细胞的制作方法

细胞
发明领域
1.本发明涉及包含多于一种嵌合抗原受体(car)的细胞。
技术背景
2.已经描述许多用于癌症治疗的免疫治疗剂，其包括治疗性单克隆抗体(mab)，免疫缀合mab，放射缀合mab和双特异性t细胞接合物。
3.通常，这些免疫治疗剂靶向单个抗原：例如，利妥昔单抗(rituximab)靶向cd20；myelotarg靶向cd33；和阿仑单抗(alemtuzumab)靶向cd52。
4.人cd19抗原是95kda的跨膜糖蛋白，其属于免疫球蛋白超家族。cd19在b细胞分化的极早期表达，并且仅在终末b细胞分化成浆细胞时丢失。因此，cd19在除多发性骨髓瘤以外的所有b细胞恶性肿瘤上表达。由于正常b细胞区室的丢失是可接受的毒性，cd19是有吸引力的car靶标，并且用car靶向cd19的临床研究已经看到有希望的结果。
5.goldie-coldman假说提供了肿瘤学领域的特殊问题：该假说描述了由于大多数癌症中固有的高突变率，单个抗原的唯一靶向性可能通过所述抗原的调节而导致肿瘤逃逸。抗原表达的这种调节可能降低已知免疫治疗药物，包括靶向cd19的那些的功效。
6.因此，靶向cd19的免疫治疗药物的问题是b细胞恶性肿瘤可能发生突变并变为cd19阴性。这可能导致对cd19靶向治疗药物无响应的cd19阴性癌症的复发。例如，在一项儿科研究中，grupp等人报告称，在b-急性淋巴细胞白血病(b-all)的cd19靶向嵌合抗原受体疗法之后的所有复发中的一半是由于cd19阴性疾病(第56届美国血液学会年会和博览会)。
7.因此，需要能够靶向多于一个细胞表面结构的免疫治疗剂，以反映与许多癌症，包括cd19阳性癌症，相关联的标志物表达的复杂模式。
8.嵌合抗原受体(car)
9.嵌合抗原受体是将例如单克隆抗体(mab)的特异性移植到t细胞的效应器功能的蛋白质。它们通常的形式是i型跨膜域蛋白，其中识别抗原的氨基端、间隔物、跨膜域均与传递t细胞存活和激活信号的复合胞内域连接(参见图1a)。
10.这些分子最常见的形式是衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scfv)的融合，这些单克隆抗体识别靶抗原，经由间隔物和跨膜域融合到信号传导胞内域。此类分子响应于scfv对其靶标的识别而导致t细胞的激活。当t细胞表达此类car时，它们识别并杀伤表达靶抗原的靶细胞。已经开发了针对肿瘤相关抗原的若干car，并且使用此类表达car的t细胞的过继转移方法目前正在用于治疗各种癌症的临床试验中。
11.已经观察到，使用car方法治疗癌症，肿瘤异质性和免疫编辑可以导致从car治疗逃逸。例如，在grupp等人(2013；new eng.j.med 368:1509-1518,paper no 380,ash 2014)描述的研究中，car修饰的t细胞方法用于治疗急性b淋巴细胞性白血病。在该临床试验中，发现在一个月后完全缓解的10名患者确实复发，并且其中5名患者复发了cd19阴性疾病。
12.因此，需要解决癌症逃逸和肿瘤异质性问题的替代car治疗方法。
13.两种car结合特异性的表达
14.已经开发被称为串联car或tancar的双特异性car，试图同时靶向多个癌症特异性标志物。在tancar中，胞外域包含由接头连接的两个串联抗原结合特异性。因此，两个结合特异性(scfv)均与单个跨膜部分连接：一个scfv与膜并列，且另一个处于远端位置。
15.grada等人(2013,mol ther nucleic acids 2:e105)描述了tancar，其包括cd19特异性scfv，然后是gly-ser接头，然后是her2特异性scfv。her2-scfv处于近膜(juxta-membrane)位置，并且cd19-scfv处于远端位置。显示tan car诱导对两种肿瘤限制性抗原中的每一种产生不同的t细胞反应性。选择这种排列，是因为her2(632aa/)和cd19(280aa,)的各自长度适合于该特定的空间排列。还已知her2 scfv结合her2最远端的4个环。
16.这种方法的问题是，由于远端scfv的存在，特别是它与抗原结合，近膜scfv可能难以接近。鉴于需要选择两个scfv的相对位置，鉴于抗原在靶细胞上的空间排列，可能无法将这种方法用于所有scfv结合对。此外，tancar方法不太可能用于两个以上的scfv，具有三个或更多scfv的tancar将是非常大的分子，并且scfv很可能相互折叠，从而掩盖抗原结合位点。同样令人怀疑的是，与跨膜域相隔两个或更多个scfv的最远端scfv的抗原结合是否能够触发t细胞活化。
17.因此，需要替代方法来在细胞，如t细胞，的表面上表达两种car结合特异性。该问题已由本发明人在wo2016/102965中解决。仍然需要提供在表面上表达两种car结合特异性，也表现出改善的存活和持久性的细胞。


技术实现要素：

18.本发明人已经开发出在细胞表面表达两种car的car t细胞，一种特异性针对cd19并且一种特异性针对cd22。此外，本发明的car t细胞额外包含增强模块，在本文中对其进行了更详细的描述。
19.因此，在第一方面，本发明提供了在细胞表面共表达第一嵌合抗原受体(car)和第二car的细胞，每个car包含抗原结合域，其中第一car的抗原结合域与cd19结合，第二car的抗原结合域与cd22结合，进一步地其中细胞表达显性阴性shp2(dshp2)和显性阴性tgfβ受体ii(dntgfβrii)。
20.一种car结合cd19并且另一种car结合cd22的事实是有利的，因为一些淋巴瘤和白血病在cd19靶向后变为cd19阴性(或在cd22靶向后可能变为cd22阴性)，因此如果发生这种情况，它提供了“备用”抗原。此外，本发明人已表明，与dshp2和dntgfβrii的特定组合是有利的，如本文进一步所描述。
21.本发明人还已经表明，细胞内信号传导域的特殊组合也是有利的。因此，本发明提供了其中每个car包含细胞内信号传导域的细胞，其中第一car的细胞内信号传导域包括tnf受体家族胞内域；并且第二car的细胞内信号传导域包括共刺激胞内域。
22.共刺激胞内域可以是cd28共刺激胞内域。合适的tnf受体家族胞内域的实例包括但不限于ox-40和4-1bb胞内域。
23.第一和第二car的细胞内信号传导域也可能包含含有itam的胞内域。
24.该细胞可能是免疫效应细胞，如t细胞、自然杀伤(nk)细胞或nkt细胞。本文提到的与t细胞相关的特征同样适用于其他免疫效应细胞，如nk细胞或nkt细胞。
25.每个car可以包含：
26.(i)抗原结合域；
27.(ii)间隔物；和
28.(iii)跨膜域。
29.每个car可以包含：
30.(i)抗原结合域；
31.(ii)间隔物；
32.(iii)跨膜域；和
33.(iv)胞内域。
34.第一car的间隔物可能与第二car的间隔物不同，这样第一和第二car不会形成异源二聚体。
35.第一car的间隔物可能具有与第二car的间隔物不同的长度和/或配置，使得为识别其各自的靶抗原而量身定制每个car。第二car的合适间隔物包括但不限于软骨寡聚基质蛋白(comp)卷曲螺旋域。
36.第二car的抗原结合域可能与cd22上的膜远端表位结合。第二car的抗原结合域可能与cd22的ig域7、6、5或4上，例如cd22的ig域5上的表位结合。
37.第一car的抗原结合域可以与cd19上由外显子1、3或4编码的表位结合。
38.第一car的cd19结合域可以包含：
39.a)重链可变区(vh)，其具有有以下序列的互补决定区(cdr)：
40.cdr1
–
sywmn(seq id no.1)；
41.cdr2
–
qiwpgdgdtnyngkfk(seq id no.2)
42.cdr3
–
retttvgryyyamdy(seq id no.3)；和
43.b)轻链可变区(vl)，其具有有以下序列的cdr：
44.cdr1
–
kasqsvdydgdsyln(seq id no.4)；
45.cdr2
–
dasnlvs(seq id no.5)
46.cdr3
–
qqstedpwt(seq id no.6)。
47.cd19结合域可以包含vh域，其具有如seq id no.7或seq id no 8所示的序列；或vl域，其具有如seq id no 9、seq id no.10或seq id no.11所示的序列，或其具有至少90％序列同一性的变体，该变体保留结合cd19的能力。
48.cd19结合域可以包含如seq id no 12、seq id no.13或seq id no.14所示的序列，或其具有至少90％序列同一性的变体，该变体保留结合cd19的能力。
49.第二car的cd22结合域可以包含：
50.a)重链可变区(vh)，其具有有以下序列的互补决定区(cdr)：
51.cdr1
–
nywin(seq id no.15)；
52.cdr2
–
niypsdsftnynqkfkd(seq id no.16)
53.cdr3
–
dtqerswyfdv(seq id no.17)；和
54.b)轻链可变区(vl)，其具有有以下序列的cdr：
55.cdr1
–
rssqslvhsngntylh(seq id no.18)；
56.cdr2
–
kvsnrfs(seq id no.19)
57.cdr3
–
sqsthvpwt(seq id no.20)。
58.cd22结合域可以包含vh域，其具有如seq id no.21或seq id no 22所示的序列；或vl域，其具有如seq id no 23或seq id no.24所示的序列，或其具有至少90％序列同一性的变体，该变体保留结合cd22的能力。
59.cd22结合域可以包含如seq id no 25或seq id no.26所示的序列，或其具有至少90％序列同一性的变体，该变体保留结合cd22的能力。
60.第二car的胞内域可以包含共刺激域和含有itam的域；第一car的胞内域可以包含tnf受体家族域和含有itam的域。
61.例如，第一car(具有cd19特异性)可能具有以下结构：
62.agb1-间隔物1-tm1-tnf-itam
63.其中：
64.agb1是抗原结合域；
65.间隔物1是间隔物；
66.tm1是跨膜域；
67.tnf是tnf受体胞内域；以及
68.itam是含有itam的胞内域；
69.并且第二car(具有cd22特异性)可能具有以下结构：
70.agb2-间隔物2-tm2-costim-itam
71.其中：
72.agb2是抗原结合域；
73.间隔物2是间隔物；
74.tm2是跨膜域；
75.costim是共刺激域；以及
76.itam是含有itam的胞内域。
77.在第二方面，本发明提供了编码本发明第一方面定义的第一和第二嵌合抗原受体(car)，以及dshp2和dntgfβrii的核酸序列。
78.核酸序列可能具有以下结构：
79.模块1-coexpr-agb1-间隔物1-tm1-coexpr-agb2-间隔物2-tm2-coexpr-模块2
80.其中
81.agb1是编码第一car的抗原结合域的核酸序列；
82.间隔物1是编码第一car的间隔物的核酸序列；
83.tm1是编码第一car的跨膜域的核酸序列；
84.coexpr是能够实现共表达的核酸序列
85.agb2是编码第二car的抗原结合域的核酸序列；
86.间隔物2是编码第二car的间隔物的核酸序列；
87.tm2是编码第二car的跨膜域的核酸序列；
88.模块1和模块2是编码显性阴性shp2(dshp2)或显性阴性tgfβrii(dntgfβrii)的核酸序列，其中当模块1编码dshp2时模块2编码dntgfβrii，并且当模块2编码dntgfβrii时模块1编码dshp2；
89.当核酸序列在t细胞中表达时，其编码在切割位点被切割的多肽，使得第一和第二car在t细胞表面共表达。
90.核酸序列可能具有以下结构：
91.模块1-coexpr-agb1-间隔物1-tm1-endo1-coexpr-abb2-间隔物2-tm2-endo2-coexpr-模块2
92.其中
93.agb1是编码第一car的抗原结合域的核酸序列；
94.间隔物1是编码第一car的间隔物的核酸序列；
95.tm1是编码第一car的跨膜域的核酸序列；
96.endo1是编码第一car的胞内域的核酸序列；
97.coexpr是能够实现共表达的核酸序列
98.agb2是编码第二car的抗原结合域的核酸序列；
99.间隔物2是编码第二car的间隔物的核酸序列；
100.tm2是编码第二car的跨膜域的核酸序列；
101.endo2是编码第二car的胞内域的核酸序列；
102.模块1和模块2是编码显性阴性shp2(dshp2)或显性阴性tgfβrii(dntgfβrii)的核酸序列，其中当模块1编码dshp2时模块2编码dntgfβrii，并且当模块2编码dntgfβrii时模块1编码dshp2；
103.当核酸序列在t细胞中表达时，其编码在切割位点被切割的多肽，使第一和第二car在t细胞表面共表达。
104.允许两种car共表达的核酸序列可能编码自切割肽或序列，该序列允许共表达两种car的替代方法，如内部核糖体进入序列或第2启动子或其他此类方法，由此本领域的技术人员可以从相同载体表达两种蛋白质。
105.替代密码子可以用于编码相同或相似氨基酸序列的序列区，如跨膜和/或细胞内t细胞信号传导域(胞内域)，以避免同源重组。例如，替代密码子可以用于编码间隔物、跨膜域和/或全部或部分胞内域的序列的部分，使得两个car具有相同或相似的该部分或这些部分的氨基酸序列，但由不同的核酸序列编码。
106.在第三方面，本发明提供了试剂盒，其包含
107.(i)第一核酸序列，其编码第一嵌合抗原受体(car)，其核酸序列具有以下结构：
108.agb1-间隔物1-tm1
109.其中
110.agb1是编码与cd19结合的第一car的抗原结合域的核酸序列；
111.间隔物1是编码第一car的间隔物的核酸序列；
112.tm1是编码第一car的跨膜域的核酸序列；
113.(ii)第二核酸序列，其编码第二嵌合抗原受体，其核酸序列具有以下结构：
114.agb2-间隔物2-tm2
115.其中
116.agb2是编码与cd22结合的第二car的抗原结合域的核酸序列；
117.间隔物2是编码第二car的间隔物的核酸序列；和
