成，其中tio2纳米片负载的钯纳米颗粒(pd-tns)26用作纳米填料。参考图1d，在一个优选实施方式中，纳米填料26包括薄tio2纳米片(tns)28，该纳米片具有一个或多个聚集金属纳米颗粒30的表面。图8图示说明了tio2纳米片的x射线衍射(xrd)图案。2θ＝7.5
°
时的强反射归因于层间距为～1.2纳米的分层结构。图9图示说明了所获得的tio2(b)纳米片的uv-vis吸收光谱。然后利用tio2(b)纳米片在uv范围内的强吸收进行钯纳米颗粒30光沉积。
[0081]
金属纳米颗粒30充当催化剂。尽管钯(pd)纳米颗粒30是一个具体实施方式的焦点，但应该理解的是，也可以使用其他基于金属的纳米颗粒30。这些包括其他过渡金属催化剂及其合金和/或金属配合物(例如，金(au)、钌(ru)、铱(ir)或铜(cu))。贴片的基部或基底12也可以由与微针14相同或不同的材料制成。pva用作基质材料并将pd-tns 26包埋于基质材料的孔壁内。
[0082]
为了使用贴片10，在一个实施方式中，参照图2a，通过施加温和的力将微针14插入组织100内，而将贴片10施加于组织100上。在施加贴片10时微针14会穿透组织100。贴片10可以施加于待治疗的目标组织100上。这可以包括一个实施方式中的病变组织100(例如，作为一个实施例的癌组织)。在另一个实施方式中，贴片施加于健康组织100。贴片10也可以施加于远离待治疗组织100的位置。例如，贴片10可以施加于皮肤组织100，即使要由治疗剂或药物治疗的所需目标组织100可能不是皮肤组织100。可选粘合剂也可以用于将贴片10固定
于组织100上。然后，通过全身和/或局部递送(例如，注射，如腹膜内)将微针14暴露于前药。贴片10优选在施用前药之前递送，并且可能需要经过一定的时间(例如，几十分钟至一小时或更长)以允许微针14溶胀。然后，通过贴片10中的pd-tns 26将给药于哺乳动物的前药催化成治疗剂或药物，随后将微针14留在周围组织中。这在图2a中示意性地进行了图示说明。在一个实施方式中，前药是n-(烯丙氧基羰基)阿霉素(alloc-dox)，但应该理解的是，其他烯丙氧基羰基改性的前药也可以按照相似的方式进行使用。另外，其他具有良好水溶性的前药能够通过，例如，静脉内递送。然而，前药alloc-dox过于疏水，而由此进行腹膜内注射。
[0083]
实验
[0084]
pd-tio2纳米填料的合成。通过在乙二醇中溶剂热水解ticl4，而制备超薄tio2纳米片(tns)28，并用作pd催化剂生长的载体(图8-图9)。图2b图示说明了所获得的tns 28的代表性透射电子显微镜(tem)图像，它们由于表面张力而起皱，这在二维材料如石墨烯中会经常观察到。正如红外光谱和热重分析所示，tns 28被乙二醇覆盖(约20wt％，图10-图11)。通过光化学过程，在tns 28的表面上沉积平均尺寸为约8nm的pd纳米颗粒30(pd-tns，图2c)，其中通过元素图分析(elemental mapping analysis)(图2d，图12)揭示了纳米复合材料中的pd、ti和o分布，通过电感耦合等离子体质谱(icp-ms)确定pd含量为约2.1wt％。值得注意的是，沉积pd后，在纳米片28的形态或表面附着乙二醇的量(图10)均未观察到明显变化。这种具有高暴露pd表面的二维结构将有利于催化过程中的传质。此外，通过x-射线吸收近边缘结构(xaens)和扩展x射线吸收精细结构谱(exafs)在pd k-边缘分别研究了pd-tns杂化纳米填料26中pd的化学状态和短程结构。与pdo相比，pd-tns的xanes显示出更靠近pd箔的边缘位置，这指示金属pd的主要形式(图13)。这进一步通过如傅里叶变换exafs(图2e)所揭示的pd-tns中存在强pd-pd键而证实。然而，与pd箔不同的是，在pd-tns 26中也观察到区域内的pd-o键合，这间接表明光还原的pd纳米颗粒30主要通过pd-o键合而锚定于tns载体上。