118.tm2是编码第二car的跨膜域的核酸序列；和
119.(iii)第三核酸序列，其编码本文所述的dshp2和dntgfβrii。
120.试剂盒可以包含
121.(i)第一核酸序列，其编码第一嵌合抗原受体(car)，其核酸序列具有以下结构：
122.agb1-间隔物1-tm1-endo1
123.其中
124.agb1是编码第一car的抗原结合域的核酸序列；
125.间隔物1是编码第一car的间隔物的核酸序列；
126.tm1是编码第一car的跨膜域的核酸序列；
127.endo1是编码第一car的胞内域的核酸序列；以及
128.(ii)第二核酸序列，其编码第二嵌合抗原受体(car)，其核酸序列具有以下结构：
129.agb2-间隔物2-tm2-endo2
130.其中
131.agb2是编码第二car的抗原结合域的核酸序列；
132.间隔物2是编码第二car的间隔物的核酸序列；
133.tm2是编码第二car的跨膜域的核酸序列；
134.endo2是编码第二car的胞内域的核酸序列。
135.在第四方面，本发明提供了试剂盒，其包含：包含第一核酸序列的第一载体；包含第二核酸序列的第二载体；以及包含第三核酸序列的第三载体。
136.载体可以是质粒载体、逆转录病毒载体或转座子载体。载体可以是慢病毒载体。
137.在第五方面，本发明提供了包含根据本发明的第二方面的核酸序列的载体。载体可能是慢病毒载体。
138.载体可以是质粒载体、逆转录病毒载体或转座子载体。
139.在第六方面，本发明提供了制备根据本发明的第一方面的细胞的方法，其包括将编码第一和第二car、dshp2和dntgfβrii的一个或多个核酸序列；或如上定义的一个或多个载体引入细胞。细胞可能是t细胞。
140.该细胞可以来自从受试者，包括但不限于患者、相关或不相关的造血移植供体、完全不相关的供体分离的样品、来自脐带血、从胚胎细胞系分化、从可诱导祖细胞系分化或从转化细胞系衍生的样品。
141.在第七方面，本发明提供了包括多个根据本发明的第一方面的细胞的药物组合物。
142.在第八方面，本发明提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用根据本发明的第七方面的药物组合物的步骤。
143.该方法可以包括以下步骤：
144.(i)从受试者中分离含细胞的样品；
145.(ii)用编码第一和第二car、dshp2和dntgfβrii的一个或多个核酸序列或包含此类核酸序列的一个或多个载体转导或转染细胞；以及
146.(iii)向受试者施用来自(ii)的细胞。
147.该疾病可以是癌症。癌症可以是b细胞恶性肿瘤。
148.在第九方面，本发明提供了根据本发明的第七方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
149.在第十方面，本发明提供了根据本发明的第一方面的细胞在制造用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
150.本发明还提供了核酸序列，其包含：
151.a)第一核苷酸序列，其编码第一嵌合抗原受体(car)；
152.b)第二核苷酸序列，其编码第二car；
153.其中一种car结合cd19，另一种car结合cd22；和
154.c)序列，其编码位于第一和第二核苷酸序列之间的自切割肽，使得两种car以单独的实体表达。
155.替代密码子可以用于编码相同或相似氨基酸序列的区中的第一和第二核苷酸序列的一个或多个部分。
156.本发明还提供了包含此类核酸的载体和细胞。
157.载体可以是质粒载体、逆转录病毒载体或转座子载体。
158.本发明人还发现，在or门系统中，如果产生存活信号的域和共刺激域在两个(或更多)car之间“分裂”，则性能得到改善。
159.因此，在第十一方面，提供了在细胞表面共表达第一嵌合抗原受体(car)和第二car的细胞，该第一car包含与cd19结合的抗原结合域，该第二car包含与cd22结合的抗原结合域，每个car包含细胞内信号传导域，其中第一car的细胞内信号传导域包含tnf受体家族胞内域；并且第二car的细胞内信号传导域包含共刺激域。
160.共刺激域可以是cd28共刺激域。tnf受体家族胞内域可以是，例如ox-40或4-1bb胞内域。
161.第一和第二car的细胞内信号传导域也可以包含含有itam的域，如cd3ζ胞内域。
162.第一car可能具有以下结构：
163.agb1-间隔物1-tm1-tnf-itam
164.其中：
165.agb1是第一car的抗原结合域；
166.间隔物1是第一car的间隔物；
167.tm1是第一car的跨膜域；
168.tnf是tnf受体胞内域；以及
169.itam是含有itam的胞内域。
170.第二car可能具有以下结构：
171.agb2-间隔物2-tm2-costim-itam
172.其中：
173.agb2是第二car的抗原结合域；
174.间隔物2是第二car的间隔物；
175.tm2是第二car的跨膜域；
176.costim是共刺激域；以及
177.itam是含有itam的胞内域。
178.在第十二方面，提供了编码本发明的第十一方面中定义的第一和第二嵌合抗原受体(car)两者的核酸序列。
179.核酸序列可具有以下结构：
180.agb1-间隔物1-tm1-tnf-itam1-coexpr-abb2-间隔物2-tm2-costim-itam2
181.其中
182.agb1是编码第一car的抗原结合域的核酸序列；
183.间隔物1是编码第一car的间隔物的核酸序列；
184.tm1是编码第一car的跨膜域的核酸序列；
185.tnf是编码tnf受体胞内域的核酸序列；
186.itam1是编码第一car的含有itam的胞内域的核酸序列；
187.coexpr是能够实现共表达的核酸序列
188.agb2是编码第二car的抗原结合域的核酸序列；
189.间隔物2是编码第二car的间隔物的核酸序列；
190.tm2是编码第二car的跨膜域的核酸序列；
191.costim是编码共刺激域的核酸序列；
192.itam2是编码第二car的含有itam的胞内域的核酸序列。
193.当核酸序列在细胞中表达时，其可编码在切割位点被切割的多肽，使得第一和第二car在细胞表面共表达。
194.在第十三方面，提供了试剂盒，其包含
195.(i)第一核酸序列，其编码本发明的第十一方面中定义的第一嵌合抗原受体(car)，其核酸序列具有以下结构：
196.agb1-间隔物1-tm1-tnf-itam1
197.其中
198.agb1是编码第一car的抗原结合域的核酸序列；
199.间隔物1是编码第一car的间隔物的核酸序列；
200.tm1是编码第一car的跨膜域的核酸序列；
201.tnf是编码tnf受体胞内域的核酸序列；
202.itam1是编码第一car的含有itam的胞内域的核酸序列；
203.和
204.(ii)第二核酸序列，其编码本发明的第十一方面中定义的第二嵌合抗原受体(car)，其核酸序列具有以下结构：
205.agb2-间隔物2-tm2-costim-itam2
206.agb2是编码第二car的抗原结合域的核酸序列；
207.间隔物2是编码第二car的间隔物的核酸序列；
208.tm2是编码第二car的跨膜域的核酸序列；
209.costim是编码共刺激域的核酸序列；以及
210.itam2是编码第二car的含有itam的胞内域的核酸序列。
211.在第十四方面，提供了包含根据本发明的第十一方面或如本发明的第十二方面所定义的核酸序列的载体。
212.在第十五方面，提供了制造根据本发明的第十一方面的细胞的方法，其包括将根据本发明的第十二方面的核酸序列；如本发明的第十三方面中定义的第一核酸序列和第二核酸序列；或根据本发明的第十四方面的载体引入细胞的步骤。
213.在第十六方面，本发明提供了包含多个根据本发明的第十一方面的细胞的药物组合物。
214.本发明还提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用根据发明的第十六方面的药物组合物的步骤。
215.还提供了根据发明的第十六方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
216.还提供了根据本发明的第十一方面的细胞在制造用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
217.通过提供靶向cd19的一种car和靶向cd22的一种car，有可能靶向这些标志物中的每一个，从而减少癌症逃逸的问题。
218.因为car作为单独的分子在细胞表面表达，这种方法克服与tancar相关联的空间和可及性问题。细胞活化效率也得到改善。如果每个car具有自己的间隔物，则有可能量身定制间隔物，并且因此定制结合域从细胞表面投射的距离及其与特定靶抗原的柔性等。这种选择不受与tancar相关联的设计考虑的限制，即一种car需要与t细胞膜并列并且一种car需要在远端串联定位到第一car。
219.通过提供编码由切割位点分开的两种car的单个核酸，有可能利用简单的单一转导规程工程化改造细胞共表达两种car。双重转染规程可以与在单独构建体中的car编码序列使用，但这将更复杂和昂贵，并且需要更多的核酸整合位点。双重转染规程也与两种car编码核酸是否被转导和有效表达的不确定性相关。
220.car将具有高度同源性的部分，例如跨膜和/或细胞内信号传导域可能高度同源。如果两种car使用相同或相似的接头，则它们也将高度同源。这将表明，由于序列之间的同源重组的可能性，在单个核酸序列上提供两种car的方法是不适当的。然而，本发明人发现，通过对高同源性的序列编码区域的部分进行“密码子摆动(codon wobbling)”，有可能从单个构建体中高效表达两种car。密码子摆动涉及在编码相同或相似氨基酸序列的序列区中使用替代密码子。
附图说明
221.图1：a)经典car示意图。(b)至(d)：car胞内域的不同代和排列：(b)初始设计通过fcεr1-γ或cd3ζ胞内域单独传递itam信号，而后期设计在同一复合胞内域中传递额外的(c)一个或(d)两个共刺激信号。
222.图2：b细胞成熟途径/b细胞个体发生。dr＝hla-dr；ccd79＝细胞质cd79；ccd22＝细胞质cd22。cd19和cd22抗原均在b细胞成熟的早期阶段表达。正是这些细胞发展为b细胞急性白血病。同时靶向cd19以及cd22两者最适合用于靶向b细胞急性白血病。
223.图3：cd19结构和外显子
224.图4：抗cd19 or cd22 car盒的设计策略。选择识别cd19的结合物和识别cd22的结合物。为每个car选择最佳的间隔物域和信号传导域。(a)构建or门盒，使得使用fmd-2a肽共表达两种car。任何同源序列均进行密码子摆动以避免重组。(b)两种car作为单独的蛋白质
在t细胞表面共表达。
225.图5：密码子摆动以允许相同肽序列在逆转录病毒载体中的共表达但避免同源重组的实例。在此，野生型hch2ch3-cd28tmzeta与密码子摆动的hch2ch3-cd28tmzeta对比。
226.图6：本发明的cd19/cd22 or门的示意图。
227.图7：天然存在的二聚体、三聚体和四聚体卷曲螺旋结构(修饰自andrei n.lupas and markus gruber；adv protein chem.2005；70:37-78)
228.图8：来自胶原寡聚基质蛋白(comp)和人igg1的五聚体卷曲螺旋基序的晶体结构。个体链用不同颜色描绘。卷曲螺旋comp结构从n端展示，c端延伸到页面中，并且也从c端左侧到n端右侧的谱展示。人igg1从n端(上)至c端(下)的谱展示。
229.图9：comp间隔物的截短
230.a)显示抗ror-1comp car的示意图，comp间隔物从n端从45个氨基酸截短至“x”个氨基酸
231.b)用截短的构建体转染293t细胞，并通过facs进行分析。
232.图10：体内a)t细胞活化和b)t细胞抑制的机制的示意图
233.图11：cd19/cd22 or门构建体的汇总。cd19和cd22 car由自切割2a序列分开，以便实现每个car作为不同的分子表达。
234.图12：各种cd19/cd22 or门构建体的比较。将表达其中一种构建体的细胞以1:1的效应细胞：靶细胞(e:t)比与靶细胞(50,000个靶细胞)共培养72小时。(a)剩余靶细胞；(b)il-2产生；(c)ifn-γ产生；(d)增殖。蓝色圆圈：未转导细胞；红色方块：构建体1；绿色菱形：构建体3；紫色圆圈：构建体4；黑色方块；构建体5。
235.图13：各种cd19/cd22 or门构建体的体外测试。将表达其中一种构建体的细胞与靶细胞以1:1和1:10的效应细胞：靶细胞(e:t)比共培养72小时。蓝色圆圈：未转导细胞；红色方块：构建体1；绿色三角形：构建体3；紫色三角形：构建体5。(a)剩余靶细胞；(b)
236.图14：检测dntgfβrii模块。蓝色圆圈：仅培养基；红色圆圈： 10ng/ml rhtgf-β。
237.图15：测试dshp2模块。蓝色圆圈：未转导的supt1细胞；cd19 supt1细胞；cd19 pdl supt1细胞。
238.图16：再刺激测定。红色条：靶细胞；蓝色条：t细胞。顶行：cd19 supt1细胞；底行：cd22 supt1细胞。
239.图17：确定表达构建体1的次优剂量细胞以充当构建体5比较的起点。
240.图18：构建体1、3和5的体内比较。在该剂量水平(2.5x106个t细胞)下，表达构建体1的细胞不能控制肿瘤负荷。表达构建体3或构建体5的细胞显示出改善的活性。特别是构建体5显示所有小鼠的肿瘤负荷控制至第23天。与构建体1相比，通量的差异是统计学上显著的。
241.图19：cd19敲除nalm6小鼠中构建体1、3和5的体内比较。在该剂量水平(2.5x106个t细胞)下，表达构建体1的细胞不能控制肿瘤负荷。表达构建体3或构建体5的细胞显示出改善的活性。特别是构建体5，除1只小鼠外，所有小鼠的肿瘤负荷均控制至第27天。
242.发明详述
243.嵌合抗原受体(car)
244.car，如图1中示意性显示的，是嵌合i型跨膜蛋白，可以将细胞外抗原识别域(结合
物)与细胞内信号传导域(胞内域)连接。结合物通常是衍生自单克隆抗体(mab)的单链可变片段(scfv)，但它可以基于包含抗体样抗原结合位点的其他格式。通常需要间隔物域将结合物与膜分离，并允许其具有适当的方向。使用的共同间隔物域是igg1的fc。更紧凑的间隔物可以满足需求，例如来自cd8α的柄，以及甚至仅igg1铰链，取决于抗原。跨膜域将蛋白质锚定在细胞膜上，并将间隔物与胞内域连接。
245.早期car设计具有衍生自fcεr1或cd3ζ的γ链的细胞内部分的胞内域。因此，这些第一代受体传递免疫信号1，其足以触发t细胞杀伤同源靶细胞，但未能完全激活t细胞以增殖并存活。为了克服这一限制，构建了复合胞内域：t细胞共刺激分子的细胞内部分与cd3ζ的细胞内部分的融合产生第二代受体，其在抗原识别后可以同时传递激活和共刺激信号。最常用的共刺激域是cd28的共刺激域。这提供了最有力的共刺激信号-即免疫信号2，其触发t细胞增殖。还描述了一些受体，其包括tnf受体家族胞内域，如传递存活信号的密切相关的ox40和41bb。现在已经描述了更有力的第三代car，其具有能够传递激活、增殖和存活信号的胞内域。
246.可以使用，例如逆转录病毒载体将编码car的核酸转移到t细胞。可使用慢病毒载体。以这种方式，可以生成大量的癌症特异性t细胞进行过继细胞转移。当car与靶抗原结合时，这导致激活信号传递至表达其的t细胞。因此，car引导t细胞的特异性和细胞毒性朝向表达靶向抗原的肿瘤细胞。
247.本发明的第一方面涉及共表达第一car和第二car的细胞，其中一种car结合cd19，并且另一种car结合cd22，使得t细胞可以识别表达这些标记物中的任一种的靶细胞。
248.因此，本发明的第一和第二car的抗原结合域与不同的抗原结合，并且两种car包含激活胞内域。此外，每个car使用不同的细胞内信号传导域。两个car可以包含间隔物域，间隔物域可能相同，或足够不同以防止两个不同受体的交叉配对。因此，可以工程化细胞以在识别cd19和cd22中的一种或两种后激活。如goldie-coldman假设所指示，这在肿瘤学领域是有用的：由于大多数癌症中固有的高突变率，单一抗原的唯一靶向可能通过调节所述抗原导致肿瘤逃逸。通过同时靶向两种抗原，此类逃逸的可能性呈指数降低。
249.重要的是，两种car不能异源二聚化。
250.本发明的t细胞的第一和第二car可以作为包含两种car以及切割位点的多肽生产。
251.信号肽
252.本发明中细胞的car可以包含信号肽，因此当car在细胞如t细胞内表达时，新生蛋白被引导至内质网，随后至表达其的细胞表面。
253.信号肽的核心可能含有长伸展的疏水性氨基酸，其有形成单个α-螺旋的趋势。信号肽可能从一段短的带正电荷的氨基酸开始，这有助于在易位过程中加强多肽的适当拓扑结构。在信号肽末端，通常存在一段被信号肽酶识别和切割的氨基酸。信号肽酶可能在转位过程中或转位完成后切割，生成游离信号肽和成熟蛋白。然后通过特定蛋白酶消化游离信号肽。
254.信号肽可以位于分子的氨基端。
255.信号肽可以包含seq id no.27、28或29或其具有5、4、3、2或1个氨基酸突变(插入、取代或添加)的变体，前提是信号肽仍具有导致细胞表面表达car的功能。
256.seq id no.27:mgtsllcwmalcllgadhadg
257.seq id no.27的信号肽紧凑且高度高效。预测其在末端甘氨酸后进行约95％的切割，产生通过信号肽酶高效去除。
258.seq id no.28:mslpvtalllplalllhaarp
259.seq id no.28的信号肽衍生自igg1。
260.seq id no.29:mavptqvlgllllwltdarc
261.seq id no.29的信号肽衍生自cd8。
262.第一car的信号肽可以具有与第二car的信号肽不同的序列。
263.cd19
264.人cd19抗原是分子量为95kda的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。cd19被归类为i型跨膜蛋白，具有单个跨膜域、细胞质c端和细胞外n端。cd19的一般结构如图3所例示。
265.cd19是正常和赘生性b细胞以及滤泡树突状细胞的生物标志物。事实上，从最早可识别的b系细胞发育到b细胞胚细胞的过程中，它存在于b细胞上，但在成熟为浆细胞时会丢失。。它主要与cd21和cd81一起充当b细胞共同受体发挥作用。激活后，cd19的细胞质尾变为磷酸化的，导致由src-家族激酶的结合和pi-3激酶的募集。cd19在b细胞分化的极早期表达，并且仅在终末b细胞分化为浆细胞时丢失。因此，除多发性骨髓瘤外，cd19在所有b细胞恶性肿瘤上表达。
266.已在不同中心针对cd19测试car的不同设计，如下表所列出的：
267.表1
[0268][0269][0270]
如上所述，迄今为止进行的大多数研究均使用衍生自杂交瘤fmc63的scfv作为结合域的部分来识别cd19。
[0271]
如图3所示，编码cd19的基因包含10个外显子：外显子1至4编码胞外域；外显子5编码跨膜域；外显子6至10编码细胞质域，
[0272]
在本发明的cd19/cd22 or门中，抗cd19 car的抗原结合域可以结合由cd19基因的外显子1编码的cd19的表位。
[0273]
在本发明的cd19/cd22 or门中，抗cd19 car的抗原结合域可以结合由cd19基因的外显子3编码的cd19的表位。
[0274]
在本发明的cd19/cd22 or门中，抗cd19 car的抗原结合域可以结合由cd19基因的外显子4编码的cd19的表位。
[0275]
本发明人已开发抗cd19 car，其与已知的抗cd19 car相比具有改善的性质，已知的抗cd19 car包含结合物fmc63(参见wo2016/102965，实施例2和3，其内容在此通过引用并入)。car的抗原结合域基于cd19结合物cd19alab，其具有以下鉴定的cdr和vh/vl区。
[0276]
因此，本公开还提供了car，其包含cd19结合域，该cd19结合域包含a)重链可变区(vh)，其具有有以下序列的互补决定区(cdr)：
[0277]
cdr1
–
sywmn(seq id no.1)；
[0278]
cdr2
–
qiwpgdgdtnyngkfk(seq id no.2)
[0279]
cdr3
–
retttvgryyyamdy(seq id no.3)；和
[0280]
b)轻链可变区(vl)，其具有由以下序列的cdr：
[0281]
cdr1
–
kasqsvdydgdsyln(seq id no.4)；
[0282]
cdr2
–
dasnlvs(seq id no.5)
[0283]
cdr3
–
qqstedpwt(seq id no.6)。
[0284]
可能在该或每个cdr中引入一个或多个突变(取代、添加或缺失)，而不对cd19结合活性产生负面影响。例如，每个cdr可以具有一个、两个或三个氨基酸突变。
[0285]
本公开的car可以包含以下氨基酸序列之一：
[0286]
seq id no.12(鼠cd19alab scfv序列)
[0287]
qvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvssdiqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleik
[0288]
seq id no.13(人源化cd19alab scfv序列-重链19，κ16)
[0289]
qvqlvqsgaevkkpgasvklsckasgyafssywmnwvrqapgqslewigqiwpgdgdtnyngkfkgratltadesartaymelsslrsgdtavyfcarretttvgryyyamdywgkgtlvtvssdiqltqspdslavslgeratinckasqsvdydgdsylnwyqqkpgqppklliydasnlvsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaadvavyhcqqstedpwtfgqgtkveikr
[0290]
seq id no.14(人源化cd19alab scfv序列-重链19，κ7)
[0291]
qvqlvqsgaevkkpgasvklsckasgyafssywmnwvrqapgqslewigqiwpgdgdtnyngkfkgratltadesartaymelsslrsgdtavyfcarretttvgryyyamdywgkgtlvtvssdiqltqspdslavslgeratinckasqsvdydgdsylnwyqqkpgqppkvliydasnlvsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaadvavyycqqstedpwtfgqgtkveikr
[0292]
scfv可以是vh-vl方向(如seq id no.12、13和14所示)或vl-vh方向。
[0293]
本公开的car可以包含以下vh序列之一：
[0294]
seq id no.7(鼠cd19alab vh序列)
[0295]
qvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvss
[0296]
seq id no.8(人源化cd19alab vh序列)
[0297]
qvqlvqsgaevkkpgasvklsckasgyafssywmnwvrqapgqslewigqiwpgdgdtnyngkfkgratltadesartaymelsslrsgdtavyfcarretttvgryyyamdywgkgtlvtvss
[0298]
本公开的car可以包含以下vl序列之一：
[0299]
seq id no.9(鼠cd19alab vl序列)
[0300]
diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleik
[0301]
seq id no.10(人源化cd19alab vl序列，κ16)
[0302]
diqltqspdslavslgeratinckasqsvdydgdsylnwyqqkpgqppklliydasnlvsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaadvavyhcqqstedpwtfgqgtkveikr
[0303]
seq id no.11(人源化cd19alab vl序列，κ7)
[0304]
diqltqspdslavslgeratinckasqsvdydgdsylnwyqqkpgqppkvliydasnlvsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaadvavyycqqstedpwtfgqgtkveikr
[0305]
本发明的car可以包含cd19结合域，其包含a)重链可变区(vh)，其具有有以下序列的互补决定区(cdr)：
[0306]
cdr1
–
gyafsss(seq id no.30)；
[0307]
cdr2
–
ypgded(seq id no.31)
[0308]
cdr3
–
sllygdyldy(seq id no.32)；和
[0309]
b)轻链可变区(vl)，其具有有以下序列的cdr：
[0310]
cdr1
–
sasssvsymh(seq id no.33)；
[0311]
cdr2
–
dtsklas(seq id no.34)
[0312]
cdr3
–
qqwninplt(seq id no.35)。
[0313]
cd19结合域可以包含移植到人抗体框架上的上述6个cdr。
[0314]
cd19结合域可以包含如seq id no.36所示序列的vh域和/或如seq id no.37所示序列的vl域或其具有至少95％序列同一性的变体。
[0315]
seq id no.36(cat19 vh)
[0316]
qvqlqqsgpelvkpgasvkisckasgyafssswmnwvkqrpgkglewigriypgdedtnysgkfkdkatltadkssttaymqlssltsedsavyfcarsllygdyldywgqgttltvss
[0317]
seq id no.37(cat19 vl)
[0318]
qivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymhwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpdrfsgsgsgtsyfltinnmeaedaatyycqqwninpltfgagtklelkr
[0319]
cd19结合域可以包含vh-vl方向的scfv。
[0320]
cd19结合域可以包含如seq id no.38所示的序列或其具有至少90％序列同一性的变体。
[0321]
seq id no.38(cat19 scfv)
[0322]
qvqlqqsgpelvkpgasvkisckasgyafssswmnwvkqrpgkglewigriypgdedtnysgkfkdkatltadkssttaymqlssltsedsavyfcarsllygdyldywgqgttltvssggggsggggsggggsqivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymhwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpdrfsgsgsgtsyfltinnmeaedaatyycqqwninpltfgagtklelkr
[0323]
本公开的car可以包含如seq id no.21、13、7、8、9、10、14、11、26、37或38所示序列的变体，其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，前提是变体序列保留结合cd19的能力(在与互补vl或vh域结合时，如适用)。
[0324]