[0085]
在等渗介质pbs缓冲液(ph 7.4)中，使用双-n,n
′‑
烯丙氧基羰基笼状罗丹明110(alloc-rhb 110，图14-图15)作为基底，考察了pd-tns 26介导生物正交催化的性能。如图2f和图2g所示，当通过催化切割笼状基团释放罗丹明110(rhb 110)时，对于含pd和基底的溶液，绿色荧光逐渐增加。通过使用标准曲线确定转化率为48.8％(图16)。相比之下，在相同时间内无催化剂或基底的对照组中未检测到荧光产生。通过使用亚化学计量量的pd证实了反应的催化性质，尽管需要更长的时间(60小时)以达到类似的转化效率(图17a)。此外，为了验证转化是通过多相催化指导的，首先将pd-tns 26分散于pbs缓冲液中24小时，然后对悬浮液进行离心。随后，将上层上清液与alloc-rhb 110混合并培养24小时，这未能产生可检测的荧光rhb 110(图17b)。
[0086]
催化活性微针贴片的制备。为了制备介导生物正交催化的器件，制备了由pva制成的微针阵列贴片10，其包含pd-tns纳米填料26(～6.25wt％)。通常而言，其中pd-tns纳米填料26(即，tio2纳米片负载的金属纳米颗粒)占贴片10约2wt％-约10wt％。具有pd-tns纳米填料26的基于微针的贴片10在本文中也称为pt-mn 10。pva被选为微针基质，是因为其形成微晶区域作为物理交联剂的独特特性，无毒性和与金属氧化物颗粒良好的相容性。微针14以15
×
15阵列排列(图3a)，并且每根微针是锥形，尖端半径为10μm，高度为1500μm，基部直径为500μm，中心-中心间距为800μm(图3b)。通过飞行时间二次离子质谱法(图18)揭示了
pd-tns26整体结合到微针14内。此外，一根微针14的纵向截面的sem图像表明pd-tns 26均匀分散于pva基质内(图3c)。微针14的断裂力的测量给出了2.97n/针的值，该值比纯pva微针的断裂力高约2倍(图19)。这种增加可归因于pd-tns 26在基质中的良好分散(图3c)以及tns 28与pva骨架上的羟基之间的界面相互作用(图20a-图20c)，这增强了pva复合材料的强度。重要的是，这种增强的强度有助于皮肤插入。
[0087]
为了研究该贴片10的催化效率，将微针14浸入自制室102中，最好地如图21a(也如图21b中所见)所示，该室102填充含alloc-rhb 110的pbs缓冲溶液(图3d中的i)。与上文研究的游离pd-tns的情况一样，在pt-mn 10的辅助下，rhb 110逐渐释放，而使用空白pva-mn的对照组未检测到明显的荧光(图3d中的iii)。同时，通过光学显微镜研究微针14的溶胀行为，这表明微针14在浸入水中后的长度和宽度迅速增加，并在30分钟内达到稳定(平台期)(图22a-图22c)。在进一步冻干溶胀的微针14之后，在针基质的表面和内部形成具有数微米至数十微米范围的孔的三维网络，其中pd-tns 26包封于孔壁内(图3e、图3f)。这种分级多孔结构有利于促进基质/产物分子的传送，以接触/离开催化位点，由此促进其转化。同时，通过icp-ms测量水性部分中的pd含量，其中在整个反应时间内泄漏了约0.24wt％的pd，这间接揭示了贴片10的稳定性(图23)。这种稳定性可能是由于pd和tns载体之间的相互作用以及tns28和pva之间的相互作用所致，它们共同将pd催化剂保持于pva基质内。另外两个实验进一步证实了这一结论。一个实验是在未检测到荧光强度进一步增加的中期去除pt-mn 10(图3d中的ii)。另一个实验表明，当使用未负载的游离pd纳米颗粒(图24a-图24b)作为假定的纳米填料(图23)时，在相同的饱浸时间内释放了约18.1wt％的pd。