两个多肽序列之间的百分比同一性可以很容易地通过程序，如blast来确定，blast可以在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov免费获得。
[0325]
cd22
[0326]
人cd22抗原是属于凝集素siglec家族的分子。其在成熟b细胞表面和一些未成熟b细胞上发现。一般而言，cd22是防止免疫系统的过度激活和自身免疫性疾病的发展的调节分子。
[0327]
cd22是特异性结合唾液酸的糖结合跨膜蛋白，具有位于其n端的免疫球蛋白(ig)域。ig域的存在使cd22成为免疫球蛋白超家族的成员。cd22作为b细胞受体(bcr)信号传导的抑制性受体发挥功能。
[0328]
cd22是igsf分子，其可能存在两种同等型，一种具有7个域以及由3个itim(免疫受体酪氨酸抑制基序)和1个itam组成的胞质内尾；并且剪接变体替代地由5个胞外域和携带1个itim的胞质内尾组成。cd22被认为是参与控制b细胞对抗原的应答的抑制性受体。与cd19一样，cd22被广泛认为是泛b抗原，但已描述在一些非淋巴样组织上表达。用治疗性单克隆抗体和免疫缀合物靶向cd22已进入临床试验。
[0329]
haso等人(blood；2013；121(7))描述了抗cd22 car的实例。具体地，描述了具有衍生自m971、ha22和bl22 scfv的抗原结合域的抗cd22 car。
[0330]
抗cd22 car的抗原结合域可以结合cd22，kd范围为30-50nm，例如30-40nm。kd可以是约32nm。
[0331]
cd-22具有7个细胞外igg样域，通常被鉴定为ig域1至ig域7，其中ig域7位于b细胞膜的最近端，并且ig域7位于ig细胞膜的最远端(参见haso et al 2013，如上图2b所示)。
[0332]
ig域在cd22氨基酸序列方面的位置(http://www.uniprot.org/uniprot/p20273)汇总在下表中：
[0333]
[0334][0335]
第二car的抗原结合域可以与cd22上的膜远端表位结合。第二car的抗原结合域可以与cd22的ig域7、6、5或4上，例如cd22的ig域5上的表位结合。第二car的抗原结合域可以与位于cd22的氨基酸20-416之间，例如cd22的氨基酸242-326之间的表位结合。
[0336]
抗cd22抗体ha22和bl22(haso et al 2013，如上)以及cd22alab(如下所述)与cd22的ig域5上的表位结合。
[0337]
第二car的抗原结合域可以不与cd22上的膜近端表位结合。第二car的抗原结合域可以不与cd22的ig域3、2或1上的表位结合。第二car的抗原结合域可以不与位于cd22的氨基酸419-676之间，如cd22的氨基酸505-676之间的表位结合。
[0338]
本发明人已经开发抗cd22 car，其与已知的抗cd22 car相比具有其改善的性质，已知的抗cd22 car包含结合物m971(参见上文wo2016/102965实施例2和3以及haso et al(2013)，其内容在此通过引用并入)。car的抗原结合域基于cd22结合物cd22alab，其具有以下鉴定的cdr和vh/vl区。
[0339]
因此，本公开还提供了car，其包含cd22结合域，该cd22结合域包含
[0340]
a)重链可变区(vh)，其具有有以下序列的互补决定区(cdr)：
[0341]
cdr1
–
nywin(seq id no.15)；
[0342]
cdr2
–
niypsdsftnynqkfkd(seq id no.16)
[0343]
cdr3
–
dtqerswyfdv(seq id no.17)；和
[0344]
b)轻链可变区(vl)，其具有有以下序列的cdr：
[0345]
cdr1
–
rssqslvhsngntylh(seq id no.18)；
[0346]
cdr2
–
kvsnrfs(seq id no.19)
[0347]
cdr3
–
sqsthvpwt(seq id no.20)。
[0348]
可能在该或每个cdr中引入一个或多个突变(取代、添加或缺失)，而不对cd22结合活性产生负面影响。例如，每个cdr可以具有一个、两个或三个氨基酸突变。
[0349]
本公开的car可以包含以下氨基酸序列之一：
[0350]
seq id no.25(鼠cd22alab scfv序列)
[0351]
qvqlqqpgaelvrpgasvklsckasgytftnywinwvkqrpgqglewigniypsdsftnynqkfkdkatltvdkssstaymqlssptsedsavyyctrdtqerswyfdvwgagttvtvssdvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlglyfcsqsthvpwtfgggtkleik
[0352]
seq id no.26(人源化cd22alab scfv序列)
[0353]
evqlvesgaevkkpgssvkvsckasgytftnywinwvrqapgqglewigniypsdsftnynqkfkdratltvdkststaylelrnlrsddtavyyctrdtqerswyfdvwgqgtlvtvssdivmtqspatlsvspgeratlscrssqslvhsngntylhwyqqkpgqaprlliykvsnrfsgvparfsgsgsgveftltisslqsedfavyycsqsthvpwtfgqgtrleik
[0354]
scfv可以是vh-vl方向(如seq id no.25和26所示)或vl-vh方向。
[0355]
本公开的car可以包含以下vh序列之一：
[0356]
seq id no.21(鼠cd22alab vh序列)qvqlqqpgaelvrpgasvklsckasgytftnywinwvkqrpgqglewigniypsdsftnynqkfkdkatltvdkssstaymqlssptsedsavyyctrdtqerswyfdvwgagttvtvss
[0357]
seq id no.22(人源化cd22alab vh序列)
[0358]
evqlvesgaevkkpgssvkvsckasgytftnywinwvrqapgqglewigniypsdsftnynqkfkdratltvdkststaylelrnlrsddtavyyctrdtqerswyfdvwgqgtlvtvss
[0359]
本公开的car可以包含以下vl序列之一：
[0360]
seq id no.23(鼠cd22alab vl序列)
[0361]
dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlglyfcsqsthvpwtfgggtkleik
[0362]
seq id no.24(人源化cd22alab vl序列)
[0363]
divmtqspatlsvspgeratlscrssqslvhsngntylhwyqqkpgqaprlliykvsnrfsgvparfsgsgsgveftltisslqsedfavyycsqsthvpwtfgqgtrleik
[0364]
本公开的car可以包含如seq id no.25、26、21、22、23或24所示序列的变体，其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，前提是变体序列保留结合cd22的能力(在与互补vl或vh域结合时，如适用)。
[0365]
已知其他抗cd22抗体，如小鼠抗人cd22抗体1d9-3、3b4-13、7g6-6、6c4-6、4d9-12、5h4-9、10c1-d9、15g7-2、2b12-8、2c4-4和3e10-7；以及人源化抗人cd22抗体lt22和奥英妥珠单抗(inotuzumab)(g5_44)。表1汇总了vh、vl和cdr序列(粗体和下划线)以及对于各个抗体cd22上的靶表位的位置。这些抗体(或其cdr序列)适用于本发明的cd22 car。
[0366]
表1
[0367]
[0368]
[0369]
[0370]
[0371][0372]
本公开还提供了car，其包含cd22结合域，该cd22结合域包含
[0373]
a)重链可变区(vh)，其具有有以下序列的互补决定区(cdr)：
[0374]
cdr1
–
nfama(seq id no.101)；
[0375]
cdr2
–
sistgggntyyrdsvkg(seq id no.102)
[0376]
cdr3
–
qrnyydgsydyegytmda(seq id no.103)；和
[0377]
b)轻链可变区(vl)，其具有有以下序列的cdr：
[0378]
cdr1
–
rssqdignylt(seq id no.104)；
[0379]
cdr2
–
gaikled(seq id no.105)
[0380]
cdr3
–
lqsiqyp(seq id no.106)。
[0381]
可能在该或每个cdr中引入一个或多个突变(取代、添加或缺失)，而不对cd22结合活性产生负面影响。例如，每个cdr可以具有一个、两个或三个氨基酸突变。
[0382]
本公开的car可以包含以下vh序列：
[0383]
seq id no.63(9a8-1 vh序列)
[0384]
evqlvesggglvqpgrslklscaasgftfsnfamawvrqpptkglewvasistgggntyyrdsvkgrftisrddakntqylqmdslrsedtatyycarqrnyydgsydyegytmdawgqgtsvtvss
[0385]
本公开的car可以包含以下vl序列：
[0386]
seq id no.64(9a8-1 vl序列)
[0387]
diqmtqspsslsaslgdrvtitcrssqdignyltwfqqkvgrsprrmiygaikledgvpsrfsgsrsgsdysltisslesedvadyqclqsiqypftfgsgtkleik
[0388]
scfv可以是vh-vl方向或vl-vh方向。
[0389]
本公开的car可以包含如seq id no.63或64所示序列的变体，其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，前提是变体序列保留结合cd22的能力(在与互补vl或vh域结合时，如适用)。
[0390]
b细胞个体发生和后续肿瘤过程中的b细胞抗原表达
[0391]
cd19被广泛认为是泛b抗原，尽管非常偶尔，它可能表现出一些谱系不忠。cd19分子由被较小的域和较长的胞质内尾分开的两个细胞外igsf域组成，该较长的胞质内尾几乎与分子的细胞外部分一样大，携带一个itam。cd19是b细胞发育和活化的关键分子。cd22是igsf分子，其可能存在两种同等型，一种具有7个域以及由3个itim(免疫受体酪氨酸抑制基序)和1个itam组成的胞质内尾；并且剪接变体替代地由5个胞外域和携带1个itim的胞质内尾组成。cd22被认为是参与控制b细胞对抗原的应答的抑制性受体。与cd19一样，cd22被广泛认为是泛b抗原，尽管已描述在一些非淋巴样组织上表达(wen et al.(2012)j.immunol.baltim.md 1950 188,1075
–
1082)。用治疗性单克隆抗体和免疫缀合物靶向cd22已进入临床试验。已经描述了cd22特异性car的生成(haso et al,2013,blood:volume 121；7:1165-74,and james et al 2008,journal of immunology,volume 180；issue 10；pages 7028-38)。
[0392]
对b细胞白血病的详细免疫分型研究表明，表面cd19总是存在，表面cd22几乎总是存在。例如，raponi等人(2011，如上)研究了427例b-all的表面抗原表型并发现341例研究病例中存在cd22。
[0393]
上述car19靶向后cd19下调的可能性可以用goldie-coldman假说来解释。goldie-coldman假说预测肿瘤细胞以取决于其固有遗传不稳定性的速率突变为抗性表型，以及癌症将含有抗性克隆的概率取决于突变率和肿瘤的大小。虽然癌细胞可能难以对细胞毒性t细胞的直接杀伤产生固有抗性，但抗原损失仍然是可能的。事实上，这种现象在靶向黑色素瘤抗原和ebv驱动的淋巴瘤之前已有报道。根据goldie-coldman假说，治愈的最佳机会将是同时攻击非交叉抗性靶标。鉴于cd22几乎在所有b-all病例中均有表达，cd19以及cd22的同时car靶向可能减少抗性cd19阴性克隆的出现。
[0394]
抗原结合域
[0395]
抗原结合域是识别抗原的car的部分。本领域已知许多抗原结合域，包括基于抗体、抗体模拟物和t细胞受体的抗原结合位点的域。例如，抗原结合域可能包含：衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scfv)；靶抗原的天然配体；对靶标具有足够亲和力的肽；单域抗体；人工单一结合物，如darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)；或衍生自t细胞受体的单链。
[0396]
与cd19结合的car的抗原结合域可以是能够结合cd19的任何域。例如，抗原结合域
可以包含表1所述的cd19结合物。
[0397]
与cd19结合的car的抗原结合域可以包含衍生自表2中所示的cd19结合物之一的序列。
[0398]
表2
[0399][0400][0401]
与cd22结合的car的抗原结合域可以是能够结合cd22的任何域。例如，抗原结合域可以包括如表3所述的cd22结合物。
[0402]
表3
[0403][0404][0405]
间隔物域
[0406]
car包含间隔物序列以将抗原结合域与跨膜域连接，并在空间上将抗原结合域与胞内域分离。柔性间隔物允许抗原结合域以不同方向定向，以促进结合。
[0407]
在本发明的细胞中，第一和第二car可以包含不同的间隔物分子。例如，间隔物序列可以包含igg1 fc区、igg1铰链或人cd8柄或小鼠cd8柄。间隔物也可以包含与igg1 fc区、igg1铰链或cd8柄具有相似的长度和/或域间距特性的替代接头序列。可以改变人igg1间隔物以去除fc结合基序。