[0088]
pt-mns介导的体外生物正交催化。对pt-mn 10在溶液中介导前荧光团活化的催化活性进行了表征，研究了其在细胞培养中介导生物正交催化的效力。b16f10细胞在含有25μm alloc-rhb 110的培养基中进行培养，其中pt-mn 10的微针14浸入细胞外空间。然后在不同时间点通过流式细胞术和共聚焦显微镜分析这些细胞。正如流式细胞术(图4a)所示，整个细胞群的荧光以时间依赖性方式增加。然而对于不存在pt-mn 10或alloc-rhb 110的对照组，在所有时间内均未产生荧光(图4b、图4c、图4d)。与流式细胞术结果一致的是，共聚焦激光显微镜允许可视化用pt-mn 10和alloc-rhb 110组合处理的细胞内逐渐增加的绿色荧光(图4e，图4f)，但对照组未观察到明显的荧光(图4g-图4j)。这些结果表明，pt-mn 10能够在体外有效实施生物正交催化，以触发alloc-rhb 110的脱笼(uncage，解封)。细胞外培养基中产生的荧光团促进了它们扩散到整个细胞群中。此外，重要的是，采用hepg2(图25a-图25f)和4t1细胞(图26a-图26f)能够重复类似的催化趋势，这间接表明了该器件在不同细胞外环境中介导生物正交催化的通用性(generality)。
[0089]
通过pt-mn的体外前药激活。接着，研究了pt-mn 10对癌症治疗的前药活化。为了将细胞毒性限制于肿瘤部位而同时减少治疗期间对正常组织100的损伤，已经通过利用癌组织内的代谢或生理异常开发了各种生物敏感的前药。然而，它们的效率常常受到肿瘤异质性的阻碍。在这方面，生物正交催化将为前药的时空活化提供另一种有前景的策略。为了进行基准测试(benchmarking)，合成了n-(烯丙氧基羰基)阿霉素(alloc-dox)作为生物正交前药(图27、图28)。阿霉素(dox)是临床用于癌症治疗的治疗剂/药物，其通过结合dna并引发酶介导的链断裂而发挥功效。尽管如此，它的全面应用仍受到副作用如心脏毒性、骨髓抑制、恶心和呕吐限制。通过将伯胺用烯丙基氨基甲酸酯基团笼封，alloc-dox(k
alloc-dox
＝
7.96
×
104m-1
)对小牛胸腺dna的结合亲和力明显低于dox(k
dox
＝9.36
×
105m-1
)，这如荧光滴定法(图5a、图5b和图29a-图29d)所示。alloc-dox的这种较弱的dna结合能力可能是由于柔红霉素部分的正电荷的减少降低了dna药物插入复合物的稳定性。同时，通过高效液相色谱(hplc)分析(图30a-图30d)证明了溶液中由pd-tns 26催化的alloc-dox的脱笼。这种掩蔽策略将提供毒性较小的前药，而同时允许通过生物正交催化进行活化。
[0090]
接着，使用b16f10细胞进行细胞活力分析测试，以研究不同浓度(5nm-0.2mm)下alloc-dox、dox和alloc-dox/pt-mn 10组合的毒性曲线。与显示出随着浓度增加毒性升高的母体dox相比，alloc-dox显示出更低的抗增殖活性(图5c)。据计算，alloc-dox(ic
50
＝9.29μm)的毒性比dox(ic
50
＝0.08μm)几乎低120倍。相比之下，将pt-mn 10引入含有alloc-dox的培养基中导致了每种浓度下细胞存活率的显著降低，ic
50
为0.12μm，这与dox所显示的趋势是可比较的。平行地，当对其他细胞系，如hepg2(图31)和4t1细胞(图32)进行相同的实验时，观察到类似结果。
[0091]