[0408]
抗cd19 car的间隔物可以包含cd8柄间隔物，或长度相当于cd8柄间隔物的间隔物。抗cd19 car的间隔物可以具有至少30个氨基酸或40个氨基酸。它可以具有35-55个氨基酸，例如40-50个氨基酸。它可以具有约46个氨基酸。
[0409]
抗cd22 car的间隔物可以包括igg1铰链间隔物，或长度相当于igg1铰链间隔物的间隔物。抗cd22 car的间隔物可以具有少于30个氨基酸或少于25个氨基酸。它可以具有15-25个氨基酸之间，例如18-22个氨基酸之间。它可以具有约20个氨基酸。
[0410]
这些间隔物的氨基酸序列的实例在以下给出：
[0411]
seq id no.65(人igg1的铰链-ch2ch3)
[0412]
aepkspdkthtcppcpappvagpsvflfppkpkdtlmiartpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkkd
[0413]
seq id no.66(人cd8柄):
[0414]
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdi
[0415]
seq id no.67(人igg1铰链):
[0416]
aepkspdkthtcppcpkdpk
[0417]
seq id no.68(cd2胞内域)
[0418]
keitnaletwgalgqdinldipsfqmsddiddikwektsdkkkiaqfrkeketfkekdtyklfkngtlkikhlktddqdiykvsiydtkgknvlekifdlkiqervskpkiswtcinttltcevmngtdpelnlyqdgkhlklsqrvithkwttslsakfkctagnkvskessvepvscpekgld
[0419]
seq id no.69(cd34胞内域)
[0420]
sldnngtatpelptqgtfsnvstnvsyqetttpstlgstslhpvsqhgneattnitettvkftstsvitsvygntnssvqsqtsvistvfttpanvstpettlkpslspgnvsdlsttstslatsptkpytssspilsdikaeikcsgirevkltqgicleqnktsscaefkkdrgeglarvlcgeeqadadagaqvcslllaqsevrpqclllvlanrteissklqlmkkhqsdlkklgildfteqdvashqsysqkt
[0421]
由于car通常是同源二聚体(参见图1a)，交叉配对可能导致异源二聚体嵌合抗原受体。由于很多原因这是不希望的，例如：(1)在靶细胞上的表位的“水平”可能不同，因此交叉配对的car可能只能与一种抗原结合；(2)来自两种不同scfv的vh和vl可能交换，并且不能识别靶标或更差地识别非预期和不可预测的抗原。第一car的间隔物可以与第二car的间隔物足够不同以避免交叉配对。第一间隔物的氨基酸序列可以与第二间隔物在氨基酸水平上共享低于50％、40％、30％或20％的同一性。
[0422]
卷曲螺旋域
[0423]
car通常包含连接抗原结合域和跨膜域的间隔物序列。间隔物允许抗原结合域具有适当的方向和距离。间隔物还在配体接合时提供与磷酸酶的分离。
[0424]
本发明的car可以包含卷曲螺旋间隔物域。特别地，cd22特异性car可以包含卷曲螺旋间隔物域。与本领域之前描述的间隔物相比，卷曲螺旋间隔物域提供了许多优势。
[0425]
卷曲螺旋是其中2至7个α螺旋像绳索的链一样缠绕在一起的结构基序(图7)。许多内源性蛋白包含卷曲螺旋域。卷曲螺旋域可能参与蛋白质折叠(例如，与同一蛋白质链内的若干α螺旋基序相互作用)或负责蛋白质-蛋白质相互作用。在后一种情况下，卷曲螺旋可以启动同源或异源寡聚体结构。
[0426]
如本文所用，术语“多聚体”和“多聚化”是同义词，并且可与“寡聚体”和“寡聚化”互换。
[0427]
卷曲螺旋域的结构在本领域是众所周知的。例如，如lupas&gruber(advances in protein chemistry；2007；70；37-38)所述。
[0428]
卷曲螺旋通常含有疏水性(h)和带电荷(c)氨基酸残基的重复模式hxxhcxc，称为
七肽重复(heptad repeat)。七肽重复中的位置通常标记为abcdefg，其中a和d是疏水位置，通常由异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸占据。将具有这种重复模式的序列折叠成α螺旋二级结构，导致疏水残基呈现为“条带”，以左手方式轻轻卷绕在螺旋周围，形成两亲性结构。两个此类螺旋在细胞质中排列自己最有利的方法是将疏水链彼此缠绕夹在亲水氨基酸之间。因此，是疏水性表面的埋藏为寡聚化提供了热力学驱动力。卷曲螺旋界面中的填充物非常紧密，a和d残基的侧链之间具有几乎完全的范德华(van der waals)接触。
[0429]
α螺旋可以是平行的，也可以是反平行的，并且通常采用左手超卷曲。虽然不受青睐，但在自然界和设计的蛋白质中也观察到一些右手卷曲螺旋。
[0430]
卷曲螺旋域可以是能够形成卷曲螺旋多聚体的任何卷曲螺旋域，使得形成包含卷曲螺旋域的car或辅助多肽的复合物。
[0431]
该序列与卷曲螺旋域的最终折叠结构之间的关系已在本领域被充分了解(mahrenholzet al；molecular&cellular proteomics；2011；10(5):m110.004994)。因此，卷曲螺旋域可以是合成生成的卷曲螺旋域。
[0432]
含有卷曲螺旋域的蛋白质包括但不限于驱动蛋白马达蛋白、丁型肝炎δ抗原、古细菌盒c/d srnp核心蛋白、软骨寡聚基质蛋白(comp)、甘露糖结合蛋白a、卷曲螺旋丝氨酸富集蛋白1、多肽释放因子2、snap-25、snare、lac阻遏物或载脂蛋白e。
[0433]
各种卷曲螺旋域的序列如下所示：
[0434]
驱动蛋白马达蛋白：平行同源二聚体(seq id no.70)
[0435]
mhaalstevvhlrqrteellrcneqqaaeletckeqlfqsnmerkelhntvmdlrgn
[0436]
丁型肝炎δ抗原：平行同源二聚体(seq id no.71)
[0437]
gredileqwvsgrkkleelerdlrklkkikkleednpwlgnikgiigky
[0438]
古细菌盒c/d srnp核心蛋白：反平行异源二聚体(seq id no.72)
[0439]
ryvvalvkaleeidesinmlneklediravkeseitekfekkirelrelrrdvereieevm
[0440]
甘露糖结合蛋白a：平行同源三聚体(seq id no.73)
[0441]
aievanklmeaeintlkskleltnklhafsm
[0442]
卷曲螺旋丝氨酸富集蛋白1：平行同源三聚体(seq id no.74)
[0443]
ewealekklaalesklqalekklealehg
[0444]
多肽释放因子2：反平行异源三聚体
[0445]
链a：inpvnnriqdltersdvlrgyldy(seq id no.75)
[0446]
链b：
[0447]
vvdtldqmkqgledvsgllelaveaddeetfneavaeldaleeklaqlefr(seq id no.76)
[0448]
snap-25和snare：平行异源四聚体
[0449]
a链：
[0450]
ietrhseiiklensirelhdmfmdmamlvesqgemidrieynvehavdyve(seq id no.77)
[0451]
b链：
[0452]
alseietrhseiiklensirelhdmfmdmamlvesqgemidrieynvehavdyveravsdtkkavky(seq id no.78)
[0453]
链c：
[0454]
eleemqrradqladeslestrrmlqlveeskdagirtlvmldeqgeqlerieegmdqinkdmkeaeknl
(seq id no.79)
[0455]
链d：
[0456]
ietrhseiiklensirelhdmfmdmamlvesqgemidrieynvehavdyve(seq id no.80)
[0457]
lac阻遏物：平行同源四聚体
[0458]
spraladslmqlarqvsrle(seq id no.81)
[0459]
载脂蛋白e：反平行异源四聚体
[0460]
sgqrwelalgrfwdylrwvqtlseqvqeellssqvtqelralmdetmkelkaykseleeqltarlskelqaaqarlgadmedvcgrlvqyrgevqamlgqsteelrvrlashlrklrkrllrdaddlqkrlavyqa(seq id no.82)
[0461]
卷曲螺旋域能够寡聚化。在某些实施方案中，卷曲螺旋域可能能够形成三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或七聚体。
[0462]
卷曲螺旋域不同于亮氨酸拉链。亮氨酸拉链是作为二聚化域发挥功能的超二级结构。它们的存在在平行的α螺旋中生成粘附力。单个亮氨酸拉链由以大约7个残基间隔的多个亮氨酸残基组成，其形成两亲性α螺旋，疏水区沿一侧走行。这个疏水区为二聚化提供了区域，允许基序“拉链”在一起。亮氨酸拉链的长度通常为20至40个氨基酸，例如大约30个氨基酸。
[0463]
亮氨酸拉链通常由两种不同的序列形成，例如酸性亮氨酸拉链与碱性亮氨酸拉链异源二聚化。亮氨酸拉链的实例是对接域(ddd1)和锚定域(ad1)，下面将更详细地描述。
[0464]
亮氨酸拉链形成二聚体，而本发明的卷曲螺旋间隔物形成多聚体(三聚体及以上)。亮氨酸拉链在序列的二聚化部分异源二聚化，而卷曲螺旋域同源二聚化。
[0465]
可通过增加car的效价来提供超敏car。特别地，由于增加了存在的itam的数量和寡聚体car复合物的亲合力，使用能够相互作用以形成包含两个以上卷曲螺旋域以及因此两个以上的car的多聚体的卷曲螺旋间隔物域，增加对表达低密度配体的靶标的敏感性。
[0466]
因此，本文提供了car形成多肽，其包含能够使至少三种car形成多肽多聚化的卷曲螺旋间隔物域。换句话说，car包含能够形成卷曲螺旋域的三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或七聚体的卷曲螺旋域。
[0467]
能够形成包含两个以上卷曲螺旋域的多聚体的卷曲螺旋域的实例包括但不限于来自软骨寡聚基质蛋白(comp)、甘露糖结合蛋白a、卷曲螺旋丝氨酸富集蛋白1、多肽释放因子2、snap-25、snare、lac阻遏物或载脂蛋白e的多聚体(参见以上seq id no.70-82)。
[0468]
卷曲螺旋域可以是comp卷曲螺旋域。
[0469]
comp是自然界中最稳定的蛋白复合物之一(在0℃-100℃和较宽的ph范围内稳定)，并且仅可以用4-6m盐酸胍变性。comp卷曲螺旋域能够形成五聚体。comp也是天然表达在细胞外空间的内源性表达的蛋白。与合成间隔物相比，这降低免疫原性的风险。此外，还解析comp卷曲螺旋基序的晶体结构，这给出间隔物长度的准确估计(图8)。comp结构的长度为约5.6nm(与来自人igg的铰链和ch2ch3域(约8.1nm)相比)。
[0470]
卷曲螺旋域可以包含seq id no.83所示的序列或其片段，或由其组成。
[0471]
seq id no.83
[0472]
dlgpqmlrelqetnaalqdvrellrqqvreitflkntvmecdacg
[0473]
如图8所示，有可能截短n端的comp卷曲螺旋域并保留表面表达。因此，卷曲螺旋域
可以包含在n端截短的seq id no.83的截短型式或由其组成。截短的comp可以包含seq id no.83的5个c端氨基酸，即序列cdacg。截短的comp可以包含5-44个氨基酸，例如，至少5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。截短的comp可以对应于seq id no.83的c端。例如，包含20个氨基酸的截短comp可以包含序列qqvreitflkntvmecdacg(seq id no.84)。截短的comp可以保留参与多聚化的半胱氨酸残基。截短的comp可以保留形成多聚体的能力。
[0474]
已知各种卷曲螺旋域形成六聚体，如衍生自hiv的gp41，以及n.zaccai et al.(2011)nature chem.bio.,(7)935-941)描述的人工蛋白质设计的六聚体卷曲螺旋。gcn4-p1亮氨酸拉链的突变体形式形成七聚体卷曲螺旋结构(j.liu.et al.,(2006)pnas(103)15457-15462)。
[0475]
卷曲螺旋域可以包含上述卷曲螺旋域之一的变体，前提是变体序列保留形成卷曲螺旋寡聚体的能力。例如，卷曲螺旋域可以包含如seq id no.83或70-82所示序列的变体，其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，前提是变体序列保留形成卷曲螺旋寡聚体的能力。
[0476]
通过程序如blast可以很容易地确定两个多肽序列之间的百分比同一性，blast可在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov免费获得。
[0477]
包含卷曲螺旋域的car在wo2016/151315中更详细描述，其内容整体在此通过引用并入。
[0478]
跨膜域
[0479]
跨膜域是跨越膜的car的序列。
[0480]
跨膜域可以是膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是由若干疏水残基组成的α螺旋。可以使用任何跨膜蛋白的跨膜域以供应本发明的跨膜部分。蛋白质跨膜域的存在和跨度可以由本领域技术人员使用tmhmm算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/)来确定。进一步，蛋白质的跨膜域是相对简单的结构，即预测形成足够长以跨越膜的疏水性α螺旋的多肽序列，也可以使用人工设计的tm域(us 7052906 b1描述合成的跨膜组分)。
[0481]
跨膜域可以衍生自cd28，其给出良好的受体稳定性。
[0482]
跨膜域可以衍生自人tyrp-1。tyrp-1跨膜序列如seq id no.85所示。
[0483]
seq id no.85
[0484]
iiaiavvgalllvalifgtasyli
[0485]
激活胞内域
[0486]
胞内域是car的信号传递部分。抗原识别后，受体簇、天然cd45和cd148从突触中排除，并将信号传递给细胞。最常用的胞内域组分是含有3个itam的cd3-ζ的胞内域组分。这在抗原被结合后将激活信号传递给t细胞。cd3-ζ可能不提供完全有效(competent)的激活信号，并且可能需要额外的共刺激信号。例如，嵌合cd28和ox40可以与cd3-ζ一起用于传递增殖/存活信号，或者三者都可以一起使用。
[0487]
本发明的细胞包含两个car，各自具有胞内域。
[0488]
第一car的胞内域可以包含：
[0489]
(i)含有itam的胞内域，如来自cd3ζ的胞内域；和/或
[0490]
(ii)传递存活信号的域，例如tnf受体家族胞内域，如ox-40或4-1bb。
[0491]
第二car的胞内域可以包含：
[0492]
(i)含有itam的胞内域，如来自cd3ζ的胞内域；和/或
[0493]
(ii)共刺激域，如来自cd28的胞内域。
[0494]
在这种排列中，共刺激和存活信号产生域在or门中的两个(或多个)car之间“共享”。例如，当or门具有两个car，car a和car b时，car a可以包含共刺激域(例如cd28胞内域)，car b可以包含tnf受体家族胞内域，如ox-40或4-1bb。
[0495]
含有itam基序的胞内域可以充当本发明中的激活胞内域。已知若干蛋白质含有具有一个或多个itam基序的胞内域。此类蛋白的实例包括cd3ε链、cd3γ链和cd3δ链等。itam基序可以很容易地识别为由任何两个其他氨基酸与亮氨酸或异亮氨酸分开的酪氨酸，得到签名yxxl/i。通常，但并不总是，这些基序中的两个在分子尾由6至8个氨基酸分开(yxxl/ix(6-8)yxxl/i)。因此，本领域技术人员可以很容易地找到含有一个或多个itam的现有蛋白质来传递激活信号。进一步，鉴于基序简单且不需要复杂的二级结构，本领域技术人员可以设计含有人工itam的多肽来传递激活信号(参见wo 2000/063372，其与合成信号传导分子相关)。
[0496]
car的跨膜及细胞内t细胞信号传导域(胞内域)具有激活胞内域，可以包含如seq id no.86、87或88所示的序列，或其具有至少80％序列同一性的变体。
[0497]
seq id no.86，其包含cd28跨膜域和cd3 z胞内域
[0498]
fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0499]
seq id no.87，其包含cd28跨膜域以及cd28和cd3ζ胞内域
[0500]
fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0501]
seq id no.88，其包含cd28跨膜域以及cd28、ox40和cd3ζ胞内域。
[0502]
fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlakirvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0503]
变体序列可以与seq id no.86、87或88具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，前提是该序列提供有效的跨膜域和有效的细胞内t细胞信号传导域。
[0504]“分裂”or门胞内域
[0505]
本发明提供了or门，其中共刺激/存活信号域在两个car之间“分裂”。
[0506]
在这方面，本发明提供了在细胞表面共表达第一嵌合抗原受体(car)和第二car的细胞，该第一car包含与cd19结合的抗原结合域，该第二car包含与cd22结合的抗原结合域，每种car均包含细胞内信号传导域，其中第一car的细胞内信号传导域包含tnf受体家族胞内域；并且第二car的细胞内信号传导域包含共刺激域。
[0507]
第一car的细胞内信号传导域包含tnf受体家族胞内域并且不包含共刺激域(如cd28胞内域)。第二car的细胞内信号传导域包含共刺激域并且不包含传递存活信号的域(如tnf受体家族胞内域)。
[0508]
共刺激域可以是cd28共刺激域。cd28共刺激域可以具有如seq id no.89所示的序
列。
[0509]
seq id no.89(cd28共刺激胞内域)
[0510]
skrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs
[0511]
本发明的car可以包含如seq id no.89所示序列的变体，其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，前提是变体序列保留在抗原识别后共刺激t细胞的能力，即向t细胞提供信号2。
[0512]
tnf受体家族胞内域可以是ox40或4-1bb胞内域。ox40胞内域可以具有如seq id no.90所示的序列。4-1bb胞内域可以具有如seq id no.91所示的序列。
[0513]
seq id no.90(ox40胞内域)
[0514]
rdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlaki
[0515]
seq id no.91(4-1bb胞内域)
[0516]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel
[0517]
本发明的car可以包含如seq id no.90或91所示序列的变体，其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，前提是变体序列保留在抗原识别后向t细胞传递存活信号的能力。
[0518]
第一和/或第二car的细胞内信号传导域也可以包含含有itam的域，如cd3ζ域。cd3ζ域可以具有如seq id no.92所示的序列。
[0519]
seq id no.92(cd3ζ胞内域)
[0520]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0521]
本发明的car可以包含如seq id no.92所示序列的变体，其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，前提是变体序列保留在抗原识别后诱导t细胞信号传导的能力，即向t细胞提供信号1。
[0522]
第一car可以具有以下结构：
[0523]
agb1间隔物1-tm1-tnf-itam
[0524]
其中：
[0525]
agb1是第一car的抗原结合域；
[0526]
间隔物1是第一car的间隔物；
[0527]
tm1是第一car的跨膜域；
[0528]
tnf是tnf受体胞内域；和
[0529]
itam是含有itam的胞内域。
[0530]“tnf”可以是tnf受体胞内域，如ox40或4-1bb胞内域。
[0531]“itam”可以是cd3ζ胞内域。
[0532]
第二car可以具有以下结构：
[0533]
agb2-间隔物2-tm2-costim-itam
[0534]
其中：
[0535]
agb2是第二car的抗原结合域；
[0536]
间隔物2是第二car的间隔物；
[0537]
tm2是第二car的跨膜域；
[0538]
costim是共刺激域；和
[0539]
itam是含有itam的胞内域。
[0540]“costim”可以是cd28共刺激域。
[0541]
还提供了编码具有“分裂”胞内域的第一和第二嵌合抗原受体(car)两者的核酸序列；以及包含两种核酸的试剂盒，一种核酸编码第一car并且一种核酸编码第二car，包含如上定义的分裂胞内域。
[0542]
共表达位点
[0543]
本发明的第二方面涉及编码第一和第二car的核酸。
[0544]
核酸可以产生包含通过切割位点连接的两种car分子的多肽。切割位点可能是自切割的，使得当多肽产生时，它立即切割成第一和第二car，而不需要任何外部切割活性。
[0545]
已知多种自切割位点，包括口蹄疫病毒(fmdv)2a肽和类似序列(donnelly et al,journal of general virology(2001),82,1027
–
1041)，例如，与来自thosea asigna病毒的2a样序列一样，其具有如seq id no.12所示的序列：
[0546]
seq id no.93
[0547]
raegrgslltcgdveenpgp。
[0548]
这些序列也可以称为顺式作用水解酶元件(chysel)序列。
[0549]
共表达序列可以是内部核糖体进入序列(ires)。共表达序列可以是内部启动子。
[0550]
核酸构建体可以含有多个共表达位点，导致产生多个多肽。例如，构建体可以包括多个2a样序列，其可以相同或不同。
[0551]
调节car的活性
[0552]
增强itam磷酸化
[0553]
在体内t细胞活化期间(在图10a中示意性例示)，t细胞受体(tcr)的抗原识别导致cd3ζ上的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)磷酸化。磷酸化的itam由zap70 sh2域识别，导致t细胞活化。
[0554]
t细胞活化使用动力学分离将tcr的抗原识别转化为下游激活信号。简而言之：在基态下，t细胞膜上的信号传导组分处于动态稳态，由此去磷酸化的itam比磷酸化的itam更受青睐。这是由于跨膜cd45/cd148磷酸酶的活性高于膜拴系激酶(membrane-tethered kinases)，如lck。当t细胞通过同源抗原的t细胞受体(或car)识别接合靶细胞时，形成紧密的免疫突触。t细胞和靶膜的紧密并列排除cd45/cd148，因为它们的大胞外域不能进入突触。在没有磷酸酶的情况下，突触中高浓度的t细胞受体相关联itam和激酶的分离导致磷酸化itam更受青睐的状态。zap70识别磷酸化itam的阈值并传播t细胞激活信号。
[0555]
该过程在car介导的t细胞活化期间基本相同。活化car在其细胞内信号传导域中包含一个或多个itam，通常是因为信号传导域包含cd3ζ的胞内域。car的抗原识别导致car信号传导域中的itam磷酸化，引起t细胞活化。
[0556]
如图10b所示意性例示，抑制性免疫受体如pd1引起磷酸化itam的去磷酸化。pd1具有在其胞内域中的itim，其可以由分子如ptpn6(shp-1)和ptpn11(shp-2)的sh2域识别。在识别后，将ptpn6募集到近膜区，并且其磷酸酶域随后去磷酸化抑制免疫激活的itam域。
[0557]
调节car-t细胞的活性
[0558]
检查点抑制
[0559]
car介导的t细胞活化由抑制性免疫受体，如ctla4、pd-1、lag-3、2b4或btla 1介导(如上所述，图示例示在图10b)中。
[0560]
pd-1/pd-l1
[0561]
如上所述，在癌症疾病状态下，肿瘤细胞上的pd-l1与t细胞上的pd-1相互作用降低t细胞活化，从而阻碍免疫系统攻击肿瘤细胞的努力。使用阻断pd-l1与pd-1受体相互作用的抑制剂可以防止癌症以这种方式逃避免疫系统。若干pd-1和pd-l1抑制剂正在临床试验用于晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌和霍奇金淋巴瘤以及其他癌症类型。一些此类抑制剂现已批准，包括pd1抑制剂纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)以及pd-l1抑制剂阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)。
[0562]
ctla4
[0563]
ctla4是免疫球蛋白超家族的成员，由活化t细胞表达，并向t细胞传递抑制信号。ctla4与t细胞共刺激蛋白cd28同源，并且两种分子均与抗原呈递细胞上的cd80和cd86(也分别称为b7-1和b7-2)结合。ctla-4结合cd80和cd86的亲和力(affinity)和亲合力(avidity)高于cd28，因此使其能够超过cd28对其配体的竞争。ctla4向t细胞传递抑制性信号，而cd28传递刺激性信号。
[0564]
针对ctla4的拮抗抗体包括伊匹单抗(ipilimumab)和替西木单抗(tremelimumab)。
[0565]
lag-3
[0566]
淋巴细胞活化基因3，也称为lag-3和cd223，是免疫检查点受体，对t细胞功能具有多种生物学效应。
[0567]
针对lag3的抗体包括relatlimab，其目前处于1期临床测试，其他一些处于临床前开发阶段。lag-3可能是比ctla-4或pd-1更好的检查点抑制剂靶标，因为针对这两个检查点的抗体仅激活效应t细胞，并且不抑制treg活性，而拮抗剂lag-3抗体可以激活效应t细胞(通过将lag-3抑制信号下调到预激活的lag-3 细胞中)和抑制诱导的(即抗原特异性)treg抑制活性两者。涉及lag-3抗体和ctla-4或pd-1抗体的联合疗法也正在进行中。
[0568]
显性阴性shp
[0569]
wo2016/193696描述了在t细胞：靶细胞突触处能够调节磷酸化：去磷酸化的平衡的各种不同类型的蛋白质。例如，wo2016/193696描述了shp-1或shp-2的截短形式，其包含一个或两个sh2域，但缺乏磷酸酶域。当在car-t细胞中表达时，这些分子充当野生型shp-1和shp-2的显性阴性型式并且与内源性分子竞争结合磷酸化itim。
[0570]