通过hplc对浸有pt-mn 10的培养基的分析验证了dox的细胞外生成(图33a-图33b)。此外，通过用annexin v-apc(别藻蓝蛋白，allophycocyanin)和sytox绿对细胞进行双重染色，并用流式细胞仪进行分析(图5d)，用alloc-dox/pt-mn10组合处理的细胞群中有很大比例(44.1％)呈annexin-v-apc阳性，与用dox处理的组(64.2％)相似。同时，在单独使用alloc-dox或pt-mn 10处理的对照组中未观察到明显的凋亡细胞死亡。此外，与生长旺盛的对照细胞不同，用alloc-dox/pt-mn组合或dox处理的组中的细胞显示出广泛的凋亡dna片段，这通过末端脱氧核苷酸转移酶dutp缺口末端标记(tunel)分析法揭示(图5e)。所有这些结果都与用dox引发的凋亡特征相一致，证实了用alloc-dox/pt-mn 10组合诱导的细胞毒性是由于细胞培养中dox的生物正交生成所致。此外，值得一提的是，前药浓度为零的pt-mn 10证实在不同时间暴露后对细胞并无毒性(图34)，并且在末端检测到可忽略的pd泄漏(图35)，这能够归因于如上所述的贴片10的稳定性。
[0092]
通过pt-mn的体内前药活化用于癌症治疗。为了评估生物正交pt-mn/alloc-dox组合的体内肿瘤抑制性能，使用b16f10小鼠黑色素瘤模型进行了抗癌研究。首先，pt-mn 10穿透皮肤组织100的能力通过用温和的力将贴片10压在黑色素瘤上方的皮肤100上来证明(图36a-图36c)。能够看出的是，针14基质在从小鼠移除后溶胀成三维多孔网络(图37a-图37b)，这种结构变化能够有助于缓解生物正交催化过程中的传质障碍。同时，为了决定能够给予哪种剂量的alloc-dox进行治疗，通过测量小鼠的体重变化并与用dox治疗的小鼠的体重改变进行比较而确定alloc-dox的体内毒性(图38a-图38b)。每三(3)天腹膜内(i.p.)注射最高达150mg/kg的alloc-dox导致～7.7％的体重减轻，而同时当剂量超过10mg/kg时，dox造成严重的体重减轻和死亡，这间接表明前体药物在体内毒性较低。根据这些数据，在以下抗肿瘤研究中采用了100mg/kg alloc-dox和5mg/kg dox。
[0093]
接着，将载b16f10肿瘤小鼠随机分为五组，分别用alloc-dox/pt-mn10组合、dox、alloc-dox、pt-mn 10(无前药)和pbs进行治疗，每3天一次。dox、alloc-dox和pbs通过腹膜内注射进行给药。在开始注射前药之前，将pt-mn 10从表面皮肤插入肿瘤部位并在那里固定一(1)小时，以使针14完全溶胀。记录生物发光成像和肿瘤体积以可视化肿瘤生长，并评价治疗效率(图6a)。如图6a-图6c所示，与用pbs治疗的对照组一样，单独使用alloc-dox或pt-mn 10治疗的组未观察到肿瘤生长延迟，这表明单独使用前药或催化剂均无抗肿瘤作
用。在dox治疗组中观察到中度(moderate)抑制结果，但停止dox给药后肿瘤迅速生长。相比之下，alloc-dox/pt-mn 10组合能更好地抑制肿瘤生长，在四(4)次治疗后，导致小鼠肿瘤最小。此外，在所有组中均未观察到小鼠的明显体重波动(图6d)，这表明前药、pt-mn10器件及其组合的副作用较低。重要的是，tunel分析测试仅在用alloc-dox/pt-mn10和dox治疗的组中证实了凋亡信号，这意味着肿瘤细胞杀伤机制类似(图6e)。
[0094]