野生型shp-1和shp-2的这些显性阴性型式阻断或减少由抑制性免疫受体如ctla4、pd-1、lag-3、2b4或btla 1介导的抑制，并且打破t细胞：靶细胞突触处的磷酸化：去磷酸化的平衡以有利于itam磷酸化，导致t细胞活化。
[0571]
本发明的细胞可以表达截短的蛋白，该截短的蛋白包含来自结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)但缺乏磷酸酶域的蛋白质的sh2域。截短的蛋白可以包含一个或两个shp-1sh2域，但缺乏shp-1磷酸酶域。或者，截短的蛋白可以包含一个或两个shp-2sh2域，但缺乏shp-2磷酸酶域。
[0572]
shp-1
[0573]
含src同源区2域的磷酸酶-1(shp-1)是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成员。其也称为ptpn6。
[0574]
shp-1的n端区含有两个串联的sh2域，其介导shp-1和其底物的相互作用。c端区含有酪氨酸蛋白磷酸酶域。
[0575]
shp-1能够结合并传播来自许多抑制性免疫受体或含有itim的受体的信号。此类受体的实例包括但不限于pd1、pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1和kir3dl3。
[0576]
人shp-1蛋白的uniprotkb登录号为p29350。
[0577]
截短的shp-1可以包含如下seq id no:94所示的shp-1串联sh2域，或由其组成。
[0578]
shp-1sh2完整域(seq id no:94)
[0579]
mvrwfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytqqqgvlqdrdgtiihlkyplncsdptserwyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpyy
[0580]
shp-1在序列的n端末端具有两个sh2域，位于残基4-100和110-213。截短的shp-1可以包含如seq id no.95和96所示序列中的一个或两个。shp-1sh2 1(seq id no:95)
[0581]
wfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytqqqgvlqdrdgtiihlkypl
[0582]
shp-1sh2 2(seq id no.96)
[0583]
wyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpy
[0584]
截短的shp-1可以包含seq id no:94、95或96的变体，其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，前提是变体序列是具有所需特性的sh2域序列。换句话说，变体序列应该能够与pd1、pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1或kir3dl3中至少一个的细胞质尾的磷酸化酪氨酸残基结合，从而允许shp-1的募集。
[0585]
shp-2
[0586]
shp-2，也称为ptpn11、ptp-1d和ptp-2c，是蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)家族的成员。与ptpn6一样，shp-2具有域结构，其由在其n端的两个串联sh2域，随后是蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)域组成。在非活性状态下，n端sh2域结合ptp域并且阻断潜在底物进入活性位点。因此，shp-2被自动抑制。在与靶磷酸酪氨酸残基结合后，n端sh2域从ptp域释放，通过解除自动抑制来催化激活酶。
[0587]
人shp-2的uniprotkb登录号为p35235-1。
[0588]
截短的shp-2可以包含如下seq id no:99所示的shp-1串联sh2域，或由其组成。shp-1在序列的n端末端具有两个sh2域，位于残基6-102和112-216。截短的shp-2可以包含如seq id no.97和98所示序列中的一个或两个。
[0589]
shp-2第一sh2域(seq id no:97)
[0590]
wfhpnitgveaenllltrgvdgsflarpsksnpgdftlsvrrngavthikiqntgdyydlyggekfatlaelvqyymehhgqlkekngdvielkypl
[0591]
shp-2第二sh2域(seq id no.98)
[0592]
wfhghlsgkeaeklltekgkhgsflvresqshpgdfvlsvrtgddkgesndgkskvthvmircqelkydvgggerfdsltdlvehykknpmvetlgtvlqlkqpl
[0593]
shp-2两个sh2域(seq id no.99)
[0594]
wfhpnitgveaenllltrgvdgsflarpsksnpgdftlsvrrngavthikiqntgdyydlyggekfatlaelvqyymehhgqlkekngdvielkyplncadptserwfhghlsgkeaeklltekgkhgsflvresqshpgdfvlsvrtgddkgesndgkskvthvmircqelkydvgggerfdsltdlvehykknpmvetlgtvlqlkqpl
[0595]
截短的shp-2可以包含seq id no:97、98或99的变体，其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，前提是变体序列是具有所需特性的sh2域序列。换句话说，变异序列应该能够与pd1、pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1或kir3dl3中至少一个的细胞质尾的磷酸化酪氨酸残基结合，从而允许shp-2的募集。
[0596]
调节tgfβ信号传导
[0597]
工程化细胞面临着艰难的微环境，这限制过继免疫治疗。肿瘤微环境中的主要抑制机制之一是转化生长因子β(tgfβ)。tgfβ信号传导途径在控制多种细胞过程的调节信号传导中具有关键作用。tgfβ在t细胞稳态和细胞功能的控制中也发挥核心作用。特别地，tgfβ信号传导与增殖和活化降低的t细胞的免疫抑制状态有关。tgfβ表达与肿瘤的免疫抑制微环境相关联。
[0598]
已知多种癌性肿瘤细胞直接产生tgfβ。除由癌性细胞产生tgfβ外，tgfβ可以由肿瘤部位存在的多种非癌性细胞如肿瘤相关t细胞、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、上皮细胞和基质细胞产生。
[0599]
转化生长因子β受体是丝氨酸/苏氨酸激酶受体超家族。这些受体结合生长因子和细胞因子信号传导蛋白tgfβ超家族的成员。有5种ii型受体(为活化受体)和7种i型受体(为信号传播受体)。
[0600]
还存在辅助性共同受体(也称为ⅲ型受体)。tgfβ配体超家族的每个亚家族与i型和ii型受体结合。
[0601]
三种转化生长因子具有多种活性。tgfβ1和2与癌症有关，它们可能刺激肿瘤干细胞，增加纤维化/促结缔组织增生的反应并抑制肿瘤的免疫识别。
[0602]
tgfβ1、2和3经由与受体tβrⅱ的结合并且然后与tβrⅰ相关联并在tgfβ2的情况下也与tβrⅲ相关联而发出信号。这导致随后通过smad经由tβri进行信号传导。
[0603]
tgfβ通常以前原形式分泌。“前”是进入内质网(er)时切割掉的n端信号肽。“原”在er中切割，但保持共价连接，并在tgfβ周围形成笼，称为隐匿期相关肽(latency associated peptide，lap)。该笼响应于各种蛋白酶(包括凝血酶和金属蛋白酶等)而打开。c端区在其通过蛋白水解切割从原区释放后成为成熟的tgfβ分子。成熟的tgfβ蛋白二聚化产生活性同源二聚体。
[0604]
tgfβ同源二聚体与衍生自tgfβ基因产物的n端区的lap相互作用，形成称为小隐匿复合物(small latent complex，slc)的复合物。该复合物保留在细胞中，直至与另一种蛋白质，细胞外基质(ecm)蛋白(称为隐匿tgfβ结合蛋白(ltbp))结合，其共同形成称为大隐匿复合物(llc)的复合物。llc分泌至ecm。tgfβ由几类蛋白酶(包括金属蛋白酶和凝血酶)从该复合物释放为生物活性形式。
[0605]
显性阴性tgfβ受体
[0606]
活性tgfβ受体(tβr)是异源四聚体，由两个tgfβ受体i(tβri)和两个tgfβ受体ii(tβrii)构成。tgfβ1以隐匿形式分泌，并通过多种机制激活。一旦被激活，它与tβrⅱtβri形成复合物，磷酸化并激活tβri。
[0607]
本发明的细胞表达显性阴性tgfβ受体。显性阴性tgfβ受体可能缺乏激酶域。
[0608]
例如，显性阴性tgfβ受体可以包含为tgf受体ii的单体型式的如seq id no.100所示的序列，或由其组成
[0609]
seq id no.100(dn tgfβrii)
[0610]
tipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdlllvifqvtgisllpplgvaisviiifycyrvnrqqklss
[0611]
据报道，在侵袭性人前列腺癌小鼠模型中，显性阴性tgf-βrii(dntgf-βrii)增强psma靶向car-t细胞增殖、细胞因子分泌、衰竭抗性、长期体内持久性以及诱导肿瘤根除(kloss et al(2018)mol.ther.26:1855-1866)。
[0612]
细胞
[0613]
本发明涉及在细胞表面共表达第一car和第二car的细胞，其中一种car结合cd19，另一种car结合cd22。
[0614]
细胞可以是能够在细胞表面表达car的任何真核细胞，如免疫细胞。
[0615]
特别地，细胞可以是免疫效应细胞，如t细胞或自然杀伤(nk)细胞。
[0616]
t细胞或t淋巴细胞是一类在细胞介导免疫中起核心作用的淋巴细胞。它们可以通过细胞表面上t细胞受体(tcr)的存在与其他淋巴细胞如b细胞和自然杀伤细胞(nk细胞)区分开。t细胞有多种类型，汇总如下。
[0617]
辅助性t辅助细胞(th细胞)在免疫过程中协助其他白细胞，包括b细胞至浆细胞和记忆b细胞的成熟，以及细胞毒性t细胞和巨噬细胞的活化。th在其细胞表面表达cd4。th细胞在其由抗原呈递细胞(apc)表面的mhcⅱ类分子向其呈递肽抗原时变为激活。这些细胞可以分化成若干亚型之一，包括th1、th2、th3、th17、th9或tfh，它们分泌不同的细胞因子，以利于不同类型的免疫应答。
[0618]
细胞毒性t细胞(tc细胞，或ctl)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也与移植排斥有关。ctl在其表面表达cd8。这些细胞通过与所有有核细胞表面存在的mhc i类相关抗原的结合来识别其靶标。通过调节性t细胞分泌的il-10、腺苷和其他分子，可以使cd8 细胞失活至无反应性状态，其预防自身免疫性疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。
[0619]
记忆t细胞是抗原特异性t细胞的亚群，在感染消退后长期持续存在。它们在重新暴露于其同源抗原后迅速扩增为大量效应t细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆t细胞包括三种亚型：中央记忆t细胞(tcm细胞)和两种类型的效应记忆t细胞(tem细胞和temra细胞)。记忆细胞可以是cd4 或cd8 。记忆t细胞通常表达细胞表面蛋白cd45ro。
[0620]
调节性t细胞(treg细胞)，以前被称为抑制性t细胞，对于维持免疫耐受至关重要。它们的主要作用是在免疫反应结束时关闭t细胞介导的免疫，并抑制在胸腺中逃避负选择过程的自身反应性t细胞。
[0621]
已经描述了cd4 treg细胞的两大类——天然存在的treg细胞和适应性treg细胞。
[0622]
天然存在的treg细胞(也称为cd4 cd25 foxp3 treg细胞)出现在胸腺中，并与发育中的t细胞与已用tslp激活的髓样(cd11c )和浆细胞样(cd123 )树突状细胞之间的相互作用有关。天然存在的treg细胞可以通过称为foxp3的细胞内分子的存在与其他t细胞区分。foxp3基因的突变可以阻止调节性t细胞发育，引起致命的自身免疫性疾病ipex。
[0623]
适应性treg细胞(也称为tr1细胞或th3细胞)可能起源于正常免疫应答期间。
[0624]
自然杀伤t(nkt)细胞是一组异质性t细胞，其共享t细胞和自然杀伤细胞两者的特性。这些细胞中的许多识别非多态性cd1d分子，这是结合自身和外来脂质和糖脂的抗原呈递分子。
[0625]
本发明的t细胞可以是以上提及的任何t细胞类型，特别是ctl。
[0626]
自然杀伤(nk)细胞是一类细胞溶解细胞，其形成先天性免疫系统的部分。nk细胞以mhc非依赖性方式提供对病毒感染细胞的先天信号的快速应答
[0627]
将nk细胞(属于先天淋巴样细胞组)定义为大颗粒淋巴细胞(lgl)，并且构成由生成b、t淋巴细胞的共同淋巴样祖先分化的第三类细胞。已知nk细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化和成熟，然后它们在此进入循环。
[0628]
本发明的car细胞可以是以上提及的任何细胞类型。
[0629]
表达car的细胞(如表达car的t或nk细胞)可以从患者自身外周血(第1方)或在造血干细胞移植的背景下从供体外周血(第2方)或来自无关联供体的外周血(第3方)离体产生。
[0630]
本发明还提供了细胞组合物，其包含根据本发明的表达car的t细胞和/或表达car的nk细胞。细胞组合物可以通过用根据本发明的核酸离体转导血样来制备。
[0631]
或者，表达car的细胞可以衍生自可诱导祖细胞或胚胎祖细胞向相关细胞类型(如t细胞)的离体分化。或者，可以使用保留其裂解功能并可以充当治疗药物的永生化细胞系，如t细胞系。
[0632]
在所有这些实施方案中，car细胞通过多种手段之一引入编码car的dna或rna来生成，该手段包括用病毒载体转导、用dna或rna转染。
[0633]
本发明的car t细胞可以是来自受试者的离体t细胞。t细胞可以来自外周血单核细胞(pbmc)样品。在用编码car的核酸进行转导之前，t细胞可能被激活和/或扩增，例如通过抗cd3单克隆抗体治疗。
[0634]
本发明的car t细胞可以通过以下方式制备：
[0635]
(i)从受试者或以上所列其他来源分离含t细胞的样品；以及
[0636]
(ii)用编码第一和第二car的一种或多种核酸序列转导或转染t细胞。
[0637]
然后可以纯化t细胞，例如，根据第一和第二car的共表达进行选择。
[0638]
核酸序列
[0639]
本发明的第二方面涉及一种或多种核酸序列，其编码本发明的第一方面中定义的第一car和第二car。
[0640]
核酸序列可以是，例如rna、dna或cdna序列。
[0641]
核酸序列可以编码与cd19结合的一种嵌合抗原受体(car)和与cd22结合的另一种car。
[0642]
核酸序列可以具有以下结构：
[0643]
agb1-间隔物1-tm1-coexpr-abb2-间隔物2-tm2
[0644]
其中
[0645]
agb1是编码第一car的抗原结合域的核酸序列；
[0646]
间隔物1是编码第一car的间隔物的核酸序列；
[0647]
tm1是编码第一car的跨膜域的核酸序列；
[0648]
coexpr是能够实现共表达的核酸序列
[0649]
agb2是编码第二car的抗原结合域的核酸序列；
[0650]
间隔物2是编码第二car的间隔物的核酸序列；
[0651]
tm2是编码第二car的跨膜域的核酸序列；
[0652]
当核酸序列在t细胞中表达时，编码在切割位点切割的多肽，使得第一和第二car在细胞表面共表达。
[0653]
或者，核酸序列可以具有以下结构：
[0654]
abb2-间隔物2-tm2-coexpr-agb1-间隔物1-tm1
[0655]
其中组分agb1、间隔物1、tm1、coexpr、abb2、间隔物2和tm2如上所定义。
[0656]
为了避免同源重组，可以在编码相同或相似氨基酸序列的序列区使用替代密码子。
[0657]
由于遗传密码的简并性，有可能使用编码相同氨基酸序列的替代密码子。例如，密码子“ccg”和“cca”均编码氨基酸脯氨酸，因此使用“ccg”可以被交换为“cca”，而不影响所翻译蛋白质的序列中该位置的氨基酸。
[0658]
可以用于编码每种氨基酸的替代rna密码子汇总在表4中。
[0659]
表4
[0660][0661]
替代密码子可以用于编码第一car间隔物和第二car间隔物的核酸序列的部分，尤其是如果在第一和第二car中使用相同或相似的间隔物。图5显示了编码间隔物hch2ch3-铰链的两种序列，其中一种已使用替代密码子。
[0662]
替代密码子可以用于编码第一car跨膜域和第二car跨膜的核酸序列的部分，尤其是如果第一和第二car使用相同或相似的跨膜域。图5显示了编码cd28跨膜域的两种序列，其中一种已使用替代密码子。
[0663]
替代密码子可以用于编码第一car的全部或部分胞内域和第二car的全部或部分胞内域的核酸序列的部分。替代密码子可以用于cd3ζ胞内域。图5显示了编码cd3ζ胞内域的两种序列，其中一种已使用替代密码子。
[0664]
替代密码子可以用于一个或多个共刺激域，如cd28胞内域。
[0665]
替代密码子可以用于一个或多个传递存活信号的域，如ox40和41bb胞内域。
[0666]
替代密码子可以用于编码cd3ζ胞内域的核酸序列的部分和/或编码一个或多个共刺激域的核酸序列的部分和/或编码一个或多个传递存活信号的域的核酸序列的部分。
[0667]
载体
[0668]
本发明还提供了包含一个或多个编码car的核酸序列的载体或载体试剂盒。可以使用此类载体以将核酸序列引入宿主细胞，使得其表达第一和第二car。
[0669]
例如，载体可以是质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mrna。
[0670]
载体可能能够转染或转导t细胞。
[0671]
药物组合物
[0672]
本发明还涉及药物组合物，其包含多个本发明的第一方面的表达car的细胞，如t细胞或nk细胞。药物组合物可以另外包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一个或多个进一步的药物活性多肽和/或化合物。此类制剂可以例如为适用于静脉输注的形式。
[0673]
治疗方法
[0674]
本发明的细胞能够杀死癌细胞，如b细胞淋巴瘤细胞。表达car的细胞(如t细胞)可以从患者自身外周血(第1方)或在造血干细胞移植的背景下从供体外周血(第2方)或来自无关联供体的外周血(第3方)离体产生。或者，car t细胞可以衍生自可诱导祖细胞或胚胎祖细胞向t细胞的离体分化。在这些情况下，car t细胞通过多种手段之一引入编码car的dna或rna来生成，该手段包括用病毒载体转导、用dna或rna转染。
[0675]
本发明的细胞可能能够杀伤靶细胞，如癌细胞。靶细胞可通过cd19或cd22的表达识别。
[0676]
表5-淋巴样白血病上淋巴样抗原的表达
[0677][0678][0679]
摘录自campana et al.(immunophenotyping of leukemia.j.immunol.methods 243,59
–
75(2000))。cig μ-细胞质免疫球蛋白重链；sig μ-表面免疫球蛋白重链。
[0680]
不同类型b细胞白血病上通常研究的淋巴样抗原的表达密切反映b细胞个体发生的表达(参见图2)。
[0681]
本发明的t细胞可以用于治疗癌症，特别是b细胞恶性肿瘤。
[0682]
表达cd19或cd22的癌症的实例为b细胞淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；以及b细胞白血病。
[0683]
例如，b细胞淋巴瘤可以是弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤、边缘带淋巴瘤(mzl)或粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(malt)、小细胞淋巴细胞淋巴瘤(与慢性淋巴细胞性白血病重叠)、套细胞淋巴瘤(mcl)、伯基特淋巴瘤、原发性纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤(可能表现为华氏巨球蛋白血症)、结边缘带b细胞淋巴瘤(nmzl)、脾边缘带淋巴瘤(smzl)、血管内大b细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、t细胞/富含组织细胞的大b细胞淋巴瘤或原发性中枢神经系统淋巴瘤。
[0684]
b细胞白血病可以是急性淋巴细胞性白血病、b细胞慢性淋巴细胞性白血病、b细胞
原淋巴细胞性白血病、前体b淋巴母细胞性白血病或毛细胞白血病。
[0685]
b细胞白血病可以是急性淋巴细胞性白血病。
[0686]
用本发明的t细胞进行的治疗可能有助于防止标准方法通常发生的肿瘤细胞的逃逸或释放。
[0687]
本发明现在将通过实施例的方式进一步描述，其旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明，并且意图不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
[0688]
实施例1-cd19/cd22逻辑“or”门构建体和靶细胞的制备
[0689]
构建cd19
‘
or’cd22门，其中cd19 car携带tnfr家族胞内域(4-1bb)并且cd22 car携带共刺激胞内域(cd28)。每个car的结构在图6中给出。
[0690]
制备了若干cd19/cd22 or门构建体，如图11所示，并汇总在表6中。第一构建体包含cd19 car和cd22 car，如wo2016/102965所述(构建体1，图11)。第二构建体包含cd19 car和cd22 car，如图6所示(构建体2，图11)。制备3个进一步的构建体，其另外包括显性阴性shp2模块(dshp2)和显性阴性tgfβrii模块(dntgfβrii)(构建体3、4和5，图11)。通过在由2a肽分开的框架中克隆两种car实现共表达
[0691]
表6：cd19/cd22 car or门构建体的结构
[0692][0693]
实施例2-car胞内域的比较
[0694]
为了鉴定双重靶向cd19/cd22 car-t细胞的最佳胞内域，比较了表达构建体1、3、4或5之一的t细胞杀伤cd19 或cd22 supt1细胞的能力。此外，研究了在存在cd19 或cd22 supt1细胞的情况下表达构建体1、3、4或5之一的t细胞的增殖。
[0695]
将表达这些构建体之一的细胞以1:1的效应细胞：靶细胞(e:t)比与靶细胞(50,000个靶细胞)共培养72小时。
[0696]
结果显示于图12。虽然所有构建体均能够杀伤cd19 靶细胞，但这些结果表明，与构建体1、3和4相比，构建体5显示出改善的对cd22 靶细胞的杀伤。表达构建体5的细胞的增殖也得到改善。所有构建体的il-2和ifn-γ水平相似。
[0697]
实施例3-进一步体外分析
[0698]
针对以下靶细胞在体外测试表达构建体1、3或5之一的细胞：
[0699]
·
raji细胞(cd19/cd22阳性癌细胞系)；
[0700]
·
cd19敲除raji细胞；
[0701]
·
supt1高密度cd19；
[0702]
·
supt1低密度cd19；
[0703]
·
supt1高密度cd22；和
[0704]
·
supt1低密度cd22。
[0705]
将表达这些构建体之一的转导pbmc以1:1和1:10的效应细胞：靶细胞比与靶细胞共培养72小时。
[0706]
结果显示于图13。构建体5显示出改善的对低密度cd22靶细胞的杀伤。细胞因子生成水平相似。
[0707]
实施例4-模块测试
[0708]
dntgfβrii
[0709]
当细胞在tgf-β存在下培养时，用构建体5转导的细胞测试了dntgfβrii模块的作用。在rhtgf-β(10ng/ml)存在下，以1:8的e:t比与靶细胞共培养。在第7天读取读数。此外，对效应细胞进行ctv标记，用于增殖追踪。
[0710]
结果显示于图14。这些数据表明，在tgf-β存在下，dntgfβrii模块的存在提高了靶细胞杀伤。此外，在tgf-β存在下，dntgfβrii模块阻止了增殖的抑制。
[0711]
dshp2
[0712]
用构建体5转导的细胞测试了存在dshp2模块的作用。将pbmc用构建体5和pd1共转导，然后在表达pdl1的细胞存在下培养。如果dshp2有效，则其存在将阻止经由pd1/pdl1的信号传导。
[0713]
以1:1的e:t比与cd19 靶细胞，在有和没有pdl1的情况下建立共培养。在第6天读取读数。
[0714]
结果显示于图15。
[0715]
这些数据表明，dshp2的存在克服了pd1/pdl1相互作用。
[0716]
实施例5-再刺激测定
[0717]
使用再刺激测定研究构建体1、2和5的性能。
[0718]
简而言之，用cd19 supt1细胞或cd22 supt1细胞攻击表达构建体1、构建体2或构建体5的car-t细胞。每3至4天用新鲜靶细胞和新鲜培养基再刺激板，持续共9轮。结果显示于图16。
[0719]
表达构建体2和构建体5的car-t细胞在再刺激后均占细胞群的较大比例，表明靶标杀伤增加。特别地，当使用cd22阳性靶细胞时，表达构建体2和构建体5的细胞占细胞群的比例更大。因此，与构建体1相比，这些变体显示出增强的cd22阳性细胞的杀伤。
[0720]
实施例6-体外测试
[0721]
在ngs小鼠的nalm6肿瘤模型中研究了用构建体3和5转导的t细胞清除肿瘤细胞的能力。在所有情况下，小鼠在第-6天注射1x 106个靶细胞、nt细胞或pbs。
[0722]
作为初始步骤，鉴定表达构建体1的细胞的次优剂量以充当构建体5给药的起点。研究了0.3x 106、1x 106、5x 106和10x 106个细胞的剂量。结果显示于图17。0.3x 106剂量显示出与pbs对照队列相似的通量，表明无效的剂量。在10x 106剂量下达到清除，但小鼠在第13天因疑似移植物抗宿主病(gvh)而被处死。5x 106队列消除了靶细胞，而1x 106队列无法控制总通量。本次研究后，选择2.5x 106个细胞的剂量检测构建体3和5。
[0723]
相应地，向小鼠注射2.5x 106个表达构建体1、3或5的细胞。总通量显示于图18。在2.5x 106个细胞剂量下，表达构建体1的细胞不能控制靶细胞生长。构建体3和5均显示改善的体内功能。特别地，构建体5能够在所有小鼠中控制肿瘤细胞生长至第23天。与构建体1相比，通量中的差异是统计学显著的。
[0724]
此外，在已敲除cd19表达的nalm6小鼠(cd19ko)中测试构建体1、3或5。使用与上述野生型(wt)nalm6小鼠相同的条件，使用2.5x 106个细胞剂量。
[0725]
总通量显示于图19。在2.5x 106个细胞剂量下，表达构建体1的细胞不能控制靶细胞生长。构建体3和5均显示改善的功能。特别地，除1只小鼠外，构建体5能够在所有小鼠中控制肿瘤细胞生长至第27天。这些数据证实，即使在不存在cd19的情况下，表达构建体5的细胞也能够控制肿瘤负荷。
[0726]
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。本发明所描述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的，而不偏离本发明的范围和精神。尽管已经结合特定的优选实施方案对发明进行了描述，但应当理解的是，所要求保护的发明不应不适当地限于此类特定实施方案。事实上，对于分子生物学、细胞生物学或相关领域的技术人员来说，实施发明所描述模式的各种修改是显而易见的，意在在所附权利要求的范围内。