为了进一步洞悉这些治疗结果，分析了不同治疗之后药物/前药在不同组织(包括肿瘤、血浆和其他主要器官)中的浓度相对于时间的曲线。如图7a-图7g所示，在单独使用alloc-dox治疗的组中的所有组织中均未检测到dox，这表明前药对通过高级生物代谢过程的意外激活具有稳定性。与用dox治疗的组相比，所有组织中的alloc-dox比dox多，这是由于允许给予更高剂量的前药所致。对于alloc-dox/pt-mn 10组合治疗组，血浆和其他正常器官中alloc-dox浓度的曲线与单独使用alloc-dox治疗的组相似。然而，在pt-mn 10存在下，alloc-dox在肿瘤组织内会产生dox得到了验证，值得注意的是，i.p.注射后6和12小时之时的dox浓度比dox治疗组高出很多。此外，重要的是，没有明显的所产生的dox从肿瘤部位泄漏回到血流或其他主要器官。这可能归因于pt-mn 10的三维构型，其有助于所生成的dox在肿瘤内均匀扩散，由此促进其被癌细胞摄取。在一些组织中测量的少量dox可能来自于由跨越肿瘤区域和皮肤之间的一部分微针14产生的dox。总之，可以推论的是，肿瘤内alloc-dox的积累及其由生物正交催化贴片10的局部激活恢复了药物从内部对抗肿瘤的药理学特性，而同时将对远处器官和组织的毒副作用降至最低。
[0095]
最后，但重要的是，在治疗后，pt-mn 10能够在水合状态下取出而不会出现明显损伤(图37a)，这可以归因于pva链之间的氢键以及tns28和pva之间的界面相互作用赋予溶胀的pt-mn10足够的机械强度。与空白对照组相比时，对pt-mn插入的肿瘤组织部分、血浆或其他主要器官中的pd含量的分析并未显示出差异，这表明贴片10的稳定性不允许活系统中的催化剂泄漏(图7h)。以微针器件的形式完全去除生物正交催化剂将缓解过渡金属毒性的担忧。此外，在移除微针14(图36b、图36c)后2小时内，暂时的微孔逐渐重新密封，这将减少那里感染的机会。主要器官的苏木精和伊红(h&e)染色显示，任何组均无明显损伤或炎症(图39)。并且，因子(如tnf-α、ifn-γ和il-6)水平与注射pbs的空白对照组没有差异，这表明未诱导炎症(图40a-图40d)。
[0096]
公开了一种基于微针的催化贴片10器件及其应用，用于在体外和体内介导生物无害物质向活性治疗剂或药物的生物正交转化。贴片10构建于与钯纳米颗粒沉积的tio2纳米片28作为纳米填料26整合的聚乙烯醇基质上，其中所述有利的界面相互作用使微针14在干燥状态下具有用于皮肤穿透的高机械强度，并在水合状态下具有良好的稳定性，而防止过渡金属意外泄漏。因此，该生物正交贴片10器件显示出高稳定性、良好生物相容性、易移除性，并且能够在水溶液、细胞外空间和组织的选定区域中有效地将惰性基质转化为其母体状态。贴片10能够在肿瘤部位激活笼封抗癌药物并以时空控制的方式恢复其药理学性质，通过该方式减轻了对远处器官或组织的脱靶向激活或剂量依赖性副作用。这为利用生物正交化学对高级生物中感兴趣的限定区域的生物过程进行局部探寻铺平了道路。
[0097]
易植入和可移除的基于微针的贴片10的开发支持向更安全的生物正交催化化学的过渡，而无金属沉积或引起炎症。金属配合物或颗粒金属仍然面临着金属释放不受控制、循环期间非特异性吸收、不确定性金属毒性或生物系统清除等挑战，这不仅影响它们自身
的有效性，而且可能触发脱靶前药活化。此外，还需要额外的劳动付出以优化催化剂和前药的顺序给药之间的时间延迟(lag)，研究催化剂的生物分布，以及最终手术移植和/或取出催化剂。所有这些问题都间接表明，在生物系统中实现过渡金属催化的外源基底转化是一项挑战。相反，通过将微针阵列贴片10与双正交功能整合，微针贴片10设计成用于特定组织区域的极其局部生物正交化学，进一步增强了非生物化学的正交性。此外，这种受限性质只需要微创透皮施加，其操作可以通过简单的培训就能进行实施。随着微针和生物正交概念的广泛发展，能够自然设想的是，器件或贴片10是模块化和可放大的，其中所述过渡金属催化剂、所述介导的化学反应(前药)以及所述微针基质和阵列图案针对各种疾病治疗，不仅与皮肤相关，而且对于其他器官和组织类型，能够进行灵活调节和优化。
[0098]
虽然已经显示和描述了本发明的实施方式，但在不脱离本发明范围的情况下，可以进行各种修改。因此，本发明除了随附权利要求及其等同物之外不应受到限制